佳寶苦瓜雜交種純度的SRAP鑒定

杜文麗 高山 陳中釤 許端祥 林碧英

摘 要：利用SRAP技術(shù)對佳寶苦瓜雜交種子進行純度鑒定。試驗結(jié)果表明，從153對SRAP引物中篩選出1對引物Me6-Em4，能同時擴增出F1代及其父母本的多態(tài)性條帶，且PCR擴增產(chǎn)物具有高度的穩(wěn)定性和重復(fù)性；利用該引物對48株佳寶苦瓜進行純度鑒定，其種子純度為97.9%，與其田間鑒定結(jié)果接近，表明利用SRAP分子標記可以快速、準確地鑒定佳寶苦瓜雜交種純度。

關(guān)鍵詞：苦瓜；佳寶；SRAP；純度鑒定

中圖分類號：S642.5 文獻標識碼：A 文章編號：1001-3547（2016）16-0034-03

苦瓜（Momordica charantia L.）屬葫蘆科（Cucurbitaceae）苦瓜屬一年生攀緣草本植物，原產(chǎn)印度和中國南方地區(qū)，現(xiàn)主要分布于熱帶和亞熱帶地區(qū)。苦瓜因其具備清爽解暑、營養(yǎng)豐富等特點，是我國長江以南地區(qū)夏季的重要蔬菜，屬于典型的藥食同源瓜類蔬菜[1]?？喙暇哂忻黠@的雜種優(yōu)勢，因此苦瓜商品化種植的品種多為F1代雜交種。在苦瓜雜交種人工制種過程中，因隔離不嚴等原因?；煊心副咀越幌捣N子，一旦大面積推廣，會給菜農(nóng)帶來不可估量的損失，因此要求苦瓜雜交種在上市銷售前必須經(jīng)過純度鑒定。近年來，苦瓜新品種更新速度較快，為保障后期良種的銷售和安全使用，對育成雜交新品種進行快速鑒定及品種保護具有重要意義。以往以形態(tài)指標鑒別為主要方法進行苦瓜雜交種的純度鑒定具有很大的局限性，隨著DNA 分子標記技術(shù)的廣泛應(yīng)用，使得從基因組水平上檢測苦瓜雜交種純度成為可能，已被越來越普遍地應(yīng)用于許多蔬菜品種的鑒別及指紋圖譜的構(gòu)建[2～4]。

苦瓜品種的分子鑒別也有報道[5～7]。自1974 年Grodzicker 創(chuàng)立RFLP 技術(shù)以來[8]，RAPD、SCAR、SSR、ISSR 等DNA 分子標記在動、植物和微生物等學(xué)科中得到廣泛應(yīng)用，并取得令人矚目的進展，其中的SRAP （Sequence related amplified polymorphism）

是一種新型的分子標記技術(shù)，具有操作簡單、穩(wěn)定、多態(tài)性高等獨特的優(yōu)點，適用于植物遺傳圖譜構(gòu)建、基因克隆、遺傳多樣性檢測等方面的研究[9]。

以雜交種佳寶苦瓜及其親本為材料，采用SRAP 分子標記技術(shù)，通過前期引物篩選及反復(fù)驗證建立佳寶苦瓜雜交種純度鑒定技術(shù)體系，有效地獲得了該雜交種的純度鑒定結(jié)果，為其純度鑒定和該品種產(chǎn)權(quán)保護提供了科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

佳寶苦瓜雜交種及親本由福州市蔬菜科學(xué)研究所提供，其母本08311-4是由臺灣碧秀苦瓜經(jīng)過多代自交純化而成的自交系，父本0853-2則是由廣東青秀苦瓜經(jīng)多代純化而成的自交系。佳寶苦瓜植株生長勢強，連續(xù)結(jié)瓜能力強，早熟，第一雌花節(jié)位10～12節(jié)，商品瓜棒狀，瓜長30～35 cm，橫徑6～

7 cm，肉厚1.1 cm，瓜色綠，油亮有光澤，圓瘤與短縱瘤相間，單瓜質(zhì)量500～600 g，抗病性強，豐產(chǎn)。

1.2 試驗方法

①基因組DNA的提取方法 種子用55℃的溫湯浸泡15 min，再放在28℃左右的恒溫箱催芽，待胚根長至1 cm 左右時轉(zhuǎn)入穴盤育苗，待幼苗長到2 片真葉時隨機抽取佳寶苦瓜及其父母本各20株，剪取剛展開的健康嫩葉，用液氮研磨，采用CTAB法進行總DNA提取，獲得的DNA經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳進行濃度和純度鑒定，并稀釋到30 ng/μL左右，于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

②SRAP多態(tài)性引物設(shè)計與篩選 根據(jù)SRAP引物設(shè)計原理合成26條引物，隨機組合成153對SRAP引物。使用全部153對SRAP引物進行PCR擴增，分析并篩選出現(xiàn)差異條帶的引物。對篩選到的出現(xiàn)特異條帶的SRAP引物重復(fù)進行多次驗證，直至獲得穩(wěn)定重復(fù)差異條帶的SRAP 引物。

③PCR擴增 SRAP-PCR反應(yīng)體系總體積為20 μL：Taq DNA酶（5 U/μL）0.2 μL，10×PCR buffer

2 μL，dNTPs （10 mmol/L） 0.4 μL，DNA模板0.5 μL，10 μmol/L 的上下游引物各4 μL，加ddH2O補齊至20 μL。SRAP-PCR擴增反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性

3 min；94℃ 1 min，35℃ 1 min，72℃ 1 min，循環(huán)5次；94℃ 1 min，50℃ 1 min，72℃ 1 min，循環(huán)35次；72℃延伸10 min。將PCR 擴增產(chǎn)物放置于4℃冰箱保存或直接用1%瓊脂糖凝膠電泳快速檢測。

④田間形態(tài)鑒定 于2015年3～6月在福州市蔬菜科學(xué)研究所試驗地進行，3月7日播種育苗，3月28日定植，隨機抽取150株植株掛牌編號，5月下旬在果實成熟時對果形、果色、棱、瘤等性狀進行調(diào)查，統(tǒng)計雜種純度。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取結(jié)果分析

經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的濃度和質(zhì)量，結(jié)果表明，親本及佳寶F1代3種苦瓜DNA提取的含量均較高，且總DNA中多酚類化合物及多糖等雜質(zhì)去除的較為干凈，DNA完整性也好，純度高，適于下一步SRAP多態(tài)性分析（圖1）。

2.2 特征引物的篩選

按照SRAP引物原則設(shè)計引物，選用上海翰宇生物有限責任公司合成的SRAP的9個上游引物（Me1～Me9）和17個下游引物（Em1～Em17）組成153對引物組合對材料進行擴增，分析差異條帶，篩選出現(xiàn)差異條帶的引物。試驗結(jié)果顯示，僅有1對引物Me6（5'-TGAGTCCAAACCGGTAG-3'）-Em4（5'- GACTGCGTACGAATTTGA-3'）擴增的雜種譜與母本有差異。對篩選到出現(xiàn)差異的Me6-Em4引物進行多次重復(fù)驗證（重復(fù)提取DNA，以其為模板進行5次SRAP重復(fù)試驗），結(jié)果能同時擴增出F1代及其父母本的多態(tài)性條帶，其擴增產(chǎn)物具有高度的穩(wěn)定性和重復(fù)性（圖2）。

2.3 雜種純度的鑒定

隨機挑選若干粒佳寶F1代種子，按上述方法培育幼苗。隨機抽取48個單株編號提取DNA，選用Me6-Em4特征引物進行佳寶苦瓜SRAP的分子純度鑒定。

檢測結(jié)果顯示（圖3），Me6-Em4擴增出雙親的特異條帶，可確定為雜交單株，只有1株單株未擴增出父本的特異條帶，可能是母本自交而來，為假雜種。因此，分子標記鑒定結(jié)果表明，該48株單株有真雜種47株，雜交種的純度為97.9%。

2.4 雜交種田間鑒定

盛果期選取同批次播種的48株標記單株進行田間鑒定，鑒定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，選取的48株農(nóng)藝性狀均符合佳寶苦瓜的性狀特征，可以判斷為真雜種。因此，田間鑒定結(jié)果表明，這48株單株的純度為100%。雜交純度分子鑒定與生物學(xué)性狀田間鑒定結(jié)果接近，表明本批次的純度達到國家用種標準，顯示了在制種過程中良好的田間管理水平。

3 結(jié)論與討論

雜交種子的純度鑒定是農(nóng)作物種子質(zhì)量檢驗的一項重要內(nèi)容。由于SRAP標記具有豐富的多態(tài)性、操作簡便、穩(wěn)定等優(yōu)點，已被應(yīng)用于多種農(nóng)作物的種子純度鑒定。本試驗篩選出1對共顯性SRAP標記Me6-Em4，檢測佳寶種子純度為97.9%，與其田間農(nóng)藝性狀的鑒定結(jié)果100%接近，并且SRAP標記鑒定的結(jié)果更為客觀、可信。用SRAP標記鑒定替代田間鑒定，能夠克服田間種植鑒定周期長、易受環(huán)境影響等缺點。結(jié)果也表明，要完全通過分子手段鑒定苦瓜雜交種純度的達到對新品種保護的目的，還需要設(shè)計足夠多的引物，才有可能獲得有效的多態(tài)性引物，從而建立苦瓜雜交種種子的分子水平質(zhì)量監(jiān)控系統(tǒng)。

參考文獻

[1] 張偉光，張玉燦，張少平，等.苦瓜栽培育種與貯運加工[M].北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，2014.

[2] 趙秀娟，宋建文，胡開林.苦瓜種質(zhì)遺傳多樣性的SRAP標記分析[J].植物遺傳資源學(xué)報，2013，14（1）：78-84.

[3] 嚴慧玲，閆樹成，楊慧民，等.利用SRAP分子標記技術(shù)鑒定大白菜種子純度[J].熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，31（6）：50-52.

[4] 李麗，鄭曉鷹，柳李旺.用SRAP標記分析黃瓜品種遺傳多樣性及鑒定品種[J].分子植物育種，2006，4（5）：702-708.

[5] 張少平，張玉燦，張偉光，等.RAPD及SRAP兩種分子標記技術(shù)對苦瓜雜交種純度的鑒定分析[J].生物技術(shù)進展，2014（4）：286-291.

[6] 林琿，李永平，朱海生，等.應(yīng)用RAPD標記鑒定苦瓜雜種純度[J].福建農(nóng)業(yè)學(xué)報，2011，26（6）：977-980.

[7] 許端祥，高山，林碧英，等.佳美苦瓜純度的SRAP鑒定[J]. 長江蔬菜，2011（18）：16-17.

[8] Guo D L， Zhang J P， Xue Y M， et al. Isolation and characterization of 10 SSR markers of Momordica charantia （Cucurbitaceae）[J]. American Journal of Botany， 2012， 99（5）： 182-183.

[9] 海燕，何寧，康明輝，等.新型分子標記SRAP及其應(yīng)用[J]. 河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006（9）：9-12.

Abstract： In this study， SRAP markers technique was used for identifying the purity of Jiabao bitter gourd hybrid seeds. The results showed that only a pair of primers （Me6-Em4） was screened out from 153 pairs of SRAP primers， which could amplify the characteristic polymorphic bands of F1 generation and its parents， and the PCR products possessed high

stability and repeatability. Using the pair of primers to detect the purity of 48 individuals of Jiabao bitter gourd， the results showed that the purity was 97.9% for hybrid seeds of Jiabao bitter gourd， which was very close to the field morphological test， indicating that SRAP markers could be used to identify the hybrid purity of Jiabao bitter gourd rapidly and

accurately.

Key words： Bitter gourd； Jiabao； SRAP； Purity identification