兩種酶法試劑盒檢測糖化白蛋白的方法學(xué)比對分析

黃迪 尚陳宇 萬澤民 王云秀 柯培鋒 黃憲章

【摘 要】 目的 Lucica-L和MAKER試劑盒檢測糖化白蛋白的一致性分析。方法 采用巢式抽樣法抽取廣州地區(qū)18～60周歲城鄉(xiāng)居民共3004例。同時(shí)使用Lucica GA-L試劑盒和MAKER GA試劑盒檢測入選志愿者的血清白蛋白（ALB）和糖化白蛋白（GA）濃度，采用配對t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析試驗(yàn)結(jié)果。結(jié)果 白蛋白和糖化白蛋白濃度值在兩種廠家試劑間的檢測結(jié)果均有顯著性差異（P<0.05）。兩種試劑GA報(bào)告值相關(guān)性較好（r2=0.962），但差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。偏倚為2.6%。結(jié)論 用于白蛋白和糖化白蛋白檢測的MAKER試劑盒GA結(jié)果高于Lucica-L試劑盒，但差異臨床可接受。

【關(guān)鍵詞】 糖化白蛋白 比對分析

【Abstract】 Objective To evaluate the consistence between the Lucica-L and MAKER assay kits in analyzing glycated albumin. Methods 18～60 years old residents with the amount of 3004 was collected using the Nested sampling method in Guangzhou. The ALB and GA of the volunteers were assayed using Lucica-L kits and MAKER GA kits at the same time. The results were applied comparative t-test to perform statistical analysis. Results The difference of the concentrations of ALB and GA were Significant between the two analyzing kits（P<0.05）. The final results of the two kits showed excellent correlation（r2=0.962）， but the difference was still statistical significance（P<0.05）. The bias was 2.6%. Conclusion The GA results assaying by MAKER kit were higher than Lucica-L assay kit. But the bias has clinical acceptability.

【Key words】 glycated albumin；comparison analysis

糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）是以持續(xù)高血糖為基本生化特征的一種急、慢性全身性代謝性疾病。糖尿病人血糖過高引起的一系列并發(fā)癥是其致死的主要原因[1]。而血糖控制是糖尿病患者治療的主要手段，因此選擇準(zhǔn)確的血糖監(jiān)測指標(biāo)尤為重要。糖化白蛋白（GA）可作為糖尿病人短期血糖控制的有效指標(biāo)[2]。

GA的常規(guī)檢測尚無標(biāo)準(zhǔn)參考方法。既往GA的的測定方法包括親和色譜法、離子交換高效液相色譜法、比色法和免疫化學(xué)法。但這些方法都存在精確度差、檢測時(shí)間長等缺點(diǎn)[3]。目前主流方法是采用酮胺氧化酶（KAOD）的酶學(xué)檢測法[4]，該方法簡便快速、成本低廉且可減少其它蛋白對檢測結(jié)果的影響。國內(nèi)、外使用較多的是日本旭化成制藥株式會(huì)社生產(chǎn)的Lucica-L GA檢測試劑盒。該試劑盒因其使用廣泛，準(zhǔn)確度、精密度、溯源性以及線性等分析性能較好，已屬成熟產(chǎn)品。本實(shí)驗(yàn)使用Lucica GA-L試劑盒和四川邁克生物科技公司生產(chǎn)的MAKER GA試劑盒對廣州地區(qū)成年人群GA水平進(jìn)行大樣本量同步檢測，比對分析兩種試劑盒的檢測一致性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

采用巢式抽樣法在2014年4月至11月抽取廣州市越秀、荔灣、白云、天河等城區(qū)居民及所轄農(nóng)村居民中18～60周歲常住人群3021例。經(jīng)初步篩查和離群值排除，獲得合格樣本數(shù)3004例。以Lucica-L試劑盒所測白蛋白濃度值為標(biāo)準(zhǔn)，將研究對象分為低（7例）、正常（2482例）、高（515例）3組。實(shí)驗(yàn)經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，研究對象均簽署知情同意書。

1.2 試驗(yàn)方法

志愿者在空腹?fàn)顟B(tài)下由經(jīng)驗(yàn)豐富的臨床醫(yī)護(hù)人員抽取無抗凝靜脈血3～5mL，分離血清后密封、冷凍保存。Lucica-L和MAKER試劑均按廠家說明書在羅氏ROCHE MODULAR PPI全自動(dòng)生化分析儀上調(diào)試好。對兩套原裝試劑分別進(jìn)行校準(zhǔn)和校準(zhǔn)確認(rèn)，同時(shí)檢測各自專用質(zhì)控品，確認(rèn)控制值在控。根據(jù)最新EP-9a文件要求[5]，嚴(yán)格按標(biāo)準(zhǔn)比對程序進(jìn)行數(shù)據(jù)整理與分析。每天取200～300份志愿者血清，每份血清樣本均分為2份，分別使用Lucica-L和MAKER試劑盒檢測ALB和GA并記錄結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以x±s表示。組間比較采用Kruskal-Wallis非參數(shù)秩和檢驗(yàn)，兩種試劑試驗(yàn)結(jié)果間均值比較采用配對t檢驗(yàn)，相關(guān)性采用Pearson相關(guān)性分析。

2 結(jié)果

2.1 人群特征描述

3001例研究對象，年齡18～60周歲，平均40歲。其中男性1509人，女性1494人，男女比例與廣州市2014年人群分布無差異（P<0.05）。抽樣人群未排除任何基礎(chǔ)疾病、感染、家族史、妊娠狀態(tài)等。

2.2 GA、ALB濃度檢測結(jié)果

排除性別、年齡等因素，兩種試劑GA濃度值在以ALB分組的3組中，組間差異兩兩比較，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。每組Lucica-L與MAKER之間GA、ALB差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均<0.05），見表1。低值組GA和ALB結(jié)果Lucica大于MAKER，正常組和高值組GA結(jié)果MAKER明顯大于Lucica，但ALB結(jié)果MAKER偏低。

2.3 Lucica-L與MAKER試劑GA報(bào)告值的相關(guān)性及線性

以GA/ALB帶入公式得出糖化白蛋白報(bào)告值。三個(gè)組Lucica-L與MAKER之間均呈正相關(guān)，且高度相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r2均>0.95，見圖1。所有樣本報(bào)告值匯總比較，兩種試劑間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），報(bào)告值匯總統(tǒng)計(jì)見表2。

2.4 報(bào)告值比對分析

以Lucica-L實(shí)驗(yàn)結(jié)果為x，以MAKER實(shí)驗(yàn)結(jié)果為y，計(jì)算線性回歸方程，y=1.04x-0.22。將國際較為認(rèn)可的診斷切點(diǎn)GA報(bào)告值（16%）代入回歸方程（見圖1之4）。計(jì)算兩者之間的系統(tǒng)誤差（SE）[5]，SE=|Yc-Xc|=0.42，SE%=SE/Xc×100%=2.6%。參考ALB生物學(xué)變異（3.4%），本次SE%

3 討論

目前臨床對糖尿病人血糖監(jiān)控的指標(biāo)主要有空腹血糖（FPG）、2小時(shí)血糖（2hPG）、糖化血清蛋白（GSP）以及糖化血紅蛋白（HbA1c）。FPG和2hPG檢測即時(shí)血糖水平，波動(dòng)大且重復(fù)性低。HbA1c反映患者2-3個(gè)月之前的平均血糖濃度，時(shí)效性不佳。GSP是所有糖基化終末產(chǎn)物的統(tǒng)稱，反映患者2-3周之前的血糖控制情況。

葡萄糖能與血清中多種長半衰期蛋白質(zhì)（白蛋白、血紅蛋白、胰島素、免疫球蛋白等）成分發(fā)生糖化反應(yīng)，該反應(yīng)是一種緩慢的非酶促結(jié)合反應(yīng)，又稱為美拉德反應(yīng)（Maillard reaction）。整個(gè)反應(yīng)的產(chǎn)物稱為糖化終末產(chǎn)物（AGE）[6]，AGE統(tǒng)稱糖化血清蛋白（GSP）。GSP產(chǎn)物中90%以上是葡糖糖與血清白蛋白結(jié)合形成的糖化白蛋白（GA）。目前大多數(shù)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室檢測的糖化血清蛋白都是GSP，對于腎病綜合征（nephrotic syndlome，NS）、肝硬化、異常蛋白血癥或急性時(shí)相反應(yīng)之后的患者，血清白蛋白<30g/L或尿中蛋白質(zhì)濃度>l.0g/L時(shí)，GSP的結(jié)果不可靠。中度溶血、膽紅素和維生素C會(huì)干擾測定。尤其低蛋白血癥和白蛋白轉(zhuǎn)化異常的患者，由于血清中非特異性還原物質(zhì)也可以發(fā)生此反應(yīng)，加之不同蛋白組分的非酶糖化反應(yīng)率不同，導(dǎo)致GSP檢測法特異性較差[6]。相反GA受血液中蛋白濃度、膽紅素、乳糜和低分子物質(zhì)等的影響較小[7]。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)該著重發(fā)展GA檢測。

本次試驗(yàn)依托本實(shí)驗(yàn)室的大規(guī)模參考范圍調(diào)查課題，對比研究了進(jìn)口和國產(chǎn)試劑盒中具有代表性的兩個(gè)廠家所生產(chǎn)的常規(guī)檢測試劑檢測GA的差異性。由于未排除任何基礎(chǔ)疾病以及個(gè)體差異等，且相關(guān)系數(shù)r2均>0.95[5]，說明分析物含量分布范圍合適，直線回歸統(tǒng)計(jì)的斜率和截距可靠，可認(rèn)為此次大樣本的抽樣結(jié)果基本能夠代表臨床實(shí)驗(yàn)室在普通人群中的檢測能力。通過試驗(yàn)數(shù)據(jù)可看出，在一般人群中，GA濃度隨著ALB濃度的升高而升高，故GA的臨床報(bào)告最好應(yīng)以GA/ALB計(jì)算比值，再根據(jù)不同廠家各自調(diào)整系數(shù)來表示，可排除因個(gè)體ALB差異而引起的假陽性或假陰性。這個(gè)結(jié)論也與Yoshiuchi K[8]在研究中的結(jié)果一致。從試驗(yàn)中可以看出，單獨(dú)對比GA和ALB濃度值，結(jié)果差異較大。尤其是正常組和高值組，GA和ALB濃度檢測值呈現(xiàn)反向差異，平均值MAKER高于Lucica-L，而ALB檢測值MAKER均低于Lucica-L，GA/ALB計(jì)算值MAKER亦低于Lucica-L，差異較明顯（P均<0.01）。兩種試劑相關(guān)性亦不佳。但經(jīng)過廠家說明書給出的校準(zhǔn)公式的校正，兩種試劑盒的最終報(bào)告值明顯改善。三組樣本最終結(jié)果相關(guān)性均較好，r2均>0.95，呈顯著直線正相關(guān)。但配對t檢驗(yàn)仍存在顯著差異（P<0.01），可認(rèn)為MAKER檢測GA與Lucica-L相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，MAKER檢測GA偏高。因GA檢測項(xiàng)目未在國內(nèi)廣泛開展，其允許總誤差尚無國家標(biāo)準(zhǔn)。參考ALB生物學(xué)變異[9]，本次SE%

本次試驗(yàn)僅對試劑盒做出簡單比對，初步分析國產(chǎn)GA試劑的可用性，以為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。接下來還將對本地區(qū)正常人群GA參考范圍、特定疾病GA檢測差異以及多中心GA檢測并將其納入DM診斷標(biāo)準(zhǔn)的可行性等做進(jìn)一步深入研究。

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作者簡介：黃迪，男，主管技師，主要從事臨床生化檢驗(yàn)研究。