3種常用防腐劑復(fù)配對致病菌抑菌效果比較

陳　雪，　史得君，　黃柏申，　沈　月，　楊　麗，　崔承弼*

(1.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133002；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京 100193 )

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3種常用防腐劑復(fù)配對致病菌抑菌效果比較

陳雪1,2，史得君1，黃柏申1，沈月2，楊麗2，崔承弼1*

(1.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133002；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京 100193 )

摘要：為降低食品中防腐劑的添加量，同時達(dá)到預(yù)期的防腐效果，試驗(yàn)以山梨酸鉀、雙乙酸鈉和脫氫乙酸鈉3種常用防腐劑為研究對象，經(jīng)不同添加比例復(fù)配處理，采用酶標(biāo)比濁法觀測其復(fù)配防腐劑對致病菌株革蘭氏陰性(G-)菌腸炎沙門氏菌、福氏志賀氏菌和革蘭氏陽性(G+)菌金黃色葡萄球菌的抑菌性影響。并對其結(jié)果中最優(yōu)復(fù)配組合進(jìn)行濃度稀釋，觀測不同稀釋比例復(fù)配組合防腐劑的抑菌效果變化趨勢。結(jié)果表明：復(fù)配防腐劑中山梨酸鉀和雙乙酸鈉添加量為50∶50和75∶25時，對沙門氏菌的抑制能力最強(qiáng)；山梨酸鉀與雙乙酸鈉復(fù)配比例為50∶50時和山梨酸鉀∶雙乙酸鈉∶脫氫乙酸鈉為50∶25∶25時，對志賀氏菌抑制能力最強(qiáng)；山梨酸鉀和脫氫乙酸鈉添加量為75∶25時，對金黃色葡萄球菌的抑制能力最強(qiáng)；當(dāng)3種防腐劑復(fù)配比例為山梨酸鉀∶雙乙酸鈉∶脫氫乙酸鈉為50∶25∶25時，對3種致病菌的抑制能力均較好；最優(yōu)復(fù)配組合濃度稀釋試驗(yàn)中，抑菌性均隨著濃度的減小而降低，但并不是呈線性比例降低，上述3個組合防腐劑復(fù)配的稀釋比例為原來70%降到50%時，對致病菌的抑制效果不存在顯著差異。因此，復(fù)配可以提高防腐劑的抑菌性，且復(fù)配防腐劑的抑菌性在一定濃度范圍內(nèi)穩(wěn)定。

關(guān)鍵詞：復(fù)配；防腐劑；抑菌效果

防腐劑是指用于防止食品在儲存、流通過程中，由于微生物繁殖引起的變質(zhì)，或由于儲存、銷售條件不善，食品內(nèi)在品質(zhì)發(fā)生劣變，為提高保存期，延長食用價值而在食品中使用的添加劑[1]。隨著人們生活水平的日益提高，食品供應(yīng)種類也愈加豐富，但隨之而來的食品安全問題也層出不窮。防腐劑能有效地抑制食品中微生物的生長繁殖，延長食品的貯藏期，在加工食品中有著不可取代的作用[2-4]。但過多地攝入防腐劑會對人體產(chǎn)生一定的毒害作用[5]，加之近些年防腐劑的濫用，以及宣傳上的不到位，已經(jīng)使防腐劑的應(yīng)用成為消費(fèi)者極度敏感的問題[6-8]。為取得更好的防腐效果，人們考慮將多種防腐劑復(fù)配混合使用[9-10]，利用它們的協(xié)同作用降低防腐劑的添加量[11-12]。如何有效地使用多種添加劑，郭鑭等[13]研究復(fù)配防腐劑那他霉素和單辛酸甘油酯(復(fù)配比例0.18∶0.4)為年糕最優(yōu)復(fù)配防腐劑，該復(fù)配防腐劑的使用可以盡量保持年糕原有風(fēng)味的同時延長年糕保質(zhì)期；荊亞玲等[14]研究得出，丙酸鈣與脫氫醋酸鈉兩者復(fù)配的比例為6∶4時，更有利于延長面包的保質(zhì)期；陳思奇等[15]研究表明，0.026 8%山梨酸鉀與0.01%乳酸鏈球菌素組成復(fù)配防腐劑，能滿足對中性飲料的防腐要求等。但是關(guān)于復(fù)配防腐劑的研究還不夠深入，不能滿足人們對各類食品需求日益增長的要求。

隨著我國食品工業(yè)的日益發(fā)展，防腐劑作為一類主要的食品添加劑在食品工業(yè)中被廣泛應(yīng)用。與國外相比，我國生產(chǎn)企業(yè)普遍存在的問題是：合成技術(shù)落后、工藝不完善、生產(chǎn)成本高[16]。因此，開發(fā)抗菌性強(qiáng)、安全無毒、適用性廣和性能穩(wěn)定的食品防腐劑是食品科學(xué)研究的熱點(diǎn)之一[17]。

本研究以應(yīng)用于加工蔬菜中的3種食品防腐劑山梨酸鉀、雙乙酸鈉和脫氫乙酸鈉為防腐劑復(fù)配的研究對象，以革蘭氏陰性菌沙門氏菌、志賀氏菌和革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌為目標(biāo)菌株進(jìn)行抑菌效果比較試驗(yàn)，選出最優(yōu)復(fù)配組合。在食品加工中，防腐劑在一定的濃度范圍內(nèi)均能達(dá)到較好的防腐效果，這對食品的生產(chǎn)加工具有一定的實(shí)際意義。因此后續(xù)試驗(yàn)中對其最優(yōu)的復(fù)配比例組合進(jìn)行適當(dāng)濃度的稀釋，旨在選出防腐劑抑菌性相對穩(wěn)定的濃度區(qū)間。

1材料與方法

1.1材料與設(shè)備

山梨酸鉀、雙乙酸鈉、脫氫乙酸鈉購于上海源葉生物科技有限公司。腸炎沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、福氏志賀氏菌購于中國工業(yè)微生物菌種保藏中心。營養(yǎng)肉湯、TSA培養(yǎng)基購于北京陸橋技術(shù)有限公司。

LX-C不銹鋼立式壓力蒸汽滅菌器(合肥華泰醫(yī)療設(shè)備有限公司)，超凈工作臺(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)，BSD-100振蕩培養(yǎng)箱(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司)，I-mark酶標(biāo)儀(美國Bio-Rad公司)。

1.2方法

1.2.1菌懸液的準(zhǔn)備

挑取斜面菌種置于含有20 mL相應(yīng)無菌液態(tài)培養(yǎng)基的錐形瓶中，在適宜溫度下培養(yǎng)24 h后，用無菌液態(tài)培養(yǎng)基稀釋至105CFU/mL備用。

1.2.2最佳防腐劑復(fù)配組合篩選

1) 3種防腐劑復(fù)配組合設(shè)計防腐劑復(fù)配使用量的確定是根據(jù)荊亞玲[14]實(shí)驗(yàn)方法并進(jìn)行改動，按照《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn) 》GB2760-2014中的規(guī)定，在蔬菜加工中防腐劑單獨(dú)使用時最大使用量為:山梨酸及其鉀鹽的最大使用限量為0.5 g/kg(以山梨酸計)，折合成山梨酸鉀的最大使用限量為0.665 g/kg；脫氫乙酸鈉(以脫氫乙酸計) 的最大使用限量為 0.3 g/kg，折合成脫氫乙酸鈉的最大使用限量為0.34 g/kg；雙乙酸鈉的最大使用限量為1.0 g/kg。同時按《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn) 》GB2760-2014附錄 A(食品添加劑的使用規(guī)定)A.2的規(guī)定，同一功能的食品添加劑(相同色澤著色劑、防腐劑、抗氧化劑)在混合使用時，各自用量占其最大使用量的比例之和不應(yīng)超過1。本試驗(yàn)按照以上2個標(biāo)準(zhǔn)對其山梨酸鉀、雙乙酸鈉和脫氫乙酸鈉進(jìn)行復(fù)配處理，復(fù)配添加量=各自用量占其最大使用量的比例之和等于1進(jìn)行添加，具體試驗(yàn)設(shè)計如表 1。

表1　3種防腐劑復(fù)配的添加比例

注：山梨酸鉀、雙乙酸鈉、脫氫乙酸鈉制成其最大使用限量的0、25%、50%、75%、100%的溶液濃度分別為0、0.166、0.332、0.499、0.665 g/kg；0、0.25、0.5、0.75、1.00 g/kg；0、0.085、0.17、0.255、0.34 g/kg。

2) 防腐劑抑菌性檢測將配制好的防腐劑用相應(yīng)的液態(tài)培養(yǎng)基配成所需質(zhì)量濃度。吸取100 μL液態(tài)防腐劑到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，再將備用菌懸液吸取100 μL到孔中混勻(每個樣做3個平行)，立即用酶標(biāo)儀測其光密度值，然后在所需培養(yǎng)溫度下振蕩培養(yǎng)24 h后再次用酶標(biāo)儀測其光密度值，以2次光密度值的差值來表示每個孔中菌含量的變化。本試驗(yàn)以培養(yǎng)前后菌液中含菌量的變化來表示防腐劑抑菌性的大小，含菌量變化越大，即菌含量生長越多，則防腐劑抑菌性越低。

1.2.3復(fù)配組合濃度篩選

由上述試驗(yàn)結(jié)果可得每種試驗(yàn)菌株抑菌效果最好的復(fù)配組合比例。將其最優(yōu)的復(fù)配比例進(jìn)行濃度稀釋，分別稀釋為表1中原濃度的90%、80%、70%、60%、50%和40%。稀釋后的防腐劑抑菌性檢測方法同2)。

1.3數(shù)據(jù)分析

利用SAS軟件進(jìn)行方差和顯著性分析。

2結(jié)果與分析

2.13種防腐劑復(fù)配對3種致病菌抑菌效果比較

由表2可知，不同復(fù)配組合對沙門氏菌的抑制能力表現(xiàn)為：12號組合即山梨酸鉀與雙乙酸鈉復(fù)配比例為50∶50，抑菌濁度值為0.553；14號組合即山梨酸鉀與雙乙酸鈉復(fù)配比例為75∶25，抑菌濁度值為0.579，這2組對沙門氏菌抑菌效果最好。組合號11號為3種防腐劑復(fù)配的組合之一，對沙門氏菌抑制能力較強(qiáng)；15號、5號、1號組合分別為單獨(dú)添加山梨酸鉀、雙乙酸鈉和脫氫乙酸鈉，對沙門氏菌的抑制能力呈依次遞減趨勢；當(dāng)脫氫乙酸鈉分別與山梨酸鉀和雙乙酸鈉復(fù)配時對沙門氏菌的抑制能力均相對較弱，且雙乙酸鈉與脫氫乙酸鈉復(fù)配時對沙門氏菌的抑制能力相對最弱。實(shí)驗(yàn)選取最優(yōu)抑菌組合中的12號進(jìn)行下一步復(fù)配防腐劑濃度稀釋試驗(yàn)。

表2　3種防腐劑復(fù)配對幾種致病菌的抑菌效果比較

續(xù)表2　3種防腐劑復(fù)配對幾種致病菌的抑菌效果比較

注：同列不同小寫字母表示在P<0.05時差異顯著。

不同復(fù)配組合對志賀氏菌的抑制能力表現(xiàn)為：12號組合即山梨酸鉀與雙乙酸鈉復(fù)配比例為50∶50，抑菌濁度值為0.064；11號組合即為山梨酸鉀∶雙乙酸鈉∶脫氫乙酸鈉為50∶25∶25抑菌濁度值為0.067，是對志賀氏菌抑菌效果最好的2組。9號組合和14號組合也為山梨酸鉀和雙乙酸鈉不同比例的復(fù)配組合，對志賀氏菌的抑制能力均較強(qiáng)；8號組合為3種防腐劑復(fù)配的組合之一，對志賀氏菌的抑制能力較強(qiáng)；15號、5號、1號組合為單獨(dú)添加山梨酸鉀、雙乙酸鈉和脫氫乙酸鈉，抑制能力表現(xiàn)為山梨酸鉀和雙乙酸鈉對志賀氏菌的抑制能力較強(qiáng)，脫氫乙酸鈉抑制能力相對較弱；當(dāng)脫氫乙酸鈉分別與山梨酸鉀和雙乙酸鈉復(fù)配時對志賀氏菌的抑制能力均相對較弱。試驗(yàn)選取最優(yōu)抑菌組合中的12號進(jìn)行下一步復(fù)配防腐劑濃度稀釋試驗(yàn)。

復(fù)配組合對金黃色葡萄球菌的抑制能力表現(xiàn)為：13號組合即山梨酸鉀與脫氫乙酸鈉復(fù)配比例為75∶25，抑菌濁度值為0.13，是對金黃色葡萄球菌抑菌效果最好的一組。10號組合也為山梨酸鉀和脫氫乙酸鈉不同比例的復(fù)配組合，對金黃色葡萄球菌的抑制能力較強(qiáng)；11號組合為3種防腐劑復(fù)配的組合之一，對金黃色葡萄球菌的抑制能力較強(qiáng)；單獨(dú)添加山梨酸鉀、雙乙酸鈉和脫氫乙酸鈉的15號、5號和1號組合，表現(xiàn)為山梨酸鉀對金黃色葡萄球菌的抑制能力相對較強(qiáng)，脫氫乙酸鈉次之，雙乙酸鈉抑制能力相對較弱；當(dāng)雙乙酸鈉分別與山梨酸鉀和雙乙酸鈉復(fù)配時對金黃色葡萄球菌的抑制能力均較弱。試驗(yàn)選取最優(yōu)抑菌組合13號進(jìn)行下一步復(fù)配防腐劑濃度稀釋試驗(yàn)。

3種致病菌的最佳抑菌組合并不相同，但是在食品中無論是革蘭氏陽性菌還是革蘭氏陰性菌都有較高的危害性和普遍性，所以找出一種對這3種致病菌均具有較強(qiáng)抑菌性能的復(fù)配組合更具有實(shí)際意義。綜合表2數(shù)據(jù)可知，11號組合即復(fù)配比例為山梨酸鉀∶雙乙酸鈉∶脫氫乙酸鈉為50∶25∶25，對3種致病菌均呈現(xiàn)出較強(qiáng)的抑菌能力。

2.2稀釋后防腐劑組合對3種致病菌的抑菌效果比較

2.2.1稀釋后12號防腐劑組合對沙門氏菌的抑菌效果比較

由表2可知，組合號12號即山梨酸鉀與雙乙酸鈉復(fù)配比例為50∶50，對沙門氏菌的抑菌效果最好，應(yīng)采用12號組合的復(fù)配比例進(jìn)行濃度梯度稀釋。

注：橫坐標(biāo)為表1中原復(fù)配組合的不同稀釋濃度，不同小寫字母表示在P<0.05時差異顯著，下同。

圖1稀釋后防腐劑12號組合對沙門氏菌的抑菌效果比較

Fig.1Comparison of antibacterial activity of No.12

combination on Salmonella enteritidis after dilution

由圖1可知，當(dāng)稀釋濃度為原來的90%和80%時，與未稀釋復(fù)配防腐劑組合相比，含菌量有所增加，即防腐劑組合的抑菌能力有所下降，但數(shù)據(jù)分析表明，這3個稀釋濃度的組合之間抑菌效果無顯著差異。在濃度稀釋至70%時，與稀釋濃度80%時相比抑菌能力顯著下降。稀釋濃度為70%、60%和50%的防腐劑對沙門氏菌的抑菌能力不存在顯著差異。稀釋濃度為40%時，防腐劑對沙門氏菌的抑制能力顯著下降。綜上所述，就最佳復(fù)配組合而言，其對沙門氏菌的抑菌性隨著濃度的減小而降低，但7個稀釋濃度間并非全部存在顯著差異。未稀釋的防腐劑和稀釋濃度為80%的防腐劑區(qū)間與稀釋濃度為70%和50%的防腐劑區(qū)間其抑菌性均沒有顯著性差異。

2.2.2稀釋后12號防腐劑組合對志賀氏菌的抑菌效果比較

由表2可知，12號組合即當(dāng)山梨酸鉀與雙乙酸鈉復(fù)配比例為50∶50時，其對志賀氏菌的抑菌效果最好，采用12號組合的復(fù)配比例進(jìn)行濃度稀釋。

由圖2可知，當(dāng)防腐劑組合稀釋比例為原來的90%和80%時，與未稀釋復(fù)配防腐劑對志賀氏菌的抑菌能力相比有所下降，數(shù)據(jù)分析表明，其間存在顯著差異，但90%和80%稀釋比例間無顯著差異。當(dāng)稀釋比例為原來的 70%時，抑菌能力繼續(xù)下降，與稀釋濃度80%時存在顯著差異。當(dāng)稀釋濃度為60%和50%時，其下降速度較為緩慢，與70%時的抑菌能力不存在顯著差異；當(dāng)稀釋濃度為40%時，其對志賀氏菌的抑制能力顯著下降。綜上所述，就最佳復(fù)配組合而言，其對志賀氏菌的抑菌性隨著濃度的減小而降低，但7個稀釋濃度間并非全部存在顯著差異。稀釋濃度為90%和80%的防腐劑區(qū)間與稀釋濃度為70%和50%的防腐劑區(qū)間其抑菌效果均沒有顯著性差異。

圖2　稀釋后12號防腐劑組合對福氏志賀氏菌的抑菌效果

2.2.3稀釋后13號防腐劑組合對金黃色葡萄球菌的抑菌效果比較

由表2可知，13號組合即當(dāng)山梨酸鉀與脫氫乙酸鈉復(fù)配比例為75∶25時，其對金黃色葡萄球菌的抑菌效果最好，采用13號組合的復(fù)配比例進(jìn)行濃度稀釋。

由圖3可知，當(dāng)防腐劑組合稀釋比例為原來的90%、80%和70%時，與未稀釋復(fù)配防腐劑對金黃色葡萄球菌的抑菌能力相比有所降低，數(shù)據(jù)分析表明，其4個濃度稀釋間存在顯著差異。當(dāng)稀釋濃度為60%和50%時，其對金黃色葡萄球菌的抑菌能力下降速度較為緩慢，與70%時的抑菌能力相比不存在顯著差異；當(dāng)稀釋濃度為40%時，其對金黃色葡萄球菌的抑制能力顯著下降。綜上所述，就最佳復(fù)配組合而言，其對金黃色葡萄球菌的抑菌性隨著濃度的減小而降低，但7個稀釋濃度間并非全部存在顯著差異。稀釋濃度為70%和50%的防腐劑區(qū)間抑菌效果沒有顯著性差異。

圖3　稀釋后13號防腐劑組合對金黃色葡萄球菌的抑菌效果比較

由圖1～3可知，在最優(yōu)復(fù)配組合濃度稀釋試驗(yàn)中，抑菌性均隨著濃度的減小而降低，但并不是呈線性比例降低，且在上述3個組合中，防腐劑復(fù)配的稀釋比例為原來的70%和50%時，對沙門氏菌、志賀氏菌和金黃色葡萄球菌的抑制效果均不存在顯著差異。

3結(jié)論

對沙門氏菌的抑制能力最強(qiáng)的防腐劑復(fù)配組合為12號和14號，即山梨酸鉀與雙乙酸鈉復(fù)配比例為50∶50和75∶25；對志賀氏菌的抑制能力最強(qiáng)的防腐劑復(fù)配組合為12號和11號，即為山梨酸鉀與雙乙酸鈉復(fù)配比例為50∶50和山梨酸鉀∶雙乙酸鈉∶脫氫乙酸鈉為50∶25∶25；對金黃色葡萄球菌的抑制能力最強(qiáng)的防腐劑復(fù)配組合為13號，即山梨酸鉀與脫氫乙酸鈉復(fù)配比例為75∶25。3種致病菌最佳防腐劑組合的抑菌性均隨著濃度的減小而降低，但并不是呈線性比例降低；防腐劑復(fù)配組合的稀釋比例為原來的70%、60%和50%時，對3種致病菌的抑制效果均不存在顯著差異。

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Comparison of antibacterial effect of compound preservatives against pathogenic bacteria

(.*)

(1.AgriculturalCollegeofYanbianUniversity,YanjiJilin133002,China; 2.InstituteofAgro-productsProcessingScienceandTechnology,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100193,China)

Abstract：In order to reduce the amount of preservatives and achieve the desired preservative effects, three kinds of commercial preservatives potassium sorbate, sodium diacetate and sodium dehydroacetate were selected and mixed, the inhibitory effects on gram negative (G-) bacteria Salmonella enteritidis, Shigella castellani and gram positive (G+) bacteria Staphylococcus aureus were tested by enzyme-linked turbidimetry method. And the optimal compound preservatives were diluted into gradient concentrations and evaluated their inhibitory effects. The results showed that the strongest inhibitory ability for mixed proportion of potassium sorbate and sodium diacetate against S. enteritidis was 50∶50 and 75∶25. The best mixed proportion of potassium sorbate and sodium dehydroacetate against S. castellani was 50∶50 and potassium sorbate, sodium diacetate, sodium dehydroacetate against S. castellani was 50∶25∶25. The best mixed proportion of potassium sorbate and sodium dehydroacetate was 75∶25 against S. aureus. The proportion of 50∶25∶25 for potassium sorbate, sodium diacetate, sodium dehydroacetate showed the strongest inhibitory effect against three used pathogenic bacteria. With the concentrations of above three compound groups decreasing, the antibacterial abilities became weak, but did not show a linear relationship, there was no significant different when the concentration was diluted from 70% to 50%. It is concluded that the compound preservatives show better inhibitory ability, and the inhibitory ability is stable at a certain range of concentrations.

Key words:compound; preservative; antibacterial effect

中圖分類號：TS.202.3

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1004-7999(2016)01-0018-06

DOI:10.13478/j.cnki.jasyu.2016.01.004

作者簡介：陳雪(1991—)，女，吉林通化人，在讀碩士，研究方向?yàn)樽魑锇踩a(chǎn)與農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量。崔承弼為通信作者，E-mail：meixugao@263.net

收稿日期：2016-03-10基金項(xiàng)目：“十二五”國家科技支撐項(xiàng)目(2014BAA03B05)