磁性酶聯(lián)免疫吸附法檢測玉米中黃曲霉毒素B1

管笛，亢子佳，賈迪，武會(huì)娟，*（1.北京市理化分析測試中心，北京100089；2.北京市基因測序與功能分析工程技術(shù)研究中心，北京100089；3.北京市食品安全分析測試工程技術(shù)研究中心，北京100089）

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磁性酶聯(lián)免疫吸附法檢測玉米中黃曲霉毒素B1

管笛1，2，3，亢子佳1，2，3，賈迪1，2，3，武會(huì)娟1，2，3，*
（1.北京市理化分析測試中心，北京100089；2.北京市基因測序與功能分析工程技術(shù)研究中心，北京100089；3.北京市食品安全分析測試工程技術(shù)研究中心，北京100089）

摘要：本研究將磁微粒替代酶標(biāo)板作為固定相，用于酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測玉米中的黃曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，AFB1）。我們進(jìn)行了兩類比較：第一類是以單克隆抗體為基礎(chǔ)的間接競爭法，2.8 μm磁微粒的引入，使檢測限較常規(guī)方法低近5倍，為0.028 ng/mL；第二類是以單克隆抗體為基礎(chǔ)的直接競爭法，分別利用200 nm、2.8 μm粒徑的羧基磁微粒與抗體偶聯(lián)，經(jīng)測定，2.8 μm磁微粒較常規(guī)ELISA法檢測限低4.3倍，為0.012ng/mL。玉米樣品中AFB1回收率范圍在84.2%～125.9%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于12.3%。

關(guān)鍵詞：磁微粒；黃曲霉毒素；酶聯(lián)免疫吸附法；玉米

*通信作者

黃曲霉毒素主要是由黃曲霉菌（Aspergillusflavs）、寄生曲霉菌（Aspergillusparasiticus）和集蜂曲霉（Aspergillusnonius）產(chǎn)生的一組結(jié)構(gòu)類似的次生代謝產(chǎn)物，廣泛存在于農(nóng)產(chǎn)品、食品、及飼料中，對人類和動(dòng)物表現(xiàn)出很高的毒性和強(qiáng)致癌性[1-4]。目前，已經(jīng)分離出的黃曲霉毒素及其衍生物的種類有20多種，其中18種的化學(xué)結(jié)構(gòu)已經(jīng)明確[5]，黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1、M2為最常見的6種黃曲霉毒素。黃曲霉毒素中黃曲霉毒素B1的毒性、致癌性與污染頻率最強(qiáng)，對人類危害最大。AFB1被世界衛(wèi)生組織癌癥研究機(jī)構(gòu)列為I類致癌物質(zhì)[6]，基于此世界上已有100多個(gè)國家對食品及農(nóng)產(chǎn)品中AFB1的含量進(jìn)行嚴(yán)格限量[7]。因此迫切需要有效的檢測技術(shù)來保障公眾的消費(fèi)安全及農(nóng)產(chǎn)品進(jìn)出口貿(mào)易順暢。

目前檢測AFB1的方法主要有儀器分析法和免疫學(xué)分析法。儀器分析法測定具有準(zhǔn)確度高，抗干擾能力好的優(yōu)點(diǎn)，主要用于檢測部門的確證性分析[8-12]；免疫學(xué)方法檢測快速、樣本處理簡單、對技術(shù)人員要求不高、檢測成本低、可同時(shí)檢測大批量樣本等優(yōu)點(diǎn)，適用于大量樣本快速定量篩查[13]。酶聯(lián)免疫吸附法（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）作為免疫學(xué)方法之一已經(jīng)廣泛應(yīng)用于AFB1檢測過程中[14-16]。

本研究將超順磁微粒應(yīng)用到ELISA法中，替代酶標(biāo)板作為固相載體，使免疫反應(yīng)從二維到三維立體反應(yīng)，以期提高檢測靈敏度，促進(jìn)AFB1檢測技術(shù)的發(fā)展，對控制黃曲霉毒素的污染具有重要意義。

1　材料與方法

1.1試劑

AFB1標(biāo)準(zhǔn)溶液，牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin，BSA），AFB1-BSA，Tween-20，2-（N-嗎啡啉）乙磺酸（MES），EDC（1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亞胺鹽酸鹽），羊抗鼠IgG-HRP酶標(biāo)二抗，3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺：均購于美國Sigma-Aldrich公司；N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）：購于PIERCE公司；AFB1-HRP偶聯(lián)物：購于美國Beacon公司；2.8 μm粒徑磁微粒：購于Invitrogen公司；200 nm羧基磁微粒：購于美國Quantum量子科學(xué)儀器公司；96孔可拆卸酶標(biāo)板：購于Corning公司；氯化鉀，氯化鈉，磷酸氫二鉀，磷酸二氫鈉，甲醇：購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；試驗(yàn)用水均為超純水。

1.2方法

1.2.1AFB1-BSA磁微粒偶聯(lián)物的制備

取2.8 μm粒徑磁微粒165 μL，用pH=9.5硼酸緩沖液洗滌兩次，棄去溶液；加入100 μL質(zhì)量濃度為1 mg/mL的AFB1-BSA，加pH=9.5硼酸緩沖液至終體積為150 μL，旋渦輕輕混勻，再加入100 μL含3 mol/L硫酸銨的pH=9.5硼酸緩沖液，搖床210r/min，37℃反應(yīng)18h；用磁鐵吸附磁微粒，棄去反應(yīng)溶液，加入1mL 含0.5 %BSA的PBS緩沖液，搖床210r/min，37℃反應(yīng)1 h；利用磁鐵吸附，棄去溶液；用含0.5 % BSA的PBS緩沖液洗滌兩次，加入330 μL 0.5 % BSA、0.05 %硫柳汞的PBS緩沖液，4℃保存待用。

1.2.2AFB1單克隆抗體磁微粒偶聯(lián)物的制備

AFB1單克隆抗體分別與兩種不同粒徑的磁微粒偶聯(lián)。

AFB1單克隆抗體與2.8 μm粒徑磁微粒的偶聯(lián)。取165 μL 2.8 μm粒徑磁微粒，用pH=9.5硼酸緩沖液洗滌兩次，棄去溶液；加入50 μL質(zhì)量濃度為2 mg/mL 的AFB1單克隆抗體，加pH=9.5硼酸緩沖液至終體積為150 μL，旋渦輕輕混勻，再加入100 μL含3 mol/L硫酸銨的pH=9.5硼酸緩沖液，搖床210r/min，37℃反應(yīng)18h；用磁鐵吸附磁微粒，棄去反應(yīng)溶液，加入1 mL 含0.5 % BSA的PBS緩沖液，搖床210r/min，37℃反應(yīng)1 h；利用磁鐵吸附，棄去溶液；用含0.5 % BSA的PBS緩沖液洗滌兩次，加入330 μL 0.5 % BSA、0.05 %硫柳汞的PBS緩沖液，4℃保存待用。

AFB1單克隆抗體與200 nm粒徑磁微粒的偶聯(lián)。以pH4.7，0.1 mol/L的MES溶液（稱取1.066 g MES，0.45 g NaCl溶于50 mL純水，調(diào)pH至4.7）作為活化緩沖溶液，取100μL磁微粒溶液于2mL離心管中，利用磁鐵吸附，待完全吸附后，棄去液體，加入500μL活化緩沖溶液，漩渦振蕩器上混勻；磁鐵吸附，待完全吸附后，棄去液體，重復(fù)洗滌兩遍后，向磁微粒中加入0.96mg EDC、1.15 mg NHS和200 μL活化緩沖溶液，37℃，120r/min，搖床振蕩30min；用活化緩沖溶液洗滌兩遍，除去未反應(yīng)的活化劑，并更換新的2 mL離心管。將pH8.5，濃度為50mmol/L的硼酸緩沖液作為偶聯(lián)緩沖液。用500 μL的偶聯(lián)緩沖液洗滌磁珠兩遍，加入100 μg AFB1單克隆抗體至偶聯(lián)緩沖液終體積為400 μL，37℃，120r/min，搖床振蕩3 h。

封閉加入100 μL的BSA溶液（BSA事先溶解在偶聯(lián)緩沖液中）至BSA終濃度為5 mg/mL，對免疫磁微粒表面沒有偶聯(lián)抗體的活化基團(tuán)進(jìn)行封閉，并且通過BSA的物理吸附，封閉其它空間位點(diǎn)，降低在之后實(shí)驗(yàn)中可能發(fā)生的非特異性吸附。37℃，120r/min，搖床振蕩30min。利用磁鐵吸附，棄去溶液；用含0.5 % BSA的PBS緩沖液洗滌兩次，加入330 μL 0.5 % BSA、0.05 %硫柳汞的PBS緩沖液，4℃保存待用。

1.2.3AFB1間接競爭ELISA方法

將AFB1-BSA溶于pH=9.5的碳酸鹽緩沖液中至質(zhì)量濃度為0.5 μg/mL，加入酶標(biāo)板中，100 μL/孔，4℃過夜。PBST溶液洗板3次后，每孔加入200 μL 1.5 % BSA封閉液，37℃孵育2 h。PBST溶液洗板3次后，每孔加入50 μL樣品/標(biāo)準(zhǔn)品溶液，50 μL羊抗鼠IgG-HRP酶標(biāo)二抗，50 μL AFB1抗體溶液，37℃反應(yīng)15min。PBST溶液洗板5次后，每孔加入100 μL顯色液，37℃反應(yīng)10min后，每孔加入50 μL 2 mol/L硫酸終止反應(yīng)，450 nm下測定吸收值。

1.2.4AFB1直接競爭ELISA方法

AFB1直接競爭ELISA法分別采用兩種抗體，單克隆抗體與多克隆抗體。

單克隆抗體直接競爭反應(yīng)為將羊抗鼠抗體溶于pH=9.5的碳酸鹽緩沖液中至質(zhì)量濃度為30 μg/mL，加入酶標(biāo)板中，100 μL/孔，4℃過夜。PBST溶液洗板3次后，每孔加入200 μL 1.5 % BSA封閉液，37℃孵育2 h。PBST溶液洗板3次后，每孔加入50 μL樣品/標(biāo)準(zhǔn)品溶液，50 μL AFB1-HRP偶聯(lián)物，50 μL AFB1單克隆抗體溶液，37℃反應(yīng)15min。PBST溶液洗板5次后，每孔加入100 μL顯色液，37℃反應(yīng)10min后，每孔加入50 μL 2 mol/L硫酸終止反應(yīng)，450 nm下測定吸收值。

1.2.5基于AFB1磁微粒的間接競爭ELISA法

向96孔板每孔中加入200 μL 1.5 % BSA溶液，37℃孵育2 h。PBST溶液洗板3次后，每孔加入50 μL樣品/標(biāo)準(zhǔn)品溶液，50 μL羊抗鼠IgG-HRP酶標(biāo)二抗，15 μg AFB1-BSA磁微粒偶聯(lián)物，50 μL AFB1抗體溶液，放入搖床中，37℃，150r/min，反應(yīng)15min。然后清洗磁微粒，清洗方法同文獻(xiàn)[17]。每孔加入100 μL顯色液，放入搖床中，37℃，150r/min，反應(yīng)10min后，每孔加入50 μL 2 mol/L硫酸終止反應(yīng)，450 nm下測定吸收值。

1.2.6基于AFB1磁微粒的直接競爭ELISA法

基于AFB1單克隆抗體的ELISA法應(yīng)用兩種磁微粒，分別是200 nm和2.8 μm羧基磁微粒。向96孔板每孔中加入200 μL 1.5 % BSA溶液，37℃孵育2 h。PBST溶液洗板3次后，每孔加入50 μL樣品/標(biāo)準(zhǔn)品溶液，50 μL AFB1-HRP偶聯(lián)物，15 μg AFB1單克隆抗體-200 nm磁微粒偶聯(lián)物（2.8 μm磁微粒偶聯(lián)物使用量為20 μg），放入搖床中，37℃，150r/min，反應(yīng)15min。然后清洗磁微粒，清洗方法同文獻(xiàn)[17]。每孔加入100 μL顯色液，放入搖床中，37℃，150r/min，反應(yīng)10min后，每孔加入50 μL 2 mol/L硫酸終止反應(yīng)，450 nm下測定吸收值。

1.2.7標(biāo)準(zhǔn)曲線建立與數(shù)據(jù)處理

取AFB1標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行梯度稀釋，利用以上方法分別建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。溶液吸收值通過酶標(biāo)儀在450nm下測定，并作圖。橫坐標(biāo)為AFB1質(zhì)量濃度，縱坐標(biāo)用抑制率表示（B/B0%，其中B為含有AFB1時(shí)的吸光度值，B0是質(zhì)量濃度為0 μg/mL時(shí)的吸光度值）。測定結(jié)果用非線性四參數(shù)邏輯斯蒂擬合。方法的檢出限定義為90 %抑制率時(shí)所對應(yīng)AFB1質(zhì)量濃度。檢測的線性范圍定義為抑制率在80 %～20 %之間所對應(yīng)的AFB1質(zhì)量濃度。

1.2.8玉米樣品中AFB1回收率的測定

以不同質(zhì)量濃度AFB1添加于空白玉米粉樣品中，稱取50 g樣品，并量取100 mL 80 %甲醇水溶液至一具塞三角瓶中。劇烈震蕩3min，靜置3min，待樣品沉淀。用玻璃纖維濾紙過濾萃取液，并收集，用蒸餾水稀釋5倍，取50 μL上樣定量檢測。

2　結(jié)果與分析

2.1間接競爭ELISA法的比較

將2.8 μm磁微粒作為承載體，包被AFB1-BSA，取代酶標(biāo)板引入ELISA中，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，與常規(guī)間接競爭ELISA進(jìn)行比較，結(jié)果見圖1。

圖1　間接競爭ELISA法標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curves of indirect competitive ELISA

兩種方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線均表現(xiàn)出好的擬合度，R2值分別為0.997（磁性），0.999（常規(guī)）。

進(jìn)一步比較二者的檢出限，定量限，線性范圍，結(jié)果見表1。

表1　間接競爭ELISA法參數(shù)Table 1 The data of indirect competitive ELISA ng/mL

通過比較發(fā)現(xiàn)，以磁微粒作為載體的間接競爭ELISA法具有更低的檢測出限，磁微粒的引入，較常規(guī)ELISA法可以降低檢出限，本節(jié)研究檢出限僅為常規(guī)方法的20.39 %。與酶標(biāo)板相比，磁微粒作為固定相比表面積更大，提供的結(jié)合位點(diǎn)更多，在溶液中較為分散均一，磁微粒表面結(jié)合的AFB1-BSA在溶液中暴露充分，降低了抗原與抗體結(jié)合的空間位阻。酶標(biāo)板包被法中，抗體通過分子布朗運(yùn)動(dòng)和擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)到酶標(biāo)板的速度較慢，而磁微粒可均勻分布在溶液中，在液相中呈三維立體反應(yīng)，更易于接近抗體，從而加快抗原抗體結(jié)合速度。綜上，與酶標(biāo)板相比，在相同時(shí)間內(nèi)，磁微粒的引入可使免疫反應(yīng)更徹底，從而獲得更低的檢測限。

2.2以單克隆抗體為基礎(chǔ)的直接競爭ELISA法比較

將200 nm磁微粒、2.8 μm磁微粒分別作為承載體，偶聯(lián)AFB1單克隆抗體，取代酶標(biāo)板引入ELISA中，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，與常規(guī)直接競爭ELISA法進(jìn)行比較，結(jié)果見圖2。

圖2　單抗直接競爭ELISA法標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 The standard curves of direct competitive ELISA based on monoclonal antibody

3種方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線均表現(xiàn)出好的擬合度，R2值分別為0.992（200 nm磁性），0.999（2.8 μm磁性），0.990（常規(guī)）。

進(jìn)一步比較三者的檢出限，定量限，線性范圍，結(jié)果見表2。

表2　單抗直接競爭ELISA法參數(shù)Table 2 The data of direct competitive ELISA based on monoclonal antibody ng/mL

通過比較發(fā)現(xiàn)，以2.8μm磁微粒作為載體的間接競爭ELISA法具有更低的檢測出限，磁微粒的引入，較常規(guī)直接ELISA法檢出限可以降低76.9 %。

2.3玉米樣品中AFB1添加回收率的測定

向空白玉米樣品中添加一定量的AFB1標(biāo)準(zhǔn)品，使終質(zhì)量濃度為0.1、0.2 ng/mL和0.4 ng/mL。經(jīng)過提取回收，利用以AFB1單克隆抗體為基礎(chǔ)的磁微粒間接競爭模式和直接競爭模式方法分別測定并比較。結(jié)果見表3。

表3　玉米樣品中AFB1添加回收率測定Table 3 Recoveries of AFB1 in corn samples

2.8μm磁微粒間接競爭ELISA法的回收率范圍在90.8 %～106.4 %之間，200 nm磁微粒直接競爭ELISA法的回收率范圍在84.2 %～125.9 %之間，2.8 μm磁微粒直接競爭ELISA法的回收率范圍在84.5 %～91.3 %之間。通過3種不同質(zhì)量濃度AFB1玉米樣品的應(yīng)用研究，得到了很好的回收率，進(jìn)一步證明磁微粒作為承載體能夠應(yīng)用于玉米樣品中AFB1的ELISA檢測。

3　結(jié)論

本研究中，我們進(jìn)行了兩類比較：（1）以AFB1單克隆抗體為基礎(chǔ)的間接競爭ELISA法，2.8μm磁微粒的引入，使檢測限較常規(guī)ELISA低近5倍（為0.028ng/mL），回收率范圍在90.8 %～106.4 %之間；（2）以AFB1單克隆抗體為基礎(chǔ)的直接競爭ELISA法，分別利用200 nm、2.8 μm粒徑的羧基磁微粒與抗體偶聯(lián)，經(jīng)測定，2.8 μm磁微粒較常規(guī)ELISA法檢測限低4.3倍（0.012 ng/mL），回收率范圍在84.5 %～91.3 %之間，200 nm磁微粒的檢出限為0.025 ng/mL，回收率范圍在84.2 %～125.9 %之間。綜上，磁微粒的引入可提供更大比表面積，更好的流動(dòng)性從而使靈敏度得到提升。本研究成功建立了一種檢測玉米中AFB1的磁性ELISA方法。

參考文獻(xiàn)：

[1] Creepy E E.Update of survey，regulation and toxiceffects of mycotoxins in Europe[J].Toxicology Letters，2002,127(1/3):19-28

[2] Sweeney M,Dobson A.Mycotoxin production by Aspergillus,Fusariumand Penicilliumspecies[J].International Journal of Food Microbiology,1998,43(3):141-158

[3] Aycicek H,Aksoy A,Saygi S.Determination of aflatoxinlevels in some dairy and food products which consumed inAnkara,Turkey[J].Food Control,2005,16(3):263-266

[4] Ehrlich K C,Kobbeman K,Montalbano B G,et al.Aflatoxin-producing Aspergillusspecies from Thailand[J].International Journal of Food Microbiology,2007,114(2):153-159

[5] Asao T,B chi G,Abdel-Kader M,et al.The structures of aflatoxins B and G1.Journal of the American Chemical Society,1965,87(4):882-886

[6] IARC-WHO.Some naturally occurring substances:Food items and constituents,heterocyclic aromatic amines,and mycotoxins[C].Lyon France: IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans,1993:245-362

[7] Van Egmond Hans P,Schothorst Ronald C,Jonker Marco A.Regulations relating to mycotoxins in food:perspectives in a global and European context[J].Analytical andbioanalytical chemistry, 2007, 389 (1):147-157

[8] Alcaide-Molina M,Ruiz-Jiménez J,Mata-Granados J M,et al.Highthrough-put aflatoxin determination in plant material by automated solid-phase extraction on-line coupled to laser-induced fluorescence screening and determination by liquid chromatography-triple quadrupole mass spectrometry[J].Journal of Chromatography A,2009, 1216(7):1115-1125

[9] Cervino C,Asam S,Knopp D,et al .Use of isotope - labeled aflatoxins for LC-MS/MS stable isotope dilution analysis of foods [J].Journal of agricultural and food chemistry,2008,56 (6):1873 - 1879

[10] Xavier JJ M,Scussel V M.Development of an LC-MS/MS method for the determination of aflatoxins B1,B2,G1,and G2in Brazil nut.International Journal of Environmental Analytical Chemistry,2008,88 (6): 425

[11]馬良,張宇昊,李培武.LIF—HPCE法檢測食品中的黃曲霉毒素B1[J].食品科學(xué),2009,30(10):135-139

[12]張麗,朱姝,張文海.高效液相柱后衍生法測定食品中的黃曲霉毒素B1[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2006,16(1):70-71

[13] Peiwu Li, Qi Zhang, Wen Zhang.Immunoassays for aflatoxin [J].Trends in Analytical Chemistry,2009,28(9):1115-1126

[14] Peiwu Li,Qi Zhang,Wen Zhang,et al．Development of a class－specific monoclonal antibody based ELISA for aflatoxins in peanut[J]．Food Chemistry,2009,115(1):313-317

[15] Daohong Zhang,Peiwu Li,Qi Zhang,et al.Production of ultrasensitive generic monoclonal antibodies against major aflatoxins using a modified two-step screening procedure[J].Analytica chimica acta, 2009, 636(1):63-69

[16] Kolosova A Y,Shim W B,Yang Z.Y,et al.Direct competitive ELISA based on a monoclonal antibody for detection of aflatoxin B1.Stabilization of ELISA kit components and application to grain samples [J].Analytical and bioanalytical chemistry,2006,384(1):286-294

[17]管笛,潘燦平,王文,等.磁微粒酶聯(lián)免疫吸附法測定玉米中的伏馬毒素B1[J].食品科學(xué),2014,35(8):208-211

Development of a Magnetic Particles Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Determination of Aflatoxin B1in Corn

GUAN Di1，2，3，KANG Zi-jia1，2，3，JIA Di1，2，3，WU Hui-juan1，2，3，*
（1.Beijing Centre for Physical and Chemical Analysis，Beijing 100089，China；2.Beijing Engineering Technique Research Center for Gene Sequencing & Function Analysis，Beijing 100089，China；3.Beijing Engineering Research Centre of Food Safety Analysis，Beijing 100089，China）

Abstract：Magnetic particles（MPs）were using assupport to replace enzyme-linked immunosorbent assay plates for determination AFB1in corn.We compared two formats for AFB1ELISA methods.First of all，indirect competitive ELISA was developed with monoclonal antibody（MAb）.The LOD of 2.8 μm MPs ELISA was 0.028 ng/mL，which was 5 times lower than conventional ELISA.Secondly，direct competitive ELISA was developed with MAb.200 nm and 2.8 μm carboxyl-MPS were coated with AFB1MAb.And The LOD of 2.8 μm MPs ELISA was 0.012 ng/mL，which was 4.3 times lower than conventional ELISA.The recoveries were from 84.2 % to 125.9 %，and the variations were less than 12.3 %.

Key words：magnetic particles；aflatoxins；enzyme linked immunosorbent assay；corn；

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.05.024

基金項(xiàng)目：北京市市級財(cái)政項(xiàng)目（PXM2013_178305_000002）；北京市科學(xué)技術(shù)研究院青年骨干計(jì)劃（201415）

作者簡介：管笛（1983—），男（漢），助理研究員，博士，研究方向：食品安全與檢測技術(shù)。

收稿日期:2014-11-28