探討EGF基因多態(tài)性與食管癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性

孫濤 陸靜 顧海勇 尹俊 唐巍峰 陳鎖成

摘要：目的 研究表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）單核苷酸多態(tài)性與中國漢族人群食管癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系。方法 采用SNPscanTM高通量基因分型技術(shù)，分析380例食管癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（n=85）和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（n=270）EGF rs3756261 T>C和EGF rs11568835 G>A兩位點(diǎn)各基因型頻率，并計(jì)算各基因型的食管癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)及其95%可信區(qū)間。結(jié)果 EGF rs3756261 T>C基因型分布頻率在食管癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組之間沒有顯著差異（P=0.657）。在多因素Logistic回歸分析中，在調(diào)整了年齡、性別、吸煙及飲酒狀況后，沒有發(fā)現(xiàn)EGF rs3756261 CC基因型與食管癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)存在相關(guān)性（調(diào)整OR=1.10，95%CI=0.34-3.56，P=0.88）。在隱性模型中，調(diào)整了年齡，性別，吸煙及飲酒狀況后，沒有發(fā)現(xiàn)CC基因型的個(gè)體淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)發(fā)生明顯改變（調(diào)整OR=0.99，95%CI=0.31-3.14，P=0.98）。對EGF rs11568835 G>A多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行相同的單基因位點(diǎn)及l(fā)ogistic回歸分析，沒有發(fā)現(xiàn)其基因型分布頻率在組間存在差異，結(jié)果也未顯示其突變基因型與食管癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移易感性存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的關(guān)聯(lián)。結(jié)論 EGF rs3756261 T>C和EGF rs11568835 G>A基因多態(tài)性與食管癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移易感性之間無相關(guān)性。

關(guān)鍵詞：食管癌；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；表皮生長因子；單核苷酸多態(tài)性

高淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率是食管癌的特征之一[1]。Tachikawa等人[2]研究指出淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移模式能反映食管癌進(jìn)展程度且是影響患者總體生存期的決定性因素，因此可以作為判斷患者預(yù)后的重要標(biāo)志并指導(dǎo)個(gè)體化治療。目前的檢查技術(shù)很難發(fā)現(xiàn)小的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶，術(shù)前檢查未發(fā)現(xiàn)有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的食管癌患者中，超過40%的患者術(shù)后病理發(fā)現(xiàn)局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移為陽性[3]。因此我們需要一種新穎并且精確的方法來評估預(yù)測淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況。

表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）是一種重要的細(xì)胞分裂劑，可促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化、惡性轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移[4]，但正常生理水平量的EGF并不會導(dǎo)致消化道腫瘤的發(fā)生。人體EGF基礎(chǔ)分泌水平部分取決于遺傳因素，其基因的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）可引起EGF表達(dá)量的改變[5]，最終可能改變機(jī)體某些惡性腫瘤的易感性。已有文獻(xiàn)報(bào)道EGF的過表達(dá)在促進(jìn)食管癌局部浸潤和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的過程中扮演了重要的角色[6]。在EGF基因5'端非編碼區(qū)（5'-UTR）存在三個(gè)SNP位點(diǎn)：EGF rs444490A>G，EGF rs3756261 T>C和EGF rs11568835 G>A。目前對于EGF rs444490A>G的研究已較多較深入，但關(guān)于EGF rs3756261 T>C和EGF rs11568835 G>A的研究還比較少。因此，在本次實(shí)驗(yàn)中，我們研究了EGF rs3756261 T>C和EGF rs11568835 G>A基因多態(tài)性與食管癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移易感性之間是否存在關(guān)聯(lián)。

1 資料與方法

1.1一般資料 病例是自2008年10月～2009年11月從江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院胸外科、江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院胸外科收集的380例食管癌患者，均由纖維胃鏡及胃鏡病理診斷，且術(shù)后病理均確診為鱗狀細(xì)胞癌。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況由術(shù)中取淋巴結(jié)進(jìn)行病理檢查確定。其中有完整淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移信息的食管癌病例為355例，85例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，270例無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。所有患者均來自江蘇省鎮(zhèn)江市及周邊地區(qū)，為漢族人群。

1.2流行病學(xué)調(diào)查 對患者使用統(tǒng)一設(shè)計(jì)的生活狀況與健康調(diào)查表進(jìn)行調(diào)查，調(diào)查內(nèi)容包括：一般情況、吸煙史、飲酒史、身體狀況及疾病史、職業(yè)史和家族史、胃鏡及手術(shù)標(biāo)本病理以及食管癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況等。調(diào)查員分別為鎮(zhèn)江市第一人民醫(yī)院工作人員和江蘇大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院外科學(xué)專業(yè)的研究生，經(jīng)培訓(xùn)后使用統(tǒng)一調(diào)查表對研究對象進(jìn)行逐一訪問調(diào)查。

1.3實(shí)驗(yàn)方法 在獲得書面的知情同意書后，空腹采集2mL EDTA抗凝血，1h內(nèi)用4000r/min離心10min，分離白細(xì)胞層，采用Qiagen DNA提取試劑盒提取DNA?；蚍中筒捎蒙虾Ｌ礻簧锛夹g(shù)有限公司自主專利開發(fā)的2x48位SNPscanTM高通量SNP分型技術(shù)。基于5'端及3'端雙側(cè)探針連接反應(yīng)及多重?zé)晒釶CR擴(kuò)增、電泳分離從而獲取各SNP位點(diǎn)的基因型（見圖1）。實(shí)驗(yàn)條件根據(jù)制造商說明書來設(shè)定。首先，將100-200ng DNA樣本置于10μl含有1xDNA裂解緩沖液的反應(yīng)體系中98℃，5min變性裂解，然后將其與10μl含有2μl 10x連接酶緩沖液、0.5μl連接酶、1μl混合探針以及7.5μl Mili-Q水的連接預(yù)混液充分混合。連接反應(yīng)在ABI 2720熱循環(huán)儀內(nèi)完成，采用以下反應(yīng)條件：4個(gè)循環(huán)（94℃1min，58℃4hr），94℃2min，溫度控制在4℃并且立即加入20μl 2x終止緩沖液停止反應(yīng)體系。每一個(gè)連接產(chǎn)物都采用2x48位熒光PCR反應(yīng)擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為20μl混合液，其中包括了1xPCR預(yù)混液，1μlPCR引物和1μl連接產(chǎn)物。PCR反應(yīng)體系為：95℃2min；94℃20s 9個(gè)循環(huán)，65℃-0.5℃/40s循環(huán)，72℃1.5min；94℃20s 25個(gè)循環(huán)，57℃40s，72℃1.5min；60℃1hr；最后恒溫在4℃。PCR產(chǎn)物分離和檢測由毛細(xì)管電泳法在ABI3730XL測序儀上檢測，原始數(shù)據(jù)分析和基因型判別由GeneMapper4.0完成。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。食管癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組基本特征比較采用χ2檢驗(yàn)或/和t檢驗(yàn)。單因素和多因素Logistic回歸分析計(jì)算優(yōu)勢比（odds ratio，OR）及其95%可信區(qū)間（Confidence Interval，CI）表示EGF rs444490A>G，EGF rs3756261 T>C和EGF rs11568835 G>A基因多態(tài)性與食管癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移易感性的關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1食管癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組及無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的基本信息比較（表1）：380例食管癌患者中中355例（93.4%）有完整淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移信息。術(shù)后病理證實(shí)有局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者為85例（23.9%），270例（76.1%）患者無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組平均年齡（61.85±7.07）歲，72.9%為男性，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組平均年齡為（63.21±8.76）歲，69.3%為男性，結(jié)果提示兩組年齡與性別匹配良好，P值分別為0.147和0.518。吸煙及飲酒狀況在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組之間無明顯差異，P值分別為0.307和0.599。

2.2EGF基因多態(tài)性和食管癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移易感性的關(guān)系（表2）：EGF rs3756261 T>C三種基因型TT、TC、CC在食管癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的頻率分布分別為57.8%，37.3%，4.8%和63.1%，31.9%，5.0%，兩組基因型分布頻率未發(fā)現(xiàn)有明顯差異（P=0.657）。在多因素Logistic回歸分析中，以EGF rs3756261 TT基因型作為參照，在調(diào)整了年齡、性別、吸煙及飲酒狀況后，沒有發(fā)現(xiàn)EGF rs3756261 TC基因型（調(diào)整OR=1.34，95%CI=0.79-2.28，P=0.28）和CC基因型（調(diào)整OR=1.10，95%CI=0.34-3.56，P=0.88）與食管癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)存在相關(guān)性。在隱性模型中，相對于TT+TC基因型而言，EGF rs3756261 CC基因型與食管癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移易感性無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的相關(guān)性（OR=0.96，95%CI=0.31-3.04，P=0.95）；隱性模型中調(diào)整了年齡，性別，吸煙及飲酒狀況后，以EGF rs3756261 TT+TC基因型作為參照，CC基因型的個(gè)體淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)無明顯改變（調(diào)整OR=0.99，95%CI=0.31-3.14，P=0.98）。對EGF rs11568835 G>A多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行相同的單基因位點(diǎn)及l(fā)ogistic回歸分析，沒有發(fā)現(xiàn)其基因型分布頻率在組間存在差異，結(jié)果也未顯示其突變基因型與食管癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移易感性存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的關(guān)聯(lián)。

3 討論

轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致癌癥患者死亡的根本原因[7]，大約50%～60%的食管鱗癌患者死于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和/或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[8-9]。目前常用的CT、EUS和PET-CT等檢查對于診斷較小的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶準(zhǔn)確性較低，經(jīng)常出現(xiàn)假陰性結(jié)果，因此我們需要從分子水平深入的了解食管癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移機(jī)制，以期能盡早準(zhǔn)確的對患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移作出診斷，評估患者預(yù)后并制定合理的個(gè)體化治療方案。

Motoyama等人[3]指出食管鱗癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移模式可能和遺傳因素有關(guān)。他們在研究中發(fā)現(xiàn)C-反應(yīng)蛋白（C-reactive protein，CRP）SNP位點(diǎn)CRP 1846C>T基因多態(tài)性可能作為一個(gè)獨(dú)立因素影響著食管鱗癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的易感性。EGF是食管癌惡性進(jìn)展的一個(gè)促進(jìn)因子[10]。綜上，我們在實(shí)驗(yàn)中選擇了EGF rs3756261 T>C和EGF rs11568835 G>A這兩個(gè)基因多態(tài)性位點(diǎn)作為研究靶點(diǎn)，探討了兩者基因多態(tài)性與食管癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)之間的相關(guān)性。

我們的實(shí)驗(yàn)尚存在以下不足：①并未對組間EGF表達(dá)水平進(jìn)行比較，基因多態(tài)性是否會引起EGF表達(dá)水平的改變以及食管癌淋巴結(jié)易感性與EGF的異常表達(dá)是否存在直接關(guān)聯(lián)，在我們的實(shí)驗(yàn)中都缺乏相關(guān)數(shù)據(jù)說明，因此還需對基因多態(tài)性和蛋白進(jìn)行進(jìn)一步的功能學(xué)研究；②沒有進(jìn)行單倍型分析：因?yàn)閱位蛭稽c(diǎn)并不能完全代表該基因啟動子區(qū)的功能，單倍型分析對個(gè)體易感性有更準(zhǔn)確的評價(jià)；③研究結(jié)果為陰性可能是由于樣本量有限、統(tǒng)計(jì)學(xué)效能較低引起，因此我們還需對多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行多中心的大樣本研究。

綜上，EGF rs3756261 T>C和EGF rs11568835 G>A基因多態(tài)性與食管癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移易感性之間無相關(guān)性，我們還需進(jìn)行進(jìn)一步的功能學(xué)研究以及大樣本前瞻性研究。

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編輯/周蕓霏