蝦青素琥珀酸二酯的制備工藝及其結(jié)構(gòu)表征*

張　婷， 徐　杰， 周慶新， 李學(xué)敏， 楊　澍， 薛長(zhǎng)湖

(中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266003)

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蝦青素琥珀酸二酯的制備工藝及其結(jié)構(gòu)表征*

張婷， 徐杰， 周慶新， 李學(xué)敏， 楊澍， 薛長(zhǎng)湖**

(中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266003)

摘要：蝦青素具有極強(qiáng)的抗氧化、抗癌變和增強(qiáng)免疫力等功能，但由于蝦青素水溶解性(分散性)的限制致使其生物利用度和應(yīng)用范圍有很大的局限性。本文以丁二酸酐和合成蝦青素為原料(摩爾比為10∶1)，以三乙胺為催化劑(與合成蝦青素的摩爾比為3∶1)，合成蝦青素琥珀酸二酯；經(jīng)硅膠柱層析,用氯仿-甲醇(90∶10，v/v)混合液進(jìn)行洗脫純化；用高效液相色譜對(duì)合成的蝦青素琥珀酸二酯進(jìn)行分析，測(cè)得其純度達(dá)95%；經(jīng)紫外光譜掃描，測(cè)得其最大吸收波長(zhǎng)為487 nm，與蝦青素的最大吸收波長(zhǎng)接近。薄層色譜結(jié)果顯示，蝦青素琥珀酸二酯的極性增大，LC-(APCI)MS/MS分析得到其分子量為796.5，從其裂解碎片中可得到蝦青素的碎片離子m/z 561.5和m/z 579.5。通過1H NMR和DEPTQ譜進(jìn)行驗(yàn)證，合成產(chǎn)物為蝦青素琥珀酸二酯。

關(guān)鍵詞：蝦青素琥珀酸二酯；制備工藝；結(jié)構(gòu)；液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；核磁共振波譜

引用格式：張婷，徐杰，周慶新，等. 蝦青素琥珀酸二酯的制備工藝及其結(jié)構(gòu)表征[J].中國(guó)海洋大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)， 2016,46(4)：50-55.

ZHANG Ting， XU Jie， ZHOU Qin-Xin, et al. Preparation technology of astaxanthin succinate diester and its structure characterization[J].Periodical of Ocean University of China, 2016, 46(4)： 50-55.

蝦青素(3,3’-二羥基-4,4’-二酮基-β,β’-胡蘿卜素)是萜烯類不飽和化合物[1]，是類胡蘿卜素的一種，其結(jié)構(gòu)如圖1所示。研究發(fā)現(xiàn)蝦青素具有很強(qiáng)的抗氧化活性[2-3]，蝦青素在清除氧自由基方面的作用是β-胡蘿卜素的10多倍，VE的100多倍[4]，除此之外，蝦青素還具有著色[5]、光保護(hù)[6]、抗炎[7]、抗癌癥[8]、增強(qiáng)機(jī)體免疫力[9]等多種生物學(xué)功能。蝦青素易溶于氯仿、二氯甲烷、丙酮、二硫化

碳等弱極性的有機(jī)溶劑[10]，不溶于水[11]。水溶性方面的限制使其在動(dòng)物體內(nèi)無法正常運(yùn)輸，降低了蝦青素在動(dòng)物體內(nèi)的吸收和利用率，也降低了其生物學(xué)功能[12]。為提高蝦青素的水溶性及其在水中的分散程度，目前研究者們也正在通過微乳化[13-14]、載體結(jié)合[15]、微囊化[16-17]等方法來實(shí)現(xiàn)這一目的，如HBI公司在二氯甲烷體系中，以蝦青素和琥珀酸酐為原料，DMAP為催化劑經(jīng)過15 h反應(yīng)后合成的蝦青素二琥珀酸二鈉鹽(Cardax)[18-19]，經(jīng)測(cè)定Cardax的水溶性達(dá)到了8.64mg/mL[20]，研究表明，這種衍生物在心臟保護(hù)和心肌拯救方面的作用也顯著優(yōu)于蝦青素單體[21]。

圖1　蝦青素結(jié)構(gòu)

本文采用不同于HBI公司的一種新方法合成蝦青素琥珀酸二酯，其意義在于通過暴露極性端羧基使蝦青素的極性增大，這樣會(huì)更加有利于蝦青素與糖、氨基酸、無機(jī)鹽等其他物質(zhì)結(jié)合，從而增大蝦青素的水溶性，提高其生物利用度。

1實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)原料及試劑

合成蝦青素(含量10%)購(gòu)于浙江巴士曼生物科技有限公司。

乙腈(色譜純，德國(guó)Merck公司)；甲醇、二氧六烷、三乙胺、丁二酸酐、正己烷(分析純，天津博迪化工有限公司)；丙酮、二甲基亞砜(DMSO)、三氯甲烷(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；氘代氯仿(CDCl3，青島騰龍微波科技有限公司)；SGF254薄層色譜TLC預(yù)制硅膠板(煙臺(tái)市化學(xué)工業(yè)研究所)；0.22μm有機(jī)濾膜(美國(guó)Agela公司)；硅膠(200～300目，青島海洋化工廠)。

1.2 儀器和設(shè)備

1100系列高效液相色譜儀，配二極管陣列檢測(cè)器(DAD)(美國(guó)Agilent公司)，G6410B三重四極桿質(zhì)譜儀，配大氣壓化學(xué)電離源(APCI)(美國(guó)Agilent公司)；紫外-可見分光光度計(jì)(日本島津公司)；核磁共振波譜儀(德國(guó)Bruker公司)；Milli-Q Elix-5超純水系統(tǒng)(美國(guó)Millipore公司)；DF-101S磁力攪拌器(上海羌強(qiáng)設(shè)備有限公司)；硅膠柱(規(guī)格φ22 mm × 1100 mm，北京慧德易科技有限責(zé)任公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 蝦青素琥珀酸二酯的合成將合成蝦青素原料用二氧六烷溶解，以丁二酸酐和合成蝦青素為原料(摩爾比為10∶1)，以三乙胺為催化劑(與合成蝦青素的摩爾比為3∶1)，充入氮?dú)饷芊馐蛊涓艚^氧氣。在50℃下攪拌15 h，反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫，加入0.1% HCl溶液將生成的蝦青素琥珀酸二酯沉淀出來，凍干后即所得產(chǎn)物。

1.3.2 蝦青素琥珀酸二酯的純化取60g硅膠(200～300目)，105℃高溫活化3h后用氯仿勻漿后濕法裝柱，將填料充分沉降，用一定量洗脫液勻速淋洗直至柱平衡。再用少量的氯仿溶解3g樣品后上樣，用氯仿-甲醇100∶0、97∶3、90∶10、0∶100的比例依次淋洗。

1.3.3 薄層色譜分析采用氯仿：甲醇：水(80∶15∶1，v/v/v)和正己烷：丙酮(4∶1，v/v)2種展開劑，通過薄層色譜初步分析生成的蝦青素衍生物。

1.3.4 紫外光譜掃描將蝦青素琥珀酸二酯和合成蝦青素原料各稱取10～15mg，用DMSO溶解后稀釋到適合濃度(吸光度值范圍在0.2～0.8之間)進(jìn)行光譜掃描，掃描波長(zhǎng)范圍200～800nm。

1.3.5 LC(APCI)MS/MS分析

色譜條件流動(dòng)相乙腈(A)：水(B)，溶劑梯度[22]：0～6min：40%A，60%B；7～9min：A(40%～98%)，B(2%～60%)；10～30min：A(98%)，B(2%)；30～35min：A(98%～40%)，B(2%～60%)；色譜柱：Agilent Zorbax XDB C18(150mm × 4.6mm, 5μm)，流速1mL/min；檢測(cè)器：二極管陣列檢測(cè)器(DAD)，檢測(cè)波長(zhǎng)486nm；柱溫35℃。樣品用甲醇溶解。通過液相色譜峰面積百分比計(jì)算蝦青素琥珀酸二酯的純度。

質(zhì)譜條件大氣壓化學(xué)電離源(APCI)，正離子掃描模式；干燥氣溫度350℃，干燥氣流速5L/min，蒸發(fā)室溫度400℃，霧化氣壓力40psi，毛細(xì)管電壓4500V，流速1mL/min；一級(jí)質(zhì)譜采集范圍m/z100～1200，子離子掃描采集范圍m/z100～1000。

1.3.6 核磁共振波譜分析通過硅膠柱純化得到的產(chǎn)物樣品進(jìn)行核磁共振分析以進(jìn)一步證明其結(jié)構(gòu)，溶劑采用CDCl3，溫度：室溫。1H NMR條件：掃描頻率(SF)：600 MHz，譜寬(TD)：32768，掃描次數(shù)(NS)：32；DEPTQ條件：掃描頻率(SF)：150MHz，譜寬(TD)：65536，掃描次數(shù)(NS)：28。

2結(jié)果與討論

2.1 薄層色譜分析結(jié)果

表1為10%蝦青素原料(A)和蝦青素合成反應(yīng)產(chǎn)物(B)分別在正己烷：丙酮展開劑和氯仿：甲醇：水展開劑中對(duì)應(yīng)點(diǎn)的Rf值。其中在正己烷：丙酮展開劑中B的Rf值為0.02，靠近原點(diǎn)，極性增大的原因可能是蝦青素的母體結(jié)構(gòu)連接酸酐后暴露出羧基端。在氯仿-甲醇-水的展開劑中B分離出清晰的4個(gè)點(diǎn)。

表1　薄層色譜分析結(jié)果

2.2 蝦青素琥珀酸二酯的純化結(jié)果

為驗(yàn)證蝦青素琥珀酸二酯的結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步對(duì)反應(yīng)后的產(chǎn)物采用硅膠柱進(jìn)行純化，以除去其中未反應(yīng)的蝦青素和大極性的雜質(zhì)，氯仿-甲醇硅膠柱的具體洗脫條件和結(jié)果如表2所示。

表2　洗脫條件

2.3 蝦青素琥珀酸二酯的光譜掃描結(jié)果

蝦青素和蝦青素琥珀酸二酯的光譜掃描結(jié)果如圖2所示，蝦青素的最大吸收波長(zhǎng)483 nm，蝦青素琥珀酸二酯的最大吸收波長(zhǎng)487 nm?？赡苡捎谖r青素琥珀酸二酯多了2個(gè)羧酸形成4個(gè)酯鍵致使其最大吸收波長(zhǎng)發(fā)生紅移[23]，向長(zhǎng)波方向移動(dòng)，但是其最大吸收波長(zhǎng)與蝦青素相差并不大。

圖2　蝦青素和蝦青素琥珀酸二酯的UV-Vis掃描圖

2.4 LC(APCI)MS/MS檢測(cè)蝦青素琥珀酸二酯

圖3為10%蝦青素原料、反應(yīng)后產(chǎn)物和純化后的蝦青素琥珀酸二酯的高效液相色譜圖，合成蝦青素的保留時(shí)間是15～18 min，蝦青素琥珀酸酯的保留時(shí)間是11～14 min，說明反應(yīng)后產(chǎn)物的極性增大。由峰面積所占的比例得到純化后蝦青素琥珀酸二酯的純度達(dá)95%。

圖3　蝦青素和蝦青素琥珀酸二酯的高效液相色譜圖

為驗(yàn)證生成的蝦青素衍生物的結(jié)構(gòu)，本文通過LC-(APCI)MS的一級(jí)質(zhì)譜圖和二級(jí)質(zhì)譜圖具體解析衍生物的結(jié)構(gòu)，在文獻(xiàn)[24]的研究中曾采用LC-(ESI)MS驗(yàn)證蝦青素琥珀酸二酯的分子量為796.5，但是ESI源由于能量原因不能裂解中等極性的蝦青素，所以本實(shí)驗(yàn)中采用高能量的APCI源。純化后的蝦青素琥珀酸二酯一級(jí)質(zhì)譜顯示m/z797.6為蝦青素琥珀酸二酯質(zhì)子化的準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+；m/z779.5為[M+H-H2O]+，即蝦青素琥珀酸二酯失去一分子水所產(chǎn)生的碎片離子峰。

圖4為蝦青素琥珀酸二酯的二級(jí)質(zhì)譜圖及裂解規(guī)律，分析得到蝦青素琥珀酸二酯的裂解規(guī)律是以失去琥珀酸或是失水為主要特征，其中m/z697.5為[M+H-C4H4O3]+，是蝦青素琥珀酸二酯失去一側(cè)的琥珀酸產(chǎn)生的碎片離子峰；m/z579.5和m/z561.7為蝦青素骨架的特征離子碎片?？梢耘卸ㄎr青素的主要結(jié)構(gòu)沒有在反應(yīng)中被破環(huán)。

圖4　蝦青素琥珀酸二酯的二級(jí)質(zhì)譜圖及主要碎片裂解途徑

2.5 核磁共振鑒定蝦青素琥珀酸二酯的結(jié)構(gòu)

采用1H NMR和DEPTQ譜鑒定蝦青素琥珀酸二酯的結(jié)構(gòu)。蝦青素琥珀酸二酯的1H NMR (CDCl3) 化學(xué)位移和積分結(jié)果如表3和圖5所示。再通過DEPTQ譜驗(yàn)證目標(biāo)產(chǎn)物的碳架結(jié)構(gòu)，如圖6所示，DEPTQ(CDCl3) 化學(xué)位移(δ，ppm)：194.1，176.0，171.4，161.8，142.5，139.8，136.8，135.2，134.5，133.9，130.7，128.2，124.6，123.1，71.5，59.1，50.9，42.5，39.5，37.1，30.5，29.7，29.0，28.6，26.3，22.6，20.8，14.1，13.1，12.8。經(jīng)驗(yàn)證合成反應(yīng)所生成的產(chǎn)物即蝦青素琥珀酸二酯。

圖5　蝦青素琥珀酸二酯的DEPTQ圖

質(zhì)子Proton化學(xué)位移(δ)Chemicalshift/ppm積分結(jié)果Integralresults7/7',8/8',10/10',11/11'12/12',14/14',15/15'6.75～6.1714H3/3'5.672H22/22',23/23'2.85～2.738H19/19',20/20',2/2'2.09～1.9516H17/17'1.926H16/16'1.386H18/18'1.256H

圖6　蝦青素琥珀酸二酯的結(jié)構(gòu)

3結(jié)語

本文以合成蝦青素和琥珀酸酐為原料經(jīng)三乙胺催化成功合成蝦青素琥珀酸二酯，純化后純度可達(dá)95%，通過光譜和色譜手段驗(yàn)證了蝦青素琥珀酸二酯的結(jié)構(gòu)。本實(shí)驗(yàn)以毒性相對(duì)于二氯甲烷更低的二氧六烷為反應(yīng)溶劑體系，以及成本更低的三乙胺為催化劑合成蝦青素琥珀酸二酯，此制備工藝更有利于工業(yè)化生產(chǎn)。蝦青素琥珀酸二酯作為一種中間體，相比較于蝦青素極性增大，其暴露的羧基端可使合成其他高水溶性蝦青素衍生物更加容易，為擴(kuò)展蝦青素的應(yīng)用范圍、提高蝦青素的生物利用度等提供基礎(chǔ)。

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責(zé)任編輯朱寶象

Preparation Technology of Astaxanthin Succinate Diester and its Structure Characterization

ZHANG Ting， XU Jie， ZHOU Qing-Xin， LI Xue-Min， YANG Shu， XUE Chang-Hu

(College of Food Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266003, China)

Abstract:Astaxanthin has many powerful functions including antioxidation, immune system improvement, prevention of a series of chronic diseases such as cardiovascular disease, cancer, diabetes among others. However, the limitation of astaxanthin aqueous solubility reduces its bioavailability and application range. In order to improve the aqueous solubility of astaxanthin, many other researchers committed themselves to overcome these limitations. Their trials included microencapsulation and structure improvement. Furthermore, microencapsulation has some restrictions like low transparency and inferior stability. Hence, we adopted chemical synthesis to improve astaxanthin polarity and solubility. Our researches included also the structural characterization with high performance liquid chromatography (HPLC), liquid chromatography/mass spectrometer and spectrum methods like ultraviolet spectrum scanning, nuclear magnetic resonance spectrum. In this study, astaxanthin succinate diester was synthesized with succinic anhydride and synthetic astaxanthin (the molar ratio is 10∶1), and catalyzed by triethyl amine (the molar ratio to synthetic astaxanthin is 3∶1). Then with silica gel column chromatography, the astaxanthin succinic diester was purified by eluting with chloroform: methanol (90∶10, v/v). The purity of astaxanthin succinate diester was 95% as was determined with HPLC. The maximum absorption wavelength of astaxanthin succinic diester was 487 nm which was similar to that of astaxanthin. TLC result showed that the polarity of astaxanthin succinic diester increased. The spectrum of LC-(APCI) MS/MS illustrated that the molecule weight of astaxanthin succinic diester was 796.5, and the fragment ions of astaxanthin m/z 561.5 and m/z 579.5 were discovered simultaneously. Finally, the analysis of1H NMR and DEPTQ spectrum showed that the derivative was astaxanthin succinic diester.We employed a new method for synthesizing astaxanthin succinic diester with dioxane reaction system, which possesses low toxicity and can be amplified in scale. This research systematically characterized the astaxanthin succinic diester with several chromatography and spectrum methods, which provided the basic data for future studies. Astaxanthin succinic diester terminated with carboxyl at both sides, which would magnify the polarity of astaxanthin. In addition, it would be an intermediate to synthesize with other high aqueous solubility materials such as sugars, proteins, amino acids among others, which will enlarge the application and bioavailability of astaxanthin.

Key words:astaxanthin succinate diester; preparation process; structure; liquid chromatography-mass spectrometry; nuclear magnetic resonance spectrum

DOI：10.16441/j.cnki.hdxb. 20150087

中圖法分類號(hào)：O656.5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1672-5174(2016)04-050-06

作者簡(jiǎn)介：張婷(1991-)，女，碩士生。E-mail：specialhuiyi@126.com**通訊作者： E-mail：xuech@ouc.edu.cn

收稿日期：2015-03-12；

修訂日期：2015-05-29

*基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31571864)；“泰山學(xué)者攀登計(jì)劃”專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)資助

Supported by Natural Science Foundation of China(31571864)；The Special Funds for “Taishan Scholar Climbing Plan”