應用Xpert MTB/RIF技術(shù)快速診斷膝關(guān)節(jié)結(jié)核

唐愷 董偉杰 蘭汀隆 范俊 李元 嚴廣璇 秦世炳

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·論著·

應用Xpert MTB/RIF技術(shù)快速診斷膝關(guān)節(jié)結(jié)核

唐愷 董偉杰 蘭汀隆 范俊 李元 嚴廣璇 秦世炳

目的 評價利福平耐藥實時熒光定量核酸擴增檢測技術(shù)(Xpert MTB/RIF，簡稱“Xpert”)在膝關(guān)節(jié)結(jié)核診斷中的臨床應用價值。方法 連續(xù)收集2014年1月至2015年10月在首都醫(yī)科大學附屬北京胸科醫(yī)院骨科接受手術(shù)治療的49例膝關(guān)節(jié)病變患者的關(guān)節(jié)積液標本，每份標本同時分別行涂片抗酸桿菌檢查、羅氏培養(yǎng)基培養(yǎng)、Xpert檢測。以臨床診斷為參考標準，評價Xpert檢測關(guān)節(jié)積液標本中結(jié)核分枝桿菌的敏感度和特異度。結(jié)果 以臨床診斷為參考標準，涂片、羅氏培養(yǎng)基培養(yǎng)、Xpert檢測的敏感度分別為17.2%(5/29)、31.0%(9/29)、69.0%(20/29)，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=8.34,P<0.05)；特異度分別為85.0%(17/20)、100.0%(20/20)、90.0%(18/20)。結(jié)論 Xpert檢測關(guān)節(jié)積液標本中結(jié)核分枝桿菌的敏感度高，并且可同時檢測其耐藥性，可用于快速診斷膝關(guān)節(jié)結(jié)核。

結(jié)核,骨關(guān)節(jié)； 熒光定量核酸擴增檢測技術(shù)； 聚合酶鏈反應； 診斷； 耐藥性

結(jié)核病仍是發(fā)展中國家影響人類健康的主要傳染病[1]。中國在22個結(jié)核病高負擔國家中位居第二, 而且我國也是全球27個耐多藥結(jié)核病高負擔國家之一[2]。骨關(guān)節(jié)結(jié)核是常見的肺外結(jié)核，而膝關(guān)節(jié)結(jié)核是常見的骨關(guān)節(jié)結(jié)核。膝關(guān)節(jié)結(jié)核早期多表現(xiàn)為關(guān)節(jié)積液、滑膜增生，與其他類型的關(guān)節(jié)炎如骨性關(guān)節(jié)炎、非特異性關(guān)節(jié)炎、類風濕性關(guān)節(jié)炎、色素絨毛結(jié)節(jié)性滑膜炎等不易鑒別，待晚期發(fā)展到關(guān)節(jié)軟骨脫落、骨質(zhì)破壞可導致關(guān)節(jié)毀損，致殘率很高[3]。因此，探索膝關(guān)節(jié)結(jié)核的早期診斷方法有重要的意義。

由于膝關(guān)節(jié)結(jié)核標本難以獲取、樣本含菌量低，其診斷效率不高。通常情況下，細菌學檢查是診斷的金標準，但其陽性率較低,耗時長(平均需要1～2個月)，易造成漏診或延誤診斷。病變組織的病理檢查也存在類似的問題。近10年來，分子生物學方法已經(jīng)用于檢測結(jié)核分枝桿菌DNA和相關(guān)耐藥基因突變。利福平耐藥實時熒光定量核酸擴增檢測技術(shù)(Xpert MTB/RIF， 簡稱“Xpert”)是一種基于實時聚合酶鏈反應(real-time PCR)的技術(shù)[4]，是同時進行結(jié)核分枝桿菌及利福平耐藥性檢測的自動化、全封閉檢測平臺，檢測時間僅需2 h[5-6]。2013年，WHO推薦將Xpert技術(shù)用于肺外結(jié)核的診斷[7]。然而，與痰液標本相比，膝關(guān)節(jié)結(jié)核臨床標本存在標本異質(zhì)性大、含菌量少、標本處理難度大等特點，Xpert用于檢測膝關(guān)節(jié)結(jié)核臨床標本的可行性及準確性如何，目前尚無相關(guān)報道。

本研究以英國國家衛(wèi)生醫(yī)療質(zhì)量標準署(National Institute for Health and Care Excellence，NICE)2011年制定的結(jié)核病診療與防控指南中骨關(guān)節(jié)結(jié)核臨床診斷標準[8]作為膝關(guān)節(jié)結(jié)核診斷的重要診斷標準，探索Xpert技術(shù)對于膝關(guān)節(jié)結(jié)核診斷的敏感度和特異度，以及檢測結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥基因rpoB突變的可行性與準確性。

材料與方法

一、標本收集與篩選

收集2014年1月至2015年10月在首都醫(yī)科大學附屬北京胸科醫(yī)院骨科接受手術(shù)治療的49例膝關(guān)節(jié)病變患者，通過關(guān)節(jié)穿刺或手術(shù)取得至少5 ml積液，對積液標本同時分別進行涂片抗酸桿菌檢查、羅氏培養(yǎng)基培養(yǎng)和Xpert檢測。

二、涂片抗酸桿菌檢查

將關(guān)節(jié)積液進行涂片，采用金胺染色法染色，根據(jù)WHO指南[9]用發(fā)光二極管(LED)顯微鏡(奧林巴斯，日本)進行判讀。

三、羅氏培養(yǎng)基培養(yǎng)

取約2 ml關(guān)節(jié)積液加入適量的N-乙酰-L-半胱氨酸-氫氧化鈉(N-acetyl-L-cysteine-sodium hydroxide,NAC-NaOH)(Becton Dickinson，美國)去污，4 ℃ 3000×g離心20 min。棄去上清液，采用改良羅氏固體培養(yǎng)基(Gibco，美國)對沉淀物進行平行接種，分離培養(yǎng)分枝桿菌，培養(yǎng)陽性者行菌種鑒定，并采用改良羅氏絕對濃度間接法進行11種抗結(jié)核藥物的敏感性試驗。具體操作步驟參照《結(jié)核病診斷細菌學檢驗規(guī)程》[10]，11種待測藥物的界限濃度如下(逗號前為下限濃度，逗號后為上限濃度)：異煙肼(1，10 μg/ml)、利福平(50，250 μg/ml)、鏈霉素(0，100 μg/ml)、乙胺丁醇(5，50 μg/ml)、左氧氟沙星(5，50 μg/ml)、對氨基水楊酸(1，10 μg/ml)、丙硫異煙胺(25，100 μg/ml)、帕司煙肼(0.1，1 μg/ml)、利福噴丁(5，250 μg/ml)、阿米卡星(10，100 μg/ml)、卷曲霉素(10，100 μg/ml)。

四、Xpert檢測

根據(jù)Xpert操作規(guī)程[11]，取1 ml關(guān)節(jié)積液加入2 ml標本處理液中，輕微混勻至少10 s后室溫孵育10 min；然后再次輕微混勻10 s后室溫孵育5 min。取2 ml混合液加入至一次性標本盒中，將標本盒置入4通道Gene Xpert平臺(Cepheid，美國)中自動運行。加入標本盒后約2 h，系統(tǒng)可自動讀出結(jié)核分枝桿菌檢測結(jié)果與利福平耐藥結(jié)果。

五、臨床診斷標準

NICE 2011年制定的骨關(guān)節(jié)結(jié)核臨床診斷指南[8]為：(1)病變組織結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽性；(2)病變組織病理檢查為干酪樣壞死或典型的肉芽腫或朗格漢斯巨細胞；(3)影像學包括X線攝片、CT、MRI等檢查符合結(jié)核表現(xiàn)；(4)抗結(jié)核藥物治療有效。以上4點任何一點符合即診斷為骨關(guān)節(jié)結(jié)核，均不符合者診斷為非結(jié)核性骨關(guān)節(jié)病變。

六、統(tǒng)計學分析

使用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析，以NICE骨關(guān)節(jié)結(jié)核診斷指南為臨床診斷參考標準，分別計算涂片、羅氏培養(yǎng)基培養(yǎng)和Xpert檢測膝關(guān)節(jié)積液標本中結(jié)核分枝桿菌的敏感度和特異度。敏感度=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；特異度=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%。羅氏培養(yǎng)基培養(yǎng)與Xpert的敏感度、特異度比較采用卡方檢驗(α=0.05)。

結(jié) 果

一、患者的臨床特點

49例患者的中位年齡為46歲(3～76歲)；男26例，女23例。根據(jù)前述的臨床診斷參考標準，29例患者診斷為骨關(guān)節(jié)結(jié)核、20例為非結(jié)核性骨關(guān)節(jié)病變。

二、3種方法檢測膝關(guān)節(jié)積液標本的結(jié)果

1. 涂片、羅氏培養(yǎng)基培養(yǎng)和Xpert檢測結(jié)果：見表1。

表1 49例患者關(guān)節(jié)積液標本分別采用3種方法檢測的結(jié)果

續(xù)表1

2．各種檢測方法的敏感度與特異度：按照表1結(jié)果，涂片、羅氏培養(yǎng)基培養(yǎng)和Xpert檢測的敏感度分別為：17.2%(5/29)、31.0%(9/29)、69.0%(20/29)；特異度分別為：85.0%(17/20)、100.0%(20/20)、90.0%(18/20)。Xpert檢測較羅氏培養(yǎng)基培養(yǎng)敏感度高(χ2=8.34，P<0.05)，差異有統(tǒng)計學意義；而特異度差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.53,P>0.05)。結(jié)核分枝桿菌羅氏培養(yǎng)基培養(yǎng)陽性的9例患者中，Xpert檢出8例；在羅氏培養(yǎng)基培養(yǎng)陰性而臨床診斷為結(jié)核的20例患者中，Xpert檢出12例骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者，敏感度為60.0%(12/20)。

三、Xpert檢測結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥基因的結(jié)果

22例患者的Xpert檢測結(jié)果為陽性，其中僅1例發(fā)現(xiàn)利福平耐藥基因rpoB突變，其羅氏培養(yǎng)基培養(yǎng)結(jié)果也為陽性，表型藥物敏感性試驗結(jié)果顯示為異煙肼、利福平、鏈霉素、左氧氟沙星耐藥。

討 論

膝關(guān)節(jié)結(jié)核是一種慢性進行性骨關(guān)節(jié)炎性疾病，分單純滑膜結(jié)核、單純骨結(jié)核、早期全關(guān)節(jié)結(jié)核和晚期全關(guān)節(jié)結(jié)核4種類型。因膝關(guān)節(jié)滑膜組織血供豐富，則以滑膜結(jié)核發(fā)病率較高，隨著病程的進展，最后均可導致滑膜、關(guān)節(jié)軟骨、軟骨下骨組織及關(guān)節(jié)囊全部受累而成為全關(guān)節(jié)結(jié)核。膝關(guān)節(jié)結(jié)核早期的臨床癥狀、實驗室檢查、影像學檢查等無特異性，與骨性關(guān)節(jié)炎、類風濕性關(guān)節(jié)炎、非特異性關(guān)節(jié)炎、色素絨毛結(jié)節(jié)性滑膜炎等不易鑒別。晚期膝關(guān)節(jié)結(jié)核有嚴重的關(guān)節(jié)骨質(zhì)與軟骨破壞，有不同程度的死骨、膿腫和干酪樣壞死組織形成，關(guān)節(jié)骨質(zhì)嚴重毀損，關(guān)節(jié)功能完全喪失，對患者的生活及勞動能力造成嚴重影響。早期診斷膝關(guān)節(jié)結(jié)核對患者關(guān)節(jié)功能的預后有重要意義。

傳統(tǒng)的檢查方法包括關(guān)節(jié)積液的涂片、羅氏培養(yǎng)基培養(yǎng)、病理等，檢出陽性率較低、耗時長，易造成漏診或延誤診斷。涂片檢查陽性時，關(guān)節(jié)積液標本的結(jié)核分枝桿菌濃度≥10 000個/ml；羅氏培養(yǎng)基培養(yǎng)要求標本中至少含有10～100個活菌才能得到陽性結(jié)果，而且需要6～8周時間；滑膜組織的病理檢查常提示肉芽組織慢性炎，與其他慢性關(guān)節(jié)炎不易鑒別[12]。

Xpert是一種基于real-time PCR的技術(shù)，能同時檢測結(jié)核分枝桿菌及利福平耐藥基因突變。與傳統(tǒng)方法相比，Xpert技術(shù)具有以下優(yōu)勢。

1．操作簡單，耗時短：Xpert檢測儀是自動化、全封閉檢測平臺，該儀器自動完成標本的核酸提取、純化及濃縮等試驗步驟，這一過程在密閉的標本盒中進行。對所要檢測的特定DNA序列具有很高的敏感度，輔以即時的光學檢測軟件使得一旦發(fā)現(xiàn)目標基因便可以得出結(jié)果，獲得檢測結(jié)果的時間僅為2 h。

2．敏感度、特異度高：現(xiàn)有的研究表明，Xpert檢測肺外結(jié)核標本的敏感度為87.3%～95.0%，特異度為97.0%～100.0%[5,13-14]。這些肺外結(jié)核標本包括：胸腹腔積液、腦脊液、尿液、關(guān)節(jié)積液及穿刺取得的病變組織或淋巴結(jié)組織，病變組織需進行無菌研磨后，再進行Xpert檢測。2011年，印度的Vadwai 等[13]應用Xpert檢測肺外結(jié)核標本中的結(jié)核分枝桿菌，與固體或液體培養(yǎng)做對比，其敏感度為83.0%，特異度為73.0%。2014年，南非的Scott等[15]報道的敏感度為59.0%，特異度為92.0%。土耳其和德國進行類似研究報道的敏感度和特異度分別為67.7%～77.2% 和96.2%～98.4%[16-17]。

本研究單獨對膝關(guān)節(jié)積液進行Xpert檢測，發(fā)現(xiàn)其敏感度為69.0%，特異度為90.0%。與土耳其和德國的研究結(jié)果接近。本研究中在結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽性的患者中，Xpert的敏感度為8/9，在結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陰性而臨床診斷為骨關(guān)節(jié)結(jié)核的20例患者中，Xpert的敏感度為60.0%(12/20)。說明在傳統(tǒng)方法檢測結(jié)果為陰性時，Xpert技術(shù)可以為膝關(guān)節(jié)結(jié)核診斷提供更多的客觀證據(jù)。

本研究是通過穿刺或手術(shù)取得關(guān)節(jié)積液標本進行檢測，對于無關(guān)節(jié)積液的患者，可通過穿刺或手術(shù)取得滑膜組織，然后對滑膜組織進行無菌研磨，再進行Xpert檢測，其準確性尚需進一步驗證。

3．生物安全度高：由于Xpert技術(shù)的標本盒為相對密閉的系統(tǒng)，可以大大減少對外界的污染，可提高生物安全度，具備在有條件的基層醫(yī)院開展的可行性。

4．早期診斷結(jié)核分枝桿菌耐藥：Xpert技術(shù)不僅能檢測結(jié)核分枝桿菌，而且能同時檢測利福平耐藥性。隨著耐多藥結(jié)核發(fā)病率的增高，早期獲得結(jié)核分枝桿菌的藥敏試驗結(jié)果有助于制定適宜的化療方案、縮短療程[18-19]。本研究僅發(fā)現(xiàn)1例利福平耐藥基因ropB突變患者，其表型藥物敏感性試驗結(jié)果顯示為異煙肼、利福平、鏈霉素、左氧氟沙星耐藥，兩者結(jié)果相符。由于患者例數(shù)少，還需要大樣本的試驗進一步驗證。

大多數(shù)骨關(guān)節(jié)結(jié)核診斷試驗采用結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)結(jié)果作為結(jié)核診斷的“金標準”，然而由于樣本中結(jié)核分枝桿菌含量低，其診斷效率過低。本研究采用NICE制定的臨床診斷參考標準作為膝關(guān)節(jié)結(jié)核診斷的參考標準，它綜合了結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)、組織學檢查、影像學檢查、臨床療效等因素，將結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)為陰性的部分患者診斷為膝關(guān)節(jié)結(jié)核，提高了診斷效率，但其同時也降低了特異度，而且不同的試驗，對臨床診斷標準的理解也不盡相同，由此可能得出不同的結(jié)論。

綜上所述，Xpert MTB/RIF技術(shù)具有操作簡單、耗時短、敏感度及特異度高、生物安全度高、早期診斷結(jié)核分枝桿菌耐藥等優(yōu)點。本研究為探索性驗證試驗，受限于樣本量及單中心的局限性，所得數(shù)據(jù)僅能提示Xpert MTB/RIF技術(shù)在膝關(guān)節(jié)結(jié)核診斷中有一定價值。該技術(shù)未來在膝關(guān)節(jié)結(jié)核診斷中的應用前景仍需要進行多中心、大樣本的診斷試驗進行驗證。

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(本文編輯：孟莉 范永德)

Study on rapid diagnosis of knee joint tuberculosis by Xpert MTB/RIF

TANGKai,DONGWei-jie,LANTing-long,FANJun,LIYuan,YANGuang-xuan,QINShi-bing.

DepartmentofOrthopedics,BeijingChestHospital,CapitalMedicalUniversity;BeijingBoneandJointTuberculosisDiagnosisandTreatmentCenter,Beijing101149,China

QINShi-bing,Email:qinsb@sina.com

Objective To evaluate the clinical value of Xpert MTB/RIF (Xpert) for the rapid diagnosis of knee joint tuberculosis. Methods Forty-nine joint effusion specimens from patients with knee disease admitted in Department of Orthopedic, Beijing Chest Hospital, Capital Medical University were collected from Jan. 2014 to Oct. 2015. Acid fast bacteria smear, Lowenstein-Jensen culture and Xpert detection were performed for each specimen. The sensitivity and specificity of Xpert were evaluated according to clinical diagnosis as reference standard. Results According to the clinical diagnosis as reference standard, the sensitivity of acid fast bacteria smear, Lowenstein-Jensen culture and Xpert were 17.2% (5/29),31.0% (9/29) and 69.0% (20/29), and the difference was significant (χ2=8.34,P<0.05); the specificity were 85.0% (17/20),100.0% (20/20), and 90.0% (18/20), respectively. Conclusion Xpert has high sensitivity in diagnosis of joint effusion infected by Mtb and detects simultaneously the drug resistance. It can be used to diagnose rapidly for knee joint tuberculosis.

Tuberculosis, osteoarticula; GeneXpert MTB/RIF； Polymerase chain reaction； Diagnosis; Drug resistance

10.3969/j.issn.1000-6621.2016.04.014

北京市科技計劃課題(D141107005214002)

101149 首都醫(yī)科大學附屬北京胸科醫(yī)院骨科 北京骨關(guān)節(jié)結(jié)核診療中心

秦世炳，Email：qinsb@sina.com

2016-01-12)