夏枯草總黃酮的抗氧化活性研究

曹小燕　楊海濤

摘要：采用分光光度法研究了夏枯草（Prunella vulgaris L.）總黃酮的抗氧化活-性。結(jié)果表明，在濃度為0.12mg/mL時(shí)，對(duì)羥基自由基（·OH）清除率達(dá)到96%；在濃度為0.004mg/mL時(shí)，對(duì)ABTS自由基正離子（ABTS⁺·）的清除率達(dá)到99%；在濃度為0.01mg/mL時(shí)，對(duì)超氧陰離子（0₂^-·）的清除率達(dá)到92%：夏枯草總黃酮也具有較強(qiáng)的還原能力，證明夏枯草具有良好的還原能力和自由基清除活性。

關(guān)鍵詞：夏枯草（Prunella vulgaris L.）；總黃酮；抗氧化；清除

中圖分類號(hào)：R282 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2016）09-2316-03

夏枯草（Prunella vulgaris L.）為唇形科夏枯草屬植物，該屬植物全球約有15種，廣泛分布于江蘇、河南、湖北、湖南、陜西等地。夏枯草中富含苷類物質(zhì)（三萜皂甙、蕓香甙、金絲桃甙等）、糖類、黃酮類、揮發(fā)油、有機(jī)酸、香豆素、生物堿、咖啡酸等活性成分[，具有抗炎、降壓及抗腫瘤等多種藥理學(xué)活性。何力認(rèn)為夏枯草對(duì)特異性免疫表現(xiàn)出非常強(qiáng)的抑制作用，其抗炎效果與腎上腺皮質(zhì)中的糖皮質(zhì)激素合成、分泌的增強(qiáng)密切相關(guān)。從夏枯草中提取出來(lái)的2α-羥基熊果酸、熊果酸、2α，3α-二羥基烏蘇12烯-28酸、樺木酸具有明顯的抗炎和抗過(guò)敏活性。夏枯草總?cè)疲═FP）可有效抑制RAW264.7細(xì)胞分泌的炎癥因子，具有一定的抗炎作用。楊力等研究證明，夏枯草的乙酸乙酯提取物對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌等均具有抑菌效果。夏枯草的丁醇、乙醇或氯仿提取物可以有效地舒張血管，降低血壓的功效。夏枯草的75%乙醇提取物還可以升高NO含量，降低ET、AngⅡ含量，從而發(fā)揮其對(duì)SHIR大鼠的降壓作用。研究表明，夏枯草總皂苷提取物可以使麻醉大鼠的舒張壓及收縮壓降低，臨床上發(fā)現(xiàn)夏枯草湯劑治療高血壓的效果顯著，比牛黃降壓丸的效果更好。體外試驗(yàn)證明，夏枯草水煎醇沉粗提物對(duì)RaiiB淋巴瘤白血病細(xì)胞、JurkatT淋巴瘤白血病細(xì)胞生長(zhǎng)均有明顯的抑制效果。鄭學(xué)芝等證明夏枯草提取物可抑制食管癌Eca-109細(xì)胞增殖，降低Bcl-2蛋白質(zhì)表達(dá)，增加Bax蛋白質(zhì)表達(dá)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

黃酮類化合物廣泛存在于植物體內(nèi)，具有降低心肌耗氧量、清除體內(nèi)自由基、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、調(diào)血脂、降血壓、防癌抗癌等藥理學(xué)功能，是一類極具開(kāi)發(fā)前景的天然抗氧化劑，夏枯草在中國(guó)分布廣泛，資源豐富。目前，夏枯草的研究主要集中在化學(xué)成分的提取及其相關(guān)的生物學(xué)活性研究，而對(duì)其自由基清除活性的研究相對(duì)較少。本試驗(yàn)以夏枯草中總黃酮為研究對(duì)象，研究其自由基清除活性，并測(cè)定其還原能力，旨在為夏枯草進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

夏枯草采于陜西省漢中市漢臺(tái)區(qū)，將夏枯草烘干，粉碎后待用；蘆?。ㄗ灾茦?biāo)準(zhǔn)品）；無(wú)水乙醇、抗壞血酸、鄰二氮菲、七水硫酸亞鐵、雙氧水、亞硝酸鈉、ABTS、過(guò)硫酸鉀、氫氧化鈉、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、鄰苯三酚，均為市售分析純。

ZXL-RS-6A型數(shù)顯恒溫水浴鍋（江蘇省金壇市金祥龍電子有限公司）：SHZ-D（Ⅲ）型循環(huán)水式真空泵（鞏義市英峪予華儀器廠）：GZX-9070MBE型數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱（中國(guó)重慶銀河試驗(yàn)儀器有限公司）：722E型分光光度計(jì)（上海光譜儀器有限公司）：FA2104N型電分析天平（上海思龍科學(xué)儀器有限公司）；TGL-16C型臺(tái)式離心機(jī)（上海安寧科學(xué)儀器廠）。

1.2 方法

1.2.1 夏枯草中總黃酮的提取 取新鮮夏枯草，于60℃烘干，粉碎。稱取夏枯草粉末5.027g，設(shè)定溫度為80℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)為65%，固液比為1：18（g/mL，下同）的條件下加熱回流2h，抽濾，殘?jiān)俅谓〕闉V，合并兩次濾液。乙醇提取液濃縮至25mL，轉(zhuǎn)移至250mL容量瓶中，65%的乙醇定容，得到樣品分析液。

1.2.2 繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線 精確稱取經(jīng)干燥至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品20.0mg，乙醇溶解至50mL定容，配成0.4mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液0.00、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00、7.00、8.00、9.00mL，分別加乙醇補(bǔ)至10.00mL，加入5%NaNO₂溶液1.5mL，搖勻，靜置6min；再加入10%Al（NO₃）₃溶液1.5mL。搖勻。靜置6min。加入4%NaOH溶液15mL，用65%乙醇稀釋至刻度，搖勻，放置15min，在波長(zhǎng)510nm處測(cè)定其吸光度，以蘆丁濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程。

1.2.3 夏枯草總黃酮提取含量的測(cè)定 精確吸取樣品溶液2.5mL，置于50mL容量瓶，按標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備方法測(cè)定其吸光度，根據(jù)回歸方程，計(jì)算夏枯草樣品中總黃酮的含量。

1.2.4 羥基自由基（·OH）的清除 采用鄰二氮菲一Fe²⁺氧化法。按以下公式計(jì)算對(duì)·OH的清除率。

·OH清除率=[（D_樣品-D_損傷）/（D_未損-D_損傷）]×100%

1.2.5 ABTS自由基正離子（ABTS⁺·）的清除 將ABTS配制成7mmoL/L溶液，再加2.45mmol/L過(guò)硫酸鉀，置于室溫黑暗中反應(yīng)12-16h，制備ABTS⁺·。使用無(wú)水乙醇稀釋ABTS⁺·使其在734nm處的吸光度為0，70±0，01。加入不同體積的抗氧化劑于上述稀釋的5mL自由基溶液，無(wú)水乙醇定容，于30℃水浴中放置30min，734nm處測(cè)定吸光度D_X，以不加抗氧化劑測(cè)定的吸光度為D₀，無(wú)水乙醇校零，平行測(cè)定3次。以相同濃度的維生素C作對(duì)照，按以下公式計(jì)算對(duì)ABTS⁺·的清除率。

ABTS⁺·清除率=（D⁰-D^X）/D⁰×l00%

1.2.6 超氧陰離子自由基（O₂^-·）的清除 采用鄰苯三酚自氧化法。取5支15mL的離心管，各管中加入Tris-HCl（0.1mol/LDH8.2）緩沖溶液5.0mL，于37℃水浴中預(yù)熱10min，在各管中依次加入不同體積的夏枯草提取液，再迅速加入預(yù)熱的0.1mL鄰苯三酚（3mol/L），于30s內(nèi)定容至10mL，置于37℃的水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)10min，立即用鹽酸（8mmol/L）2滴終止反應(yīng)，于420nm處測(cè)定各管的吸光度D樣品，平行測(cè)定3次。相同試驗(yàn)條件下，不加任何提取液的吸光度為D_空白，夏枯草提取液吸光度為D₀，以相同濃度的維生素C作參照，按以下公式計(jì)算對(duì)O₂^-·的清除率，

O₂^-·清除率=[△D_空白-△D_樣品-△D₀）]/△D_空白×100%

1.2.7 相對(duì)還原能力的測(cè)定 采用Oyaizu的方法測(cè)定相對(duì)還原能力。在不同體積的樣品溶液中分別加入2.5mL0.2mol/L磷酸鹽緩沖溶液（pH6.6）和5mL1%鐵氰化鉀溶液，混合均勻后置于37℃水浴中反應(yīng)20min，再加5mL10%三氯乙酸溶液，無(wú)水乙醇定容，3000r/min離心10min。吸取上清液2，5mL，依次加入2.5mL去離子水和0.5mL0.1%三氯化鐵溶液。于700nm處測(cè)定待測(cè)樣品的吸光度。以同濃度的乙醇為空白，平行測(cè)定3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

以蘆丁濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程為A=9.6161x+0.0443，相關(guān)系數(shù)R²為0.9993。

2.2 夏枯草總黃酮含量的測(cè)定

測(cè)定樣品溶液在510nm處的吸光度，代入回歸方程，計(jì)算出樣品中的總黃酮含量為0.8mg/mL，即夏枯草中總黃酮含量為3.98%。

2.3 夏枯草總黃酮對(duì)羥基自由基（·OH）的清除效果

由圖1可知，夏枯草總黃酮的濃度與·OH的清除作用呈明顯的量一效關(guān)系，清除效果隨著夏枯草總黃酮濃度的增加而增強(qiáng)。與維生素C相比，在0.024-0.048mg/mL的濃度范圍內(nèi)，夏枯草總黃酮對(duì)·OH的清除效果與維生素C近似，在0.048～0.144mg/mL的濃度范圍內(nèi)，夏枯草總黃酮對(duì)，OH的清除效果明顯高于維生素C。隨著濃度的增加，維生素C對(duì)·OH的清除作用緩慢增加，而夏枯草總黃酮對(duì)·OH的清除作用快速增加。在濃度為0.12mg/mL時(shí)，夏枯草總黃酮對(duì)·OH的清除率高達(dá)96%，而相同濃度下維生素C的清除率為49%，即夏枯草黃酮對(duì)·OH的清除效果明顯優(yōu)于天然抗氧化劑維生素C。

2.4 夏枯草總黃酮對(duì)ABTS自由基正離子的清除效果

ABTS法被廣泛用于天然產(chǎn)物總抗氧化能力的測(cè)定。在反應(yīng)體系中，ABTS經(jīng)氧化后生成相對(duì)穩(wěn)定的藍(lán)綠色ABTS自由基正離子，抗氧化劑與ABTS⁺·反應(yīng)后使其溶液褪色，特征吸光度降低。吸光度越低，表明所檢測(cè)物質(zhì)的總抗氧化能力越強(qiáng)。

由圖2可知，夏枯草總黃酮對(duì)ABTS⁺·的清除呈明顯的量一效關(guān)系，即濃度越大。清除效果越強(qiáng)。夏枯草總黃酮相對(duì)于維生素C而言，對(duì)ABTS⁺·具有良好的清除效果，在濃度為0.004mg/mL時(shí)，夏枯草總黃酮對(duì)ABTS⁺·的清除率達(dá)到99%，而同濃度條件下，維生素C對(duì)ABTS⁺·的清除率為73%，即夏枯草總黃酮對(duì)ABTS⁺·的清除效果明顯優(yōu)于抗氧化劑維生素C。 2.5 夏枯草總黃酮對(duì)超氧陰離子自由基（O₂^-·）的清除效果

超氧陰離子自由基（O₂^-·）是生物體代謝產(chǎn)生的活性中間體之一，可在短時(shí)間內(nèi)引發(fā)自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。產(chǎn)生·OH、過(guò)氧亞硝酸根等。細(xì)胞內(nèi)O₂^-·的累積可以引起線粒體膜的通透性改變，導(dǎo)致細(xì)胞色素C的釋放，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。因此。清除O₂^-·有助于維持機(jī)體的氧化還原平衡，保證機(jī)體的代謝穩(wěn)定性。

由圖3可知，隨著夏枯草總黃酮濃度的增加，清除O₂^-·的能力逐漸增強(qiáng)，并且存在良好的線性關(guān)系。當(dāng)樣品濃度為0.01mg/mL時(shí)，夏枯草總黃酮對(duì)O₂^-·的清除率為92%，而相同濃度條件下的維生素C的清除率為21%。結(jié)果表明，夏枯草總黃酮清除O₂^-·的活性明顯優(yōu)于天然抗氧化劑維生素C。

2.6 還原能力的測(cè)定

由圖4可知，夏枯草總黃酮具有較好的還原能力，其還原能力與濃度呈現(xiàn)良好的量一效關(guān)系，即濃度越大，還原能力越強(qiáng)，抗氧化活性越強(qiáng)，但與維生素C相比，差距不大。可能是因?yàn)楸驹囼?yàn)所測(cè)的還原能力是指夏枯草中總黃酮的還原能力，而清除·OH和ABTS⁺·的黃酮可能是夏枯草總黃酮中的部分黃酮。所以測(cè)得的還原能力與維生素C相比差距不大，而清除·OH、ABTS⁺·和O₂^-·時(shí)效果較好。

3 小結(jié)

通過(guò)測(cè)定，確定夏枯草提取液中總黃酮含量為0.80mg/mL。夏枯草總黃酮具有明顯的抗氧化活性。在濃度為0.12mg/mL時(shí)，對(duì)·OH的清除率達(dá)到96%：在濃度為0.004mg/mL時(shí)。對(duì)ABTS+，的清除率達(dá)到99%：在濃度為0.01mg/mL時(shí)，對(duì)O₂^-·的清除率達(dá)到92%，清除效果明顯優(yōu)越于天然抗氧化劑維生素C，且夏枯草總黃酮也具有較強(qiáng)的還原能力。夏枯草在中國(guó)資源豐富，分布廣泛，本研究證實(shí)其具有良好的自由基清除活性，為夏枯草的生物活性研究和資源開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。