酶法輔助提取茶多酚的工藝研究

徐婕，湯韌，吉樹臣，姜淑妍，徐楠楠（長(zhǎng)春市農(nóng)業(yè)學(xué)校，吉林長(zhǎng)春130022）

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酶法輔助提取茶多酚的工藝研究

徐婕，湯韌，吉樹臣，姜淑妍，徐楠楠
（長(zhǎng)春市農(nóng)業(yè)學(xué)校，吉林長(zhǎng)春130022）

摘要：以湖北通城縣茶葉產(chǎn)區(qū)的綠茶為原料，研究纖維素酶和果膠酶復(fù)合輔助提取茶多酚的最佳工藝參數(shù)。通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)分析酶用量、浸提時(shí)間、浸提溫度和pH對(duì)茶多酚提取率的影響，進(jìn)而對(duì)茶多酚提取的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)。結(jié)果表明：pH和纖維素酶用量對(duì)茶多酚提取率影響顯著，優(yōu)化后的提取工藝條件為纖維素酶用量200U/mL、果膠酶用量300U/mL、浸提時(shí)間50min、浸提溫度為40℃、pH5.0，此最佳條件下的茶多酚提取率為23.54%，DPPH自由基清除率達(dá)30%，顯示出優(yōu)異的抗氧化性能。

關(guān)鍵詞：茶多酚；酶輔助；工藝參數(shù)；提取率；活性

茶多酚（tea-polyphenols，簡(jiǎn)寫TP）是一類由黃烷醇類物質(zhì)、花色素、酚酸及其縮酚酸等組成的復(fù)合物，約占茶葉干重的15 %～30 %[1]，主要存在于茶葉細(xì)胞液泡中。茶多酚在常溫下為淺黃色無定形粉末，有較強(qiáng)的極性和一定的親水性。溶液顯弱酸性，對(duì)熱和酸較穩(wěn)定，在堿性介質(zhì)中易氧化褐變。茶多酚是茶葉中主要的藥理成分，是一種理想的天然食品抗氧化劑，其抗氧活性高于一般非酚性或單酚羥基類抗氧劑。大量研究表明，茶多酚具有高效消除體內(nèi)自由基、抗衰老、防癌抗癌、預(yù)防心血管疾病、抗菌消炎、防輻射、除臭等多種生物功能，在食品、醫(yī)藥等各領(lǐng)域都有廣闊的應(yīng)用前景和開發(fā)價(jià)值[2]。

目前，茶多酚的提取工藝主要分為有機(jī)溶劑萃取法、金屬離子沉淀法、膜分離法、超臨界CO2萃取法、樹脂吸附分離法。但上述方法都存在著不足：有機(jī)溶劑萃取法提取茶多酚的工序繁瑣，蒸餾濃縮時(shí)間較長(zhǎng)，茶多酚用熱水浸提后更容易被氧化，使其生物活性降低；金屬離子沉淀法中使用的偏堿性金屬離子和調(diào)節(jié)酸堿度的操作都會(huì)降低部分酚類物質(zhì)的活性[3]；膜分離法以選擇性透過膜為分離介質(zhì)，不采用有機(jī)溶劑和加熱處理，故得到的茶多酚活性較高，但成本太高，難以普及[4]；超臨界CO2萃取法操作溫度低，保證了被提取物不被破壞，產(chǎn)品純度較高，但因茶多酚提取率過低，難以實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)[5]。近年來，國(guó)外研究者將酶法引入植物組分中有效成分的提取。果膠酶和鞣酸酶配合使用提取蘋果皮中的酚類物質(zhì)[6]、用果膠酶提取橄欖中的橄欖油[7]及對(duì)紅茶提取物進(jìn)行酶處理[8]等研究結(jié)果表明，酶法可在不同程度上提高有效成分的提取率，證明了酶法輔助提取的可行性。

本試驗(yàn)采用酶法輔助提取茶葉中茶多酚，通過正交設(shè)計(jì)優(yōu)化茶多酚提取的工藝參數(shù)，為酶法輔助提取茶多酚的試驗(yàn)研究和工業(yè)化生產(chǎn)提供理論參考。

1　材料與方法

1.1材料

綠茶葉采自湖北通城縣茶葉產(chǎn)區(qū)，經(jīng)通風(fēng)干燥后采用植物粉碎機(jī)粉碎，并用100目標(biāo)準(zhǔn)篩篩分，篩分后的茶粉保存于棕色干燥瓶中，作為提取茶多酚的原料。

1.2儀器

FW177型植物粉碎機(jī)：天津市泰斯特儀器有限公司；PH070A型電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；PB-10標(biāo)準(zhǔn)型電化學(xué)分析儀：德國(guó)Sartorius集團(tuán)；TU-1810型紫外-可見分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限公司。

1.3試劑

纖維素酶、果膠酶：活力均大于15 000 U/g，產(chǎn)自西隴化工股份有限公司；雙重蒸餾水、甲醇水溶液（體積比7：3）、10 mmol/L的HCl；碳酸鈉、氫氧化鈉、無水乙醇、福林酚試劑、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）標(biāo)準(zhǔn)品、鄰苯三酚、三羥甲基-氨基甲烷（TRIS)：均為分析純。以上試劑均采購(gòu)自長(zhǎng)春市宏宇化工有限公司，生產(chǎn)廠家為北京北化精細(xì)化學(xué)品有限責(zé)任公司、國(guó)藥集團(tuán)試劑有限公司。

1.4方法

1.4.1茶多酚的提取

分別采用纖維素酶、果膠酶單獨(dú)作用和二者復(fù)合作用的方法提取茶多酚。首先，對(duì)各種反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，然后分別在最佳條件下進(jìn)行提取，提取過程完成后，將提取物真空抽濾，得茶多酚浸提液，取樣測(cè)定茶多酚含量。

1.4.2茶多酚提取率的測(cè)定

TP的測(cè)定按GB/T 8313-2008《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測(cè)方法》進(jìn)行[9]。其原理是福林酚試劑氧化茶多酚中-OH基團(tuán)并顯藍(lán)色。

用移液管分別移取沒食子酸工作液、雙重蒸餾水（作空白對(duì)照）及測(cè)試液各1.0 mL于刻度試管內(nèi)，在每個(gè)試管內(nèi)分別加入5.0 mL的福林酚試劑，搖勻。反應(yīng)3min～8min內(nèi)，加入4.0 mL 7.5 % Na2CO3溶液，加雙重蒸餾水定容至刻度，搖勻，室溫下放置60min。用10 mm比色杯，以試劑空白溶液做參比，用紫外-可見分光光度計(jì)在波長(zhǎng)765 nm處測(cè)定吸光度，茶多酚的提取率按式（1）計(jì)算。

式中：A為樣品測(cè)試液吸光度；V為樣品提取液體積，10 mL；d為稀釋因子（通常為1 mL稀釋成100 mL，其稀釋因子為100）；SLOPEStd為沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率；m為樣品干物質(zhì)含量，%；m1為樣品質(zhì)量，g。

1.4.3抗氧化性能評(píng)價(jià)

將1.4.1中得到的茶多酚浸提液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上65℃進(jìn)行真空濃縮，濃縮的樣品置于電熱鼓風(fēng)干燥箱50℃烘干至恒重，得到茶多酚粗品，通過測(cè)定其對(duì)DPPH自由基的清除率，評(píng)價(jià)其抗氧化性能。

配制質(zhì)量濃度為2 mg/mL茶多酚待測(cè)液。稱取10.3 mg DPPH自由基，用無水乙醇定容至250 mL，溶液濃度為0.1 mmoL/L，將其盛于棕色容量瓶中，置于暗處保存。分別取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL待測(cè)液，加入2 mL DPPH溶液，用無水乙醇將體系均補(bǔ)至4 mL，搖勻，室溫放置30min后，以無水乙醇作為參比，測(cè)定各體系在517 nm波長(zhǎng)處的吸光度Ai；將樣品用等體積水代替，即體系中僅含DPPH和無水乙醇，其他同前，測(cè)定吸光度Ac。另將DPPH溶液用等體積水代替，即體系中僅含樣品和無水乙醇，其他同前，測(cè)定吸光度Aj。DPPH自由基的清除率可利用下式（2）進(jìn)行計(jì)算。

式中，K為清除率；Ai為加試樣反應(yīng)后DPPH溶液的吸光度；Aj為不加DPPH，只加試樣溶液的吸光度；Ac為不加試樣，只加DPPH溶液的吸光度。

2　結(jié)果與分析

2.1影響茶多酚提取的單因素試驗(yàn)

2.1.1酶用量對(duì)茶多酚提取率的影響

茶多酚提取實(shí)質(zhì)上是茶多酚從茶葉細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)散到溶劑中的非穩(wěn)態(tài)非平衡傳質(zhì)過程。整個(gè)過程大致分為3個(gè)階段：溶劑向茶葉內(nèi)部的滲透和浸潤(rùn)；茶葉內(nèi)部溶質(zhì)的溶解；溶質(zhì)從茶葉內(nèi)部向周圍溶液的擴(kuò)散。而酶的作用在于使茶葉細(xì)胞壁軟化、膨脹和崩潰，即破壁，因此，酶用量是酶法輔助提取茶多酚首要考慮的參數(shù)。

精確稱取1.000 0 g茶粉共5份，以蒸餾水為溶劑，用檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液調(diào)節(jié)提取體系的pH為5.0，按液固比為20：1（mL/g）加入錐形瓶中，分別加入纖維素酶和果膠酶0、100、200、300、400U/mL，在40℃恒溫水浴鍋中浸提50min，在轉(zhuǎn)速3 500r/min的離心機(jī)中離心10min，取上清液，同1.4.2的操作，測(cè)得提取出的茶多酚的含量，比較不同酶用量對(duì)茶多酚提取率的影響，得到最佳酶用量，試驗(yàn)結(jié)果見圖1和圖2。

圖1　纖維素酶用量對(duì)茶多酚提取率的影響Fig.1 Effect of cellulase dosage on TP extraction efficiency

圖2　果膠酶用量對(duì)茶多酚提取率的影響Fig.2 Effect of pectinase dosage on TP extraction efficiency

從圖1和圖2可以看出，在試驗(yàn)條件下，纖維素酶和果膠酶的最佳用量分別在200U/mL和300U/mL。隨著纖維素酶和果膠酶用量的增加，茶多酚提取率迅速增大，分別在200U/mL和300U/mL時(shí)達(dá)到最大值，繼續(xù)增加纖維素酶和果膠酶的用量，茶多酚的提取率增長(zhǎng)緩慢并趨向穩(wěn)定。這是因?yàn)?，一方面，作為固體底物的茶粉在溶液中不能充分?jǐn)U散，在較低的酶濃度下，酶尚可與底物較充分地結(jié)合，隨著酶濃度的升高，底物濃度對(duì)酶達(dá)到飽和，由于酶與底物的接觸面積受限，酶的作用受到抑制，進(jìn)而影響了茶多酚的提取率。另一方面，雖然適量的酶可以通過破壁改變細(xì)胞壁的通透性，使得細(xì)胞壁破裂增加有效成分的溶出，提高茶多酚的提取率，但是茶多酚的分子可以與蛋白質(zhì)和氨基酸發(fā)生很強(qiáng)的絡(luò)合反應(yīng)[10]，而酶是具有催化活性的蛋白質(zhì)，當(dāng)酶過量時(shí)就會(huì)與茶多酚絡(luò)合，最終影響茶多酚的提取率。因此，酶用量并非越大越好。

2.1.2浸提時(shí)間對(duì)茶多酚提取率的影響

精確稱取1.000 0 g茶粉5份，以蒸餾水為溶劑，用檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液調(diào)節(jié)提取體系的pH為5.0，按液固比為20：1（mL/g）加入錐形瓶中，在40℃恒溫水浴鍋中分別浸提35、50、65、80、95min，在轉(zhuǎn)速3 500r/min的離心機(jī)中離心10min，取上清液，同1.4.2的操作，測(cè)定茶多酚提取量，比較不同浸提時(shí)間對(duì)茶多酚提取率的影響，得到最佳浸提時(shí)間，結(jié)果見圖3。

圖3　浸提時(shí)間對(duì)茶多酚提取率的影響Fig.3 Effect of extraction time on TP extraction efficiency

從圖3可以看出，在試驗(yàn)條件下，最佳浸提時(shí)間為80min。隨著浸提時(shí)間的增加，茶多酚提取率逐漸增大，在80min時(shí)達(dá)到最大值，之后茶多酚的提取率基本維持穩(wěn)定。這是因?yàn)橛陔S著酶解浸提時(shí)間的延長(zhǎng)，茶葉細(xì)胞壁及細(xì)胞間層的纖維素和果膠質(zhì)形成的阻擋層已被有效破解，茶多酚大多已從細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)散到溶液中，細(xì)胞內(nèi)外的茶多酚濃度已達(dá)到了一種動(dòng)態(tài)平衡，繼續(xù)延長(zhǎng)提取時(shí)間對(duì)提高溶液中茶多酚濃度作用有限。

2.1.3浸提溫度對(duì)茶多酚提取率的影響

精確稱取1.000 0 g茶粉共5份，以蒸餾水為溶劑，用檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液調(diào)節(jié)提取體系的pH為5.0，按液固比為20：1（mL/g）加入錐形瓶中，分別在30，40、50、60、70℃下浸泡50min，在轉(zhuǎn)速3500r/min的離心機(jī)中離心10min，取上清液，同1.4.2的操作，測(cè)得提取出的茶多酚的含量，比較不同浸提溫度對(duì)茶多酚提取率的影響，得到最佳浸提溫度，結(jié)果見圖4。

從圖4可以看出，在試驗(yàn)條件下，最佳浸提溫度在40℃。隨著浸提溫度的增加，茶多酚提取率逐漸增大，在40℃時(shí)達(dá)到最大值，隨著浸提溫度的繼續(xù)增加，茶多酚的提取率反而下降。這是因?yàn)椴瓒喾犹崛⌒枰m宜的酶解溫度，在達(dá)到最適溫度前，隨著溫度增加，酶活力逐漸增強(qiáng)，一旦超過最適溫度，酶活力開始下降，繼續(xù)增加溫度，會(huì)使酶結(jié)構(gòu)遭到破壞，進(jìn)而導(dǎo)致酶變性失活，徹底失去催化活性。

圖4　浸提溫度對(duì)茶多酚提取率的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on TP extraction efficiency

2.1.4pH對(duì)茶多酚提取率的影響

精確稱取1.000 0 g茶粉共5份，以蒸餾水為溶劑，按液固比為20∶1（mL/g）加入錐形瓶中，分別調(diào)節(jié)pH至4.6、4.8、5.0、5.2、5.4，在40℃恒溫水浴鍋中浸提50min，在轉(zhuǎn)速3 500r/min的離心機(jī)中離心10min，取上清液，同1.4.2的操作，測(cè)得提取出的茶多酚的含量，比較不同pH對(duì)茶多酚提取率的影響，得到最佳pH，結(jié)果見圖5。

圖5　pH對(duì)茶多酚提取率的影響Fig.5 Effect of pH on TP extraction efficiency

從圖5可以看出，在試驗(yàn)條件下，最佳pH為4.8。隨著pH逐漸增加到4.8，茶多酚提取率逐漸增大至最大值，繼續(xù)增大pH，茶多酚的提取率開始下降。這是因?yàn)榕c浸提溫度對(duì)酶活性的影響類似，酶的活性也受溶液pH影響。在最適pH時(shí)，酶具有最大的催化活力；當(dāng)偏離最適pH時(shí)，酶的活性中心或與之有關(guān)的基團(tuán)發(fā)生變化，進(jìn)而影響酶的活力；在嚴(yán)重偏離最適pH時(shí)，酶蛋白可能會(huì)因自身結(jié)構(gòu)變性而失去活力。

2.2正交試驗(yàn)優(yōu)化茶多酚提取工藝

2.2.1正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

按照上述提取工藝，在多次單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇酶用量、浸提時(shí)間、浸提溫度、pH為研究對(duì)象，按照L16（45）進(jìn)行五因素四水平的正交試驗(yàn)，對(duì)茶多酚提取的工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。試驗(yàn)結(jié)果如表1所示。

表1　正交試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Result of orthogonal experiment

2.2.2極差分析

在正交試驗(yàn)中，以茶多酚的提取率為考察指標(biāo)，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行極差分析，分析結(jié)果見表2。通過極差分析得到，pH對(duì)茶多酚的提取率影響最大，纖維素酶用量次之，果膠酶用量再次之，然后是浸提時(shí)間，浸提溫度對(duì)茶多酚的提取率影響最小，最優(yōu)組合為A3B4C2D2E3，即纖維素酶用量為200U/mL、果膠酶用量300U/mL、浸提時(shí)間50min、浸提溫度為40℃、pH 5.0。

表2　極差分析表Table 2 Range analysis table

2.2.3方差分析

為證實(shí)試驗(yàn)數(shù)據(jù)可行有效，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，分析結(jié)果見表3。

由方差分析表可知，在試驗(yàn)條件下，pH和果膠酶用量是影響茶多酚提取率的顯著性因素。根據(jù)此優(yōu)化的條件，精確稱取1.000 0 g茶粉，以蒸餾水為溶劑，用檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液調(diào)節(jié)提取體系的pH為5.0，按液固比為20：1（mL/g）加入錐形瓶中，加入酶活力分別為200U/mL和300U/mL的纖維素酶和果膠酶，在溫度為40℃的恒溫水浴鍋中反應(yīng)50min，然后在轉(zhuǎn)速為3 500r/min的離心機(jī)中離心10min，取上清液，同1.4.2的操作，測(cè)得提取出的茶多酚的提取率。通過3次重復(fù)試驗(yàn)，得到茶多酚的提取率為23.54 %，由此，驗(yàn)證了正交試驗(yàn)所得結(jié)果的可靠性。

表3　方差分析表Table 3 Analysis of variance table

2.3茶多酚活性測(cè)定試驗(yàn)

兒茶素是茶多酚的主要成分，其結(jié)構(gòu)中的酚性羥基有較強(qiáng)的供氫能力，極易捕獲過氧基團(tuán)，表現(xiàn)出極強(qiáng)的自由基清除能力[11]。DPPH·是一種穩(wěn)定的有機(jī)自由基，通過檢測(cè)茶多酚對(duì)DPPH自由基的清除能力可以表示其抗氧化性的強(qiáng)弱。按照1.4.2操作，用提取后茶多酚對(duì)DPPH自由基清除率來表征茶多酚活性的高低，試驗(yàn)結(jié)果見表4顯示。

表4　茶多酚對(duì)DDPH自由基清除率Table 4 TPs on DPPH radical scavenging rate

茶多酚對(duì)DPPH自由基清除作用隨時(shí)間的變化情況見圖6。

圖6　茶多酚對(duì)DPPH自由基清除率隨時(shí)間的變化Fig.6 TPs on DPPH radical scavenging rate changes over time

由圖6可以看出，在試驗(yàn)條件范圍內(nèi)，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，提取液對(duì)DPPH自由基的清除率呈明顯上升趨勢(shì)，浸提的新鮮樣液在45min后，抗自由基活性趨于穩(wěn)定，DPPH自由基清除率可達(dá)30 %，顯示了茶多酚較高的抗氧化和清除自由基能力。

3　討論

1）纖維素酶和果膠酶復(fù)合輔助提取茶多酚的最佳工藝條件：對(duì)于1.0000g茶粉，纖維素酶活力200U/mL，果膠酶活力300U/mL，浸提時(shí)間50min，浸提溫度40℃，pH 5.0。

2）正交試驗(yàn)結(jié)果的極差分析表明，5個(gè)因素對(duì)茶多酚提取率的影響順序?yàn)椋簆H＞纖維素酶用量＞果膠酶用量＞浸提時(shí)間＞浸提溫度。方差分析結(jié)果表明，5個(gè)因素中pH和果膠酶用量為影響茶多酚提取率的顯著性因素。

3）在試驗(yàn)條件下，采用纖維素酶和果膠酶復(fù)合輔助提取茶多酚的最大提取率可達(dá)22.84 %，高于傳統(tǒng)溫水浸提取至少10個(gè)百分點(diǎn)，并且茶多酚活性測(cè)定的試驗(yàn)結(jié)果顯示，茶多酚在提取后的1 h內(nèi)DPPH自由基清除率高達(dá)30 %，表現(xiàn)出優(yōu)異的抗氧化性能。

4）此外，酶法可在常壓、較低溫度條件下破碎茶葉細(xì)胞細(xì)胞壁，反應(yīng)溫和，易操控，因此在解決茶葉原料粉碎、縮短提取時(shí)間、降低能耗等方面也具有一定優(yōu)勢(shì)。

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Research of the Extraction Processing of Tea Polyphenols

XU Jie，TANG Ren，JI Shu-chen，JIANG Shu-yan，XU Nan-nan
（Changchun Agricultural School，Changchun 130022，Jilin，China）

Abstract：The green tea，obtained from tea-producing areas of the Tongcheng County of Hubei Province，was chosen as raw material.The optimum conditions were carefully studied in the process of assisted extraction of tea polyphenols from mixture of cellulose and pectinase.The impact of enzyme concentration，extraction time，extraction temperature and pH on tea polyphenols extraction rate was analyzed by single factor and orthogonal experiments，which was used to optimize the design of tea polyphenols extraction process conditions.The results showed that pH and cellulose significant could huge impact on the extraction of tea polyphenols.The optimal extraction conditions were cellulose 200U/mL，the pectinase 300U/mL，extraction time 50min，extraction temperature 40℃，pH 5.0.The polyphenols extracted under optimum conditions was 23.54 % and the DPPH free radical clearance rate was 30 %，which showed excellent antioxidant properties.

Key words：tea polyphenols；enzyme-assisted；process parameters；extraction rate；activity

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.05.021

作者簡(jiǎn)介：徐婕（1987—），女（滿），助理講師，在讀碩士，主要從事食品衛(wèi)生及安全方面的研究。

收稿日期:2014-12-10