高滲環(huán)境假絲酵母胞內(nèi)甘油和海藻糖代謝研究

倪松，王聰，宋旭，高品，侯麗華（1．天津出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢測中心，天津300461；．天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津300457）

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高滲環(huán)境假絲酵母胞內(nèi)甘油和海藻糖代謝研究

倪松1，2，王聰2，宋旭1，*，高品2，侯麗華2
（1．天津出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢測中心，天津300461；2．天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津300457）

摘要：研究高滲環(huán)境中假絲酵母（T酵母）細胞內(nèi)海藻糖和甘油的代謝情況。利用微波破碎法這一傳統(tǒng)的物理破壁法來提取T酵母細胞內(nèi)甘油和海藻糖，并通過高效液相色譜儀測定細胞內(nèi)甘油和海藻糖的含量。經(jīng)過高效液相色譜測定，可以得到不同鹽濃度下T酵母胞內(nèi)甘油和海藻糖含量。T酵母在高滲環(huán)境中通過對甘油和海藻糖的積累，同時阻止甘油的外排作用來抵抗外界環(huán)境對其生長的影響。

關(guān)鍵詞：假絲酵母；甘油；海藻糖；高效液相色譜

假絲酵母能在高滲透壓環(huán)境中存活引起了人們關(guān)注[1]。在1976年，Brown提出了相容溶質(zhì)可以在高滲透壓環(huán)境中對細胞起到保護作用[2]。之后，Brown[3]和Crowe[4]報道了甘油和海藻糖對保護細胞內(nèi)可溶性酶和細胞膜穩(wěn)定性起作用。在Kuniho NaKata[5]和Sukesh[6]對酵母耐鹽生長試驗中，發(fā)現(xiàn)了酵母通過合成海藻糖來抵抗高滲環(huán)境。目前，國內(nèi)主要研究魯氏酵母（S酵母）的耐鹽機理，很少研究T酵母[7]。本文將研究假絲酵母在高滲透壓環(huán)境中細胞內(nèi)海藻糖和甘油的代謝情況，為今后研究T酵母耐鹽機理提供參考。

1　材料與設(shè)備

1.1菌株

醬油發(fā)酵過程中的耐鹽產(chǎn)香酵母假絲酵母、米曲霉3.042來源于天津科技大學(xué)菌種保藏室。

1.2試劑

海藻糖為分析純：北京索萊寶科技有限公司；甘油為分析純：天津市天大化工實驗廠；酵母提取物為分析純：英國賽默飛世爾科技；乙腈為色譜純：天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心；氯化鈉、蛋白胨、葡萄糖等試劑均為分析純：天津市化學(xué)試劑一廠。

1.3儀器設(shè)備

LRH-250-A生化培養(yǎng)箱：廣東省醫(yī)療器械廠；721型可見分光光度計：上海舜宇衡平科學(xué)儀器廠；冷凍離心機：Thermo Scientific，美國；微波爐：LG公司，韓國；微量進樣器：Socorex，瑞士；高效液相色譜儀LC-20A型：島津公司，日本。

1.4方法

1.4.1不同鹽濃度條件下酵母生長曲線的測定

取培養(yǎng)到對數(shù)期的假絲酵母菌懸液，將其按初始5×106cfu/mL的濃度分別接入到200 mL的0 %、8 %、16 %鹽濃度的YPDN培養(yǎng)基中，30℃，180r/min恒溫培養(yǎng)。自接種時間起每隔12 h取一次樣，用紫外可見分光光度計在600 nm處測其吸光值[8]。

1.4.2酵母胞內(nèi)甘油和海藻糖的提取

將不同時間點取得的樣品1 mL離心洗滌，取其中一管的假絲酵母菌菌體在80℃的烘箱中烘至恒重，計算每毫升發(fā)酵液中菌體的干重[9]。取另外一管的假絲酵母菌體利用微波破碎法[10]進行胞內(nèi)甘油和海藻糖的提取。使用功率為700 W的微波爐進行破碎，每次微波處理時間為1min，時間間隔為30 s。然后加入1 mL的去離子水，渦旋1min。然后在冰浴條件下反復(fù)抽提3次，每次20min。抽提完畢后離心。吸取上清液過0.22 μm的微孔濾膜過濾，過濾完成后的抽提液即可用于測定酵母胞內(nèi)甘油和海藻糖的含量。酵母胞內(nèi)甘油和海藻糖含量是每克菌體中所含的二者的質(zhì)量。

1.4.3甘油、海藻糖標準曲線的制作

分別準確稱取甘油標品1.5 g，海藻糖標品1.0 g（精確至0.000 2 g），其中海藻糖在稱量之前在60℃條件下干燥5 h。用70 %的乙腈溶液溶解甘油和海藻糖并最終定容到100 mL的容量瓶中。再以配制好的甘油和海藻糖標準液為基礎(chǔ)，分別稀釋成3、6、9、12、15 mg/mL的甘油標準液和2、4、6、8、10 mg/mL的海藻糖標準液。利用高效液相色譜檢測標品中的標準品的含量，色譜柱為Inertsil氨基柱，5 μm，4.6 mm×300 mm。色譜柱柱溫為30℃；流速為1.00 mL/min；檢測器為示差檢測器RID-10A；進樣量為10 μ。

1.4.4樣品中甘油、海藻糖含量的測定

色譜柱為Inertsil氨基柱，5 μm，4.6 mm×300 mm。色譜柱柱溫為30℃；流速為1.00 mL/min；檢測器為示差檢測器RID-10A；進樣量為10 μ[11-12]。流動相為70 %過膜后的乙腈。將不同時間點提取的胞內(nèi)外甘油和海藻糖樣品依次進樣，并將得到的色譜圖利用島津工作站[13]進行數(shù)據(jù)分析，確定保留時間和相對應(yīng)的峰面積。根據(jù)測得的峰面積代入到標準曲線求出樣品中甘油和海藻糖的含量。

2　結(jié)果與討論

2.1不同鹽濃度條件下酵母生長情況

由于酵母進入高滲環(huán)境時會迅速產(chǎn)生相應(yīng)的保護機制來適應(yīng)環(huán)境的變化，因此為了確定酵母對環(huán)境適應(yīng)的時間區(qū)段，有必要對其生長曲線進行測定確定酵母生長各個時期的時間區(qū)段。酵母的生長曲線見圖1。

由圖1可以清楚地看到酵母在12 h之后陸續(xù)進入對數(shù)期[14]，開始進行大規(guī)模的生長。在此之前酵母菌已經(jīng)產(chǎn)生對環(huán)境的適應(yīng)能力，因此選擇在12 h之內(nèi)選取時間點來對酵母的耐高滲能力進行研究。

圖1　不同鹽濃度條件下酵母生長曲線的測定Fig.1 The growth curve of T yeast under the different salt concentration

2.2酵母胞內(nèi)甘油和海藻糖含量的測定

2.2.1甘油和海藻糖標準曲線的測定

甘油和海藻糖的標準曲線圖見圖2。

圖2?。╝）甘油的標準曲線；（b）海藻糖的標準曲線Fig.2（a）The glycerol standard curve；（b）The trehalose standard curve

利用高效液相色譜對假絲酵母胞內(nèi)甘油含量進行測定，T酵母胞內(nèi)甘油含量見圖3。

由圖3可以觀察到0 %NaCl濃度下胞內(nèi)甘油在第1小時時達到最高，然后在后面的4 h內(nèi)下降達到最低點，在第5小時到第8小時胞內(nèi)甘油含量開始上升，在第8小時后胞內(nèi)甘油含量下降，到第11小時時胞內(nèi)甘油含量趨于平穩(wěn)。8 %NaCl濃度下第1小時胞內(nèi)甘油含量比0 %第1小時降低61.5 %，在前6 h內(nèi)胞內(nèi)甘油含量一直降低，在第6小時到第8小時胞內(nèi)甘油又逐漸升高，但都比另外兩個鹽濃度下含量低，此后下降，到第11小時時小幅度上升。16 %NaCl開始與0 %相同，但此后到第5小時在直線下降，第5小時到第8小時又在上升，但胞內(nèi)甘油含量處于0 %和8 %之間。第8小時后逐漸下降，第11小時后趨于平穩(wěn)。

圖3　T酵母胞內(nèi)甘油含量的測定Fig.3 The content of glycerol in the T yeast cell

2.2.3T酵母胞內(nèi)海藻糖含量的測定

利用高效液相色譜對假絲酵母胞內(nèi)海藻糖含量進行測定，T酵母胞內(nèi)海藻糖含量見圖4。

圖4　T酵母胞內(nèi)海藻糖含量的測定Fig.4 The content of trehalose in the T yeast cell

由圖4可以觀察到假絲酵母在0 %NaCl濃度下，胞內(nèi)海藻糖在開始的6 h內(nèi)波動并且下降趨勢非常緩慢，在6 h后海藻糖含量直線下降。8 %NaCl濃度下胞內(nèi)前6 h與0 %NaCl條件下波動類似，后6 h平緩下降但胞內(nèi)海藻糖含量都比0 %時高。而16 %NaCl濃度下，胞內(nèi)海藻糖含量在第2小時時達到峰值，在前4 h胞內(nèi)海藻糖含量都比0 %、8 %NaCl濃度下的高，2 h后一直下降，第5小時降到最低，在第5小時到第7小時時胞內(nèi)海藻糖的含量又逐漸升高，第8小時后海藻糖含量逐漸降低，但也都比另兩個濃度下胞內(nèi)海藻糖含量高。

3　結(jié)論

通過對不同鹽度培養(yǎng)條件下酵母胞內(nèi)甘油和海藻糖含量的測定發(fā)現(xiàn)，T酵母在12 h的時候進入指數(shù)生長期，說明酵母在12 h之內(nèi)已經(jīng)完成了對高滲環(huán)境的適應(yīng)，而在此期間比較適合選作用來對T酵母的耐高滲環(huán)境進行研究。利用高效液相色譜法測定發(fā)現(xiàn)高滲透壓會誘導(dǎo)細胞迅速產(chǎn)生大量的海藻糖和甘油，培養(yǎng)基中的滲透壓越高，胞內(nèi)海藻糖和甘油也越高[15]。T酵母在高滲環(huán)境中通過對甘油和海藻糖的積累，同時阻止甘油的外排作用來抵抗外界環(huán)境對其生長的影響。其中甘油的作用相對較小，而海藻糖在其耐高滲的過程中起著主要的作用。鹽度越高，甘油的合成量越大。

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Metabolism of Glycerol and Trehalose in the Cells of Candida Versatilis in Hypertonic Environment

NI Song1，2，WANG Cong2，SONG Xu1，*，GAO Pin2，HOU Li-Hua2
（1.Animal，Plant and Foodstuffs Inspection Center，Tianjin Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Tianjin 300461，China；2.College of Food Engineering and Biotechnology，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China）

Abstract：To study the metabolism of trehalose and glycerol in the cells of Candida Versatilis（T yeast）in the high osmotic environment.Using microwave crushing method the traditional physical wall breaking method to extract t yeast intracellular glycerol and trehalose，and by high performance liquid chromatography for the determination of the content of intracellular glycerol and trehalose.The contents of glycerol and trehalose in T yeast cells under different salt concentrations were determined by HPLC.The accumulation of glycerol and trehalose in the hypertonic environment of T yeast was also prevented by blocking the efflux of glycerol.

Key words：T yeast；glycerol；trehalose；HPLC

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.05.033

作者簡介：倪松（1992—），男（漢），助理工程師，本科，研究方向：微生物檢測和發(fā)酵。

*通信作者：宋旭（1990—），男（漢），助理工程師。

收稿日期：2015-09-01