液質(zhì)法測定進(jìn)口豬產(chǎn)品中萊克多巴胺殘留量

陳丹萍，謝應(yīng)新，曹曉燕，楊富春，張寶元（佛山出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣東佛山528000）

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液質(zhì)法測定進(jìn)口豬產(chǎn)品中萊克多巴胺殘留量

陳丹萍，謝應(yīng)新，曹曉燕，楊富春，張寶元
（佛山出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣東佛山528000）

摘要：建立了高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定進(jìn)口豬產(chǎn)品中萊克多巴胺殘留量。樣品經(jīng)乙酸銨溶液提取，加入β-鹽酸葡萄糖醛苷酶-芳基硫酸酯酶酶解后，通過MCX固相萃取小柱凈化，采用電噴霧離子源及多反應(yīng)監(jiān)測模式進(jìn)行檢測。萊克多巴胺在0.25 μg/kg～5 μg/kg范圍內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R大于0.99，本方法的定量檢出限為0.5 μg/kg。在3個(gè)濃度水平進(jìn)行添加回收試驗(yàn)，回收率為80.4%～96.3%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.95%～6.23%。

關(guān)鍵詞：液質(zhì)法；豬產(chǎn)品；萊克多巴胺

萊克多巴胺是一種苯乙醇胺類β-受體激動(dòng)劑，它能改變養(yǎng)分的代謝途徑，促進(jìn)動(dòng)物肌肉生長，提高飼料利用率，促進(jìn)動(dòng)物體蛋白質(zhì)沉積，提高瘦肉率[1-4]。美國FDA在2010年批準(zhǔn)萊克多巴胺可以用于動(dòng)物營養(yǎng)重新配劑，廣泛地用于畜牧業(yè)和養(yǎng)殖業(yè)。由于動(dòng)物源食品中β-受體激動(dòng)劑類藥物在人體的累積超過一定量易出現(xiàn)各種毒副作用，對人體健康造成危害[5]。因此歐盟、中國等國家禁止將萊克多巴胺作為飼料添加劑用于食用動(dòng)物，我國農(nóng)業(yè)部第176號(hào)公告《禁止在飼料和動(dòng)物飲用水中使用的藥物品種目錄》明確禁止萊克多巴胺等藥物在食品動(dòng)物中的使用[6-8]。萊克多巴胺是我國對進(jìn)口豬產(chǎn)品的重點(diǎn)檢驗(yàn)項(xiàng)目，為了有效監(jiān)控動(dòng)物組織中的萊克多巴胺，本文采用高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法對進(jìn)口豬產(chǎn)品中萊克多巴胺的殘留檢測進(jìn)行了研究。

1　材料與方法

1.1材料、試劑與儀器

進(jìn)口市售豬產(chǎn)品：豬排、豬腎等。

萊克多巴胺標(biāo)準(zhǔn)品（100 μg/mL）：農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測所；萊克多巴胺內(nèi)標(biāo)D3-萊克多巴胺標(biāo)準(zhǔn)品（100 μg/mL）：Dr.Eh-renstorfer；β-鹽酸葡萄糖醛苷酶-芳基硫酸酯酶：Merck KGaA公司；乙酸銨溶液（0.2 moL/L）：廣州化學(xué)試劑廠；甲醇、乙腈為色譜純：Fisher scientific，其余試劑（分析純）：廣州化學(xué)試劑廠。

Agilent 1200 HPLC/6410 QQQ TripleQuad MS型高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國安捷倫科技有限公司；2-16K型高速冷凍離心機(jī)：德國Sigma公司；SW22型電熱恒溫振蕩水槽：德國JULABO公司；SPE固相萃取裝置：北京振翔科技有限公司；MTN-2800W型水浴氮吹儀：天津澳特賽恩斯。

1.2方法

1.2.1酶解及提取

準(zhǔn)確稱取2.00g樣品于30mL離心管內(nèi)，加入50μL D3-萊克多巴胺標(biāo)準(zhǔn)工作液，然后加入pH 5.2的0.2 moL/L乙酸銨溶液8.0 mL，再加入β-鹽酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶40 μL，渦旋混勻2min，于電熱恒溫振蕩水槽內(nèi)設(shè)定溫度37℃避光水浴振蕩16 h。酶解后放置至室溫，渦旋混勻，10 000r/min高速離心10min，取上清液于另一離心管內(nèi)，加入0.1 moL/ L高氯酸溶液5 mL，渦旋混勻，用高氯酸調(diào)pH至1后10 000r/min高速離心10min沉淀蛋白，上清液調(diào)pH 至9后用乙酸乙酯提取，取出有機(jī)相氮?dú)獯蹈珊笥? %甲酸溶液5 mL溶解，待凈化。

1.2.2凈化

將MCX固相萃取柱與固相萃取裝置相連接，依次用甲醇、水、2 %甲酸溶液各3 mL活化，然后取上述提取液過柱，再依次用2 %甲酸溶液、甲醇各3 mL淋洗，抽干，用3 %氨水甲醇溶液2.5 mL洗脫，洗脫液在45℃下用氮?dú)獯蹈桑眉状?0.1 %甲酸溶液（10+90，體積比）0.2 mL溶解渦旋混勻，10 000r/min高速離心10min，取上清液待測。

1.2.3儀器工作條件

1.2.3.1液相色譜條件

色譜柱：XB-C18（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10 μL。流動(dòng)相：A為0.1 %甲酸乙腈溶液，B為0.1 %甲酸水溶液；梯度洗脫：0～1min，維持4 %A；1min～10min，4 %A線性變化至60 %A；10min～11min，60 %A線性變化至4 %A；流速：0.3 mL/min。

1.2.3.2質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源；掃描方式：正離子掃描；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測；MS1/MS2溫度：100℃；電離電壓：4 kV；霧化氣溫度：350℃；霧化氣流速：10 L/min；噴霧氣流壓力：40 psi（1 psi=6.895×103Pa）。萊克多巴胺定性、定量離子對及碎裂電壓、碰撞能量見表1。

表1　萊克多巴胺定性、定量離子對及碎裂電壓、碰撞能量Table 1 Ractopamine qualitative and quantitative ion pair，ion fragmentation voltage，collision energy

2　結(jié)果與分析

2.1提取條件的選擇

萊克多巴胺在機(jī)體內(nèi)經(jīng)過代謝后終產(chǎn)物主要以共軛化合物形式存在，通常使用酶對組織進(jìn)行水解，使之從結(jié)合態(tài)轉(zhuǎn)為游離態(tài)，以利于溶劑的提取。由于萊克多巴胺為苯乙醇胺類化合物，在酸性條件下它們均以離子態(tài)存在，易溶于水，適合用酸溶液提取，本試驗(yàn)采用高氯酸溶液作為提取溶劑有較高的提取效率并能有效的沉淀蛋白。由于在堿性條件下易溶于有機(jī)溶劑，本試驗(yàn)采用乙酸乙酯作為提取溶劑，酸度對萃取效率的影響很大，故測定了pH在7.0～14.0之間不同的萃取效應(yīng)，結(jié)果表明，當(dāng)pH在9～10時(shí)，能達(dá)到最佳的萃取效應(yīng)。

2.2凈化條件的選擇

固相萃取是目前常用的樣品凈化方法，由于萊克多巴胺在中性至酸性條件下呈陽離子狀態(tài)，故本試驗(yàn)選用MCX固相萃取柱，為混合型陽離子交換固相萃取小柱，它對堿性化合物具有高的選擇性和靈敏度。

2.3色譜及質(zhì)譜條件的優(yōu)化

試驗(yàn)比較了XB-C18柱和BEH-HILIC柱的分離效果，XB-C18柱對萊克多巴胺有較好的分離效果，因此選擇了XB-C18柱進(jìn)行分離。本試驗(yàn)選用多反應(yīng)監(jiān)測模式進(jìn)行檢測是為了提高靈敏度、特異性和準(zhǔn)確度，通過優(yōu)化質(zhì)譜條件，選擇了105 V碎裂電壓和36、12 eV碰撞能量。

2.4線性與最低檢測限

由于空白基質(zhì)對萊克多巴胺存在明顯離子抑制現(xiàn)象[9]，為了補(bǔ)償該效應(yīng)對定量結(jié)果的影響，本法采用將空白樣品添加標(biāo)準(zhǔn)溶液按樣品前處理方法處理，制備校準(zhǔn)曲線。該校準(zhǔn)方法對待測物可彌補(bǔ)一定的提取率。

空白樣品添加標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：分別準(zhǔn)確量取萊克多巴胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液5、10、20、40、100 μL，添加到2 g空白樣品中，制得濃度為0.25、0.5、1.0、2.0、5.0 μg/kg的空白添加樣品，按上述試驗(yàn)步驟操作，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定。內(nèi)標(biāo)溶液濃度為2.5 μg/kg。以峰面積響應(yīng)值為縱坐標(biāo)（Y），萊克多巴胺組織濃度為橫坐標(biāo)（X），濃度在0.25 μg/kg～5 μg/kg的范圍內(nèi)具有較好的線性，線性回歸方程為Y=0.731 1X+0.028 2，回歸系數(shù)R＞0.99，按10倍信噪比計(jì)算方法的定量檢出限為0.5 μg/kg。萊克多巴胺標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

2.5回收率與精密度

在空白豬肉樣品和空白豬腎樣品中添加0.5、1.0、5.0 μg/kg 3個(gè)濃度水平的萊克多巴胺標(biāo)準(zhǔn)溶液。按上述方法每個(gè)濃度平行測定6次，結(jié)果見表2。

豬肉樣品在0.5、1.0、5.0 μg/kg 3個(gè)添加水平的平均回收率在88 %～96.3 %之間，6次平行測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.95 %～5.35 %之間。豬腎樣品在0.5、1.0、5.0 μg/kg 3個(gè)添加水平的平均回收率在80.4 %～91.6 %之間，6次平行測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在3.73 %～6.23 %之間。

圖1　萊克多巴胺標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Ractopamine standard curve

表2　3個(gè)添加水平回收試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Three added level recovery test results

3　結(jié)論

本研究建立了高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定進(jìn)口豬產(chǎn)品中萊克多巴胺殘留量，線性關(guān)系良好，準(zhǔn)確度和精密度高，定量檢測限低，方法準(zhǔn)確、可靠，可作為進(jìn)口豬產(chǎn)品中萊克多巴胺殘留的檢測方法。

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Determination of Ractopamine Residues in Imported Porcine Products by LC-MS/MS

CHEN Dan-ping，XIE Ying-xin，CAO Xiao-yan，YANG Fu-chun，ZHANG Bao-yuan
（Foshan Entry-Exit Inspection & Quarantine Bureau，F(xiàn)oshan 528000，Guangdong，China）

Abstract：A high Performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry（LC-MS/MS）was developed for determining the ractopamine residuals in imported porcine products.The sample was extracted with CH3COONH solution and hydrolyzed with mixed solution of β-glucuronidase and aryl sulfatase，purified by passing through MCX SPE column.ESI was adopted and the sample was detected by the multiple reaction monitoring mode.The concentration of ractopamine presented a good linear relationship in the concentration range of 0.25 μg/kg to 5 μg/kg，related coefficient R＞0.99，and the limit of quantitation was 0.5 μg/kg.The recoveries of three concentration levels were within 80.4 %-96.3 % and RSDs ranging from 0.95 %-6.23 %.

Key words：LC-MS/MS；porcine products；ractopamine

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.05.030

作者簡介：陳丹萍（1983—），女（漢），工程師，大學(xué)本科，研究方向：食品安全與檢測。

收稿日期：2015-04-07