用毛細管電泳測定牦牛乳中的乳清酸含量

于淼　任亮　蔣忠榮　黃林　金素鈺　劉曦　鄭玉才

摘要：建立了毛細管電泳（CE）測定乳中乳清酸含量的方法。用三氯乙酸提取昌臺牦牛（Bos grunniens）和兩種品牌液態(tài)乳脫脂乳中的乳清酸，然后用毛細管電泳進行分離和定量。對試驗條件（緩沖液濃度、pH等）進行了優(yōu)化，乳清酸色譜保留時間為15min左右，最小檢測限為0，02mg/100mL，在檢測范圍內線性關系良好（R²=0.999），回收率為99.66%。試驗共測定了12頭處于泌乳中期的昌臺牦牛乳中的乳清酸含量，平均含量為（5.2±2.4）mg/100mL，個體間含量差異較大。兩種商業(yè)品牌的液態(tài)乳中乳清酸的含量平均為7.4mg/100mL，其中冷藏乳中乳清酸含量均高于常溫乳，牦牛乳中的乳清酸含量低于商業(yè)液態(tài)乳。

關鍵詞：牦牛（Bos grunniens）；乳清酸；乳；毛細管電泳

中圖分類號：S823.8⁺5 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）09-2344-03

牦牛（Bos grunniens）是青藏高原及毗鄰高寒地區(qū)特有的牛種，是當?shù)啬撩裰匾纳钯Y料與創(chuàng)造財富的生產資料，也是青藏高原畜牧業(yè)的主體。牦牛乳的營養(yǎng)價值高于荷斯坦牛乳，其乳蛋白、脂肪、乳糖及干物質含量均高于其他牛種，是加工奶油制品的最優(yōu)原料之一。牦牛乳中蛋白質平均含量約為5.24%，明顯高于普通牛乳（3.40%）。此外，牦牛乳含有18種氨基酸，其中包括8種必需氨基酸，總含量比普通牛乳高15%：鈣含量比普通牛乳高15%。目前對牦牛乳的研究主要涉及常規(guī)營養(yǎng)成分，而對微量組分的研究較少。進一步挖掘牦牛乳的優(yōu)質特性，對于合理開發(fā)利用牦牛乳資源具有實際價值，也有利于青藏高原少數(shù)民族地區(qū)的畜牧業(yè)發(fā)展。

乳清酸（Orotic acid）是首先在牛奶中發(fā)現(xiàn)的核酸代謝物，后又發(fā)現(xiàn)存在于各種哺乳動物的乳汁中及多種變異微生物的嘧啶核苷酸的合成途徑中。有研究表明，乳清酸會誘導脂肪肝的產生，并且乳牛的某些遺傳性疾病會表現(xiàn)為乳中的乳清酸累積，因此測定乳中乳清酸含量對鑒定乳的品質具有重要意義。國內外現(xiàn)采用多種方法測定乳清酸，常見的有高效液相色譜法（HPLC）、色譜一質譜聯(lián)用法、電化學分析法。毛細管電泳技術是一種發(fā)展十分迅速的色譜分離定量技術，具有快速、靈敏度高、進樣量少等優(yōu)勢，應用范圍廣。有關牦牛乳中乳清酸含量的分析尚未見報道，本試驗用毛細管電泳法對牦牛乳中的乳清酸的含量進行了測定，以期為牦牛乳的品質分析提供方法。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集和處理

夏季采集四川省甘孜州昌臺牦牛的乳樣，12頭處于泌乳中期的昌臺牦牛采用全天然放牧方式飼養(yǎng)，于早晨手工擠奶。全乳經(jīng)2000r/min離心20min，抽取下層脫脂乳，80℃保存?zhèn)溆?。本試驗還在超市中購買了兩種品牌的液態(tài)全乳，每種品牌中冷藏奶（2～6℃貯存）和常溫奶各選一種，處理方法同上。

乳中的乳清酸參照Saidi等的方法提取待測。

1.2 主要儀器與試劑

P/ACEMD0毛細管電泳儀（美國Beckman公司）；Z323K高速冷凍離心機（德國Hennle公司）；DELEA320pH計（瑞士MettlerToledo公司）：SB-5200DTD超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司）：WPABiowaveⅡ分光光度計（英國Biochrom公司）等。毛細管全長57cm，有效長度50cm，內徑75μm，運行時柱溫控制為25℃。

1.3 試驗方法

1.3.1 標準品的配制 準確稱取乳清酸標準品（Sigma公司）50mg，加適量1mol/L的KOH助溶，加去離子水并用三氯乙酸調節(jié)標準品溶液oH至2.75（與樣品oH相接近）后，加去離子水定容到50mL。用三氯乙酸調節(jié)去離子水pH至2.75，用此酸水將標準品稀釋為7個濃度（0.2-8.0mg/100mL），用于制作標準曲線。

1.3.2 分析條件 試驗所有毛細管柱為Beckman非涂層毛細管（57cm×50cm，75μm）。運行緩沖液為50mmol/LKH₂PO₄與50mmol/LNa₂B₄O₇等體積混勻的硼酸一磷酸緩沖液，pH6.5，0.45μm水性膜過濾，4℃保存?zhèn)溆谩?shù)設定：柱溫25℃，檢測波長280nm。毛細管柱在每次進樣前分別用超純水和0.1mol/LNaOH沖洗10min，再用運行緩沖液沖洗5min。更換樣品前，應在20Psi下用0.1mol/LNaOH沖洗5min。超純水沖洗5min，運行緩沖液沖洗10min。進樣時間為5s。0.5Psi。運行緩沖液20kV洗脫20min后進行分離定量測定。

1.3.3 加標回收率測定 向已知乳清酸含量的樣品中加入相同量的標準品，再測定乳清酸含量。根據(jù)公式計算回收率：加標回收率=（加標試樣測定值-試樣測定值）/加標量×100%。

1.3.4 精密度測定 重復6次測定乳清酸標準品溶液（4mg/100mL）中乳清酸含量，以峰面積計算精密度。

2 結果與分析

2.1 毛細管電泳測定乳清酸方法的建立

試驗分析顯示，毛細管電泳測定乳清酸方法中，運行緩沖液的pH對樣品的分離度有很大影響。如以pH5.5的磷酸一硼酸緩沖液為運行緩沖液時，分離峰有拖尾等現(xiàn)象。經(jīng)多次優(yōu)化，確定運行緩沖液為50mmol/L的磷酸一硼酸緩沖液，pH6.5。

由圖1可見，優(yōu)化電泳條件后可獲得較好的乳清酸電泳圖譜，峰形對稱、無拖尾現(xiàn)象。牦牛乳中乳清酸的保留時間為（15.9±0.6）min，商品液態(tài)奶乳清酸的保留時間為（13.7±0.1）min，圖2為某一牦牛乳中乳清酸毛細管電泳情況。

在試驗測定范圍內，乳清酸標準品濃度與峰面積呈良好的線性關系（圖3），以峰面積計算精密度為1.8%，最小檢測值為0.02mg/100mL。試驗測定的加標回收率平均值為（99.66±2.89）%。

2.2 牦牛乳和商業(yè)奶中乳清酸含量

本研究顯示。昌臺牦牛乳（n=12）中乳清酸平均含量為（5.2±2.4）mg/100mL，范圍在2.2～9.9mg/100mL之間，個體間含量差異較大。在商業(yè)奶中，兩種冷藏奶平均含量為8.2mg/100mL，兩種常溫奶平均含量為6.6mg/100mL。冷藏奶中的乳清酸含量均稍高于常溫奶。昌臺牦牛乳中的乳清酸平均含量均低于商業(yè)奶。

3 討論

乳清酸是哺乳動物從頭合成尿苷及其衍生物的重要中間物。乳清酸可能是脂肪肝的化學誘導因素之一，但其機制還不確定。乳清酸在乳中的含量并不高，但患有亞臨床乳腺炎的奶牛，乳中乳清酸含量顯著增高。另外，患尿苷酸核酶缺乏癥（DUMPS）的奶牛，乳中有乳清酸累積現(xiàn)象。因此，檢測乳中的乳清酸含量對于監(jiān)測乳的品質和篩查奶牛是否患有DUMPS具有實際意義?，F(xiàn)普遍認為乳清酸可能會影響脂肪酸氧化，促進脂肪合成，減少脂肪在肝中的運輸。人們日常飲食中乳清酸基本來自乳和乳制品，乳清酸的攝取量并不高，若另攝取一些乳清酸含量高的營養(yǎng)保健品，則可能對人體產生負面影響。

乳清酸含量的分析方法較多，常見的有色譜一質譜分析法、HPLC法、電化學分析法等。色譜一質譜法多用于測定尿液與血漿中乳清酸含量，乳清酸與重氮結合后便于分離，適合GC/MS測定。該方法測定健康人尿中乳清酸含量與毛細管電泳法結果一致，但分離測定方法上較為繁瑣。HPLC法因具有靈敏度高、重現(xiàn)性好、操作簡單等特點而應用廣泛。Tonno等用HPLC法測定乳制品中11種有機酸的含量，其中測定乳清酸含量的精密度為1.85%，最小檢測限為0.6mg/100mL。HPLC法測定不同物質需用不同的色譜柱。測定乳清酸含量用反相色譜柱，而毛細管電泳法只需要徹底清洗毛細管即可測定很多物質，降低了測定成本。王福民等用極譜法測定了牛奶中乳清酸的含量，檢測限為0.015mg/100mL。此方法需25mL以上的樣品，而毛細管電泳法可實現(xiàn)微量測定。牦牛乳中的乳清酸含量測定尚未見報道，本研究建立了毛細管電泳測定牦牛乳中乳清酸含量的方法，線性關系好，檢測限低（0.02mg/100mL）。適合于微量乳樣中乳清酸的定量。檢測成本低、方法簡便?？捎糜陉笈Ｈ橹腥榍逅岷康拇笠?guī)模監(jiān)測。

牛乳中代謝物含量受地理分布、飼料和遺傳背景等的影響，這些因素可進一步影響乳的營養(yǎng)特性和加工工藝。牦牛終年采食天然牧草，不使用飼料添加劑，是優(yōu)質的乳資源。本研究測定牦牛乳中乳清酸平均含量為（5.2±2.4）mg/100mL。商業(yè)奶乳清酸平均含量為7.4mg/100mL。不同的研究顯示，荷斯坦牛乳中乳清酸含量范圍為6.7-8.1mg/100mL。牦牛乳中蛋白質、脂肪和礦物質等營養(yǎng)成分含量高，而具有相對較低的乳清酸含量，這一組成特性對人體健康是有益的。本研究結果進一步揭示出牦牛乳的優(yōu)良品質特性。