酶解法提取蒲公英多糖工藝

徐瀾，王明華，渠娟娟，安偉（.忻州師范學(xué)院生物系，山西忻州034000；.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院玉米研究所，山西忻州034000）

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酶解法提取蒲公英多糖工藝

徐瀾1，王明華1，渠娟娟1，安偉2
（1.忻州師范學(xué)院生物系，山西忻州034000；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院玉米研究所，山西忻州034000）

摘要：通過單因素試驗(yàn)和Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)化酶解法提取蒲公英多糖工藝。研究了酶解pH、酶解時(shí)間、酶解溫度、酶濃度等因素對(duì)蒲公英多糖提取率的影響，利用響應(yīng)面法處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)，確定了酶解法優(yōu)化蒲公英多糖的提取工藝參數(shù)。對(duì)蒲公英多糖提取率的影響次序?yàn)?酶濃度＞酶解時(shí)間＞酶解溫度＞pH；木瓜蛋白酶提取蒲公英多糖提取率（3.11%）最高；最優(yōu)提取工藝參數(shù)為:pH為9.20，酶解溫度為46.18℃，酶解時(shí)間為123min，酶含量為3.38%（酶質(zhì)量/蒲公英質(zhì)量）。

關(guān)鍵詞：蒲公英；多糖；酶解法；響應(yīng)面法

蒲公英（Herba Taraxaci）為菊科多年生草本植物，我國約有11種[1]，分布于東北、華北及陜西、甘肅、青海等地，味苦，性寒，具有清熱解毒、消腫散結(jié)和利尿通淋的功效。植物多糖具有多種生物活性，抗病毒、降血糖及抗腫瘤和免疫促進(jìn)的臨床應(yīng)用[2]，如蒲公英多糖具有抗突變、抗氧化、抗疲勞和提高免疫等生物活性[3]等功效。多糖提取方法主要有水浸提取法、酸堿提取法、微波輔助提取法、酶提取法等，傳統(tǒng)高溫水提取工藝時(shí)間較長，而且能耗大、效率低；酸堿提取易破壞多糖的結(jié)構(gòu)和活性；微波法省時(shí)，但是效率較低；超聲波法雖然效率較高，但噪音大，儀器昂貴[4]。酶解法具較溫和地分解植物組織的特點(diǎn)，能最大限度地提取有效成分，可大幅提高提取率，且不易破壞多糖的結(jié)構(gòu)和活性[5]，近年來已逐漸成為植物活性成分提取工藝研究的熱點(diǎn)[6-8]。采用酶解法提取蒲公英多糖，旨在探索一種高效的蒲公英多糖提取工藝。

本研究利用酶解法從蒲公英中提取多糖，該法目前尚少見報(bào)道。同時(shí)，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以蒲公英多糖提取率為響應(yīng)因子，對(duì)提取過程中的各主要因素采用響應(yīng)面法（response surface methodology，RSM）進(jìn)行優(yōu)化，為科學(xué)、合理地利用蒲公英資源提供參考。

1　材料與儀器

蒲公英：山西忻州。

722s可見分光光度計(jì)：上海菁華科技儀器有限公司；pHS-3C型pH（酸度）計(jì)：上海天達(dá)儀器有限公司；800B離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器制造廠；AB204-N電子分析天平：上海梅特勒-托利多儀器有限公司；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋：江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品（分析純）、苯酚（分析純）、濃硫酸（分析純）均為天津市分船化學(xué)試劑科技有限公司；纖維素酶（BR生化試劑）：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；果膠酶（生物試劑）：天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；木瓜蛋白酶：北京化學(xué)試劑公司。

2　方法

采用硫酸苯酚法[9-10]。

2.1多糖的提取

取蒲公英粉末0.5 g，選擇50 mL蒸餾水，加入適量的木瓜蛋白酶，在適量溫度下進(jìn)行不同時(shí)間的水浴加熱，離心后得多糖提取液。

2.2多糖含量的測定

繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制:準(zhǔn)確稱取干燥恒重葡萄糖100 mg，用蒸餾水定容于100 mL容量瓶中，濃度為1 mg/mL葡萄糖貯備溶液，再準(zhǔn)確移取10 mL，用蒸餾水定容至100 mL，得0.1 mg/mL葡萄糖使用液。準(zhǔn)確吸取0.1 mg/mL的葡萄糖使用液0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 mL，分別置于試管中，各加入6.25 %苯酚溶液1mL，搖勻，置于30℃的水浴中，滴加濃硫酸5.0mL，搖勻后，煮15min，取出后用蒸餾水定容到25 mL，于室溫下顯色20min，于波長490 nm處測定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得回歸方程A=0.039C+0.013 3，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 2。

準(zhǔn)確吸取以上所得蒲公英多糖提取液1 mL，按標(biāo)準(zhǔn)曲線制備方法測定吸光度，并以吸光度求出蒲公英中多糖的含量[9]。多糖含量公式：

2.3單因素試驗(yàn)

多糖提取率的影響因素很多，本試驗(yàn)選擇酶解時(shí)間、酶解溫度、酶濃度和酶解pH為因素，考察各因素對(duì)蒲公英多糖提取工藝的影響，采用單因素試驗(yàn)確定最佳工藝條件。由文獻(xiàn)知，木瓜蛋白酶具有一定的優(yōu)勢。因此，在后面的試驗(yàn)中選擇用木瓜蛋白酶來進(jìn)行多糖的提取試驗(yàn)。

2.4響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以酶解溫度、酶解時(shí)間、酶濃度和酶解pH作為考察對(duì)象，以蒲公英多糖提取率為響應(yīng)值，采用Design Expert 7.0.0統(tǒng)計(jì)分析軟件的響應(yīng)面法安排試驗(yàn)，得到最優(yōu)化提取工藝參數(shù)。

3　結(jié)果與分析

3.1木瓜蛋白酶提取蒲公英多糖的單因素試驗(yàn)

3.1.1酶解時(shí)間對(duì)蒲公英多糖提取率的影響

在酶濃度為3 %，溫度為50℃，pH=5的條件下，確定最佳酶解時(shí)間，以酶解時(shí)間為橫坐標(biāo)，蒲公英多糖提取率為縱坐標(biāo)作圖，結(jié)果如圖1所示。

圖1　酶解時(shí)間對(duì)蒲公英多糖提取率的影響Fig.1 Effect of enzymolysis time on the extraction yield of polysaccharides from Herba Taraxaci

由圖1可知，隨著酶解時(shí)間的增加，多糖提取率逐漸升高，當(dāng)達(dá)到120min時(shí)，多糖提取率達(dá)到最大，再延長酶解時(shí)間，多糖提取率有所下降。因此，最佳酶解時(shí)間是120min。

3.1.2酶解溫度對(duì)蒲公英多糖提取率的影響

圖2　酶解溫度對(duì)蒲公英多糖提取率的影響Fig.2 Effect of enzymolysis solution temperature on the extraction yield of polysaccharides from Herba Taraxaci

在酶濃度為3 %，pH=5，酶解時(shí)間為120min的條件下，確定最佳酶解溫度，并以酶解溫度為橫坐標(biāo)，蒲公英多糖的提取率為縱坐標(biāo)，見圖2。隨酶解溫度升高，蒲公英多糖提取率增加，當(dāng)溫度達(dá)50℃時(shí)，多糖提取率達(dá)最大值，之后隨酶解溫度的繼續(xù)升高，提取率反而下降。這可能是因?yàn)闇囟炔粌H影響多糖的溶出速度，而且影響蛋白酶的活性，隨著溫度升高，木瓜蛋白酶的酶解活性增加，進(jìn)而蒲公英多糖的提取率升高；但當(dāng)溫度超過50℃之后，提取率反而下降，主要是由于此時(shí)木瓜蛋白酶的活性反而降低甚至喪失，因?yàn)槊恳环N酶的活性都有一個(gè)最佳的溫度范圍，超過這個(gè)范圍就會(huì)引起酶活性降低，并且每一種酶都有一個(gè)最適溫度，在最適溫度時(shí)活性最大，即蒲公英多糖的提取率最大。因此，酶解最佳溫度為50℃。

3.1.3酶濃度對(duì)蒲公英多糖提取率的影響

以酶濃度為橫軸，蒲公英多糖提取率為縱軸，在酶解溫度是50℃，pH = 5，酶解時(shí)間為120min條件下確定最佳酶濃度，見圖3。隨酶濃度的增加，蒲公英多糖提取率增加。當(dāng)酶濃度超過3 %后，蒲公英多糖隨酶濃度增加變緩?？紤]到成本，酶解時(shí)的最佳酶濃度為3 %。

圖3　酶濃度對(duì)蒲公英多糖提取率的影響Fig.3 Effect of enzyme concentration on the extraction yield ofpolysaccharides from Herba Taraxaci

3.1.4酶解pH對(duì)蒲公英多糖提取率的影響

在酶濃度為3%，溫度為50℃，酶解時(shí)間為120min的條件下，確定最佳酶解pH。以pH為橫坐標(biāo)，蒲公英多糖的提取率為縱坐標(biāo)作圖，見圖4。

圖4　酶解pH對(duì)蒲公英多糖提取率的影響Fig.4 Effect of the pH on the extraction yield of polysaccharides from Herba Taraxaci

隨著pH的增加，蒲公英多糖的提取率逐漸增加；當(dāng)pH= 9時(shí)，蒲公英多糖的提取率達(dá)到最大值，然后隨著pH值的繼續(xù)增加蒲公英多糖的提取率反而下降。這可能是因?yàn)槊笇?duì)pH非常敏感，每一種酶都是在一定pH范圍內(nèi)發(fā)揮作用的。如果環(huán)境的pH超出這個(gè)范圍，酶的活性就會(huì)降低甚至失去活性，只有在一定的pH時(shí)，其活性才會(huì)達(dá)到最高，該值即是酶的最適pH，偏離該值，無論pH是增加或減少，酶的活性都會(huì)下降，進(jìn)而引起蒲公英多糖提取率下降。由圖4知，在pH= 9時(shí)蒲公英多糖的提取率最大，所以酶解最佳pH 為9。

3.2響應(yīng)面分析法優(yōu)化工藝條件

3.2.1響應(yīng)面分析因素水平的選取

由單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取酶解溫度（a）、酶解時(shí)間（b）、酶濃度（c）和酶的pH（d）4個(gè)因素進(jìn)行中心組合設(shè)計(jì)（central composite design，CCD）（取中心點(diǎn)為6），利用Design Expert 7.0.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合，以+ 1、0、- 1分別代表自變量高、中、低水平，因子編碼及水平見表1。

表1　響應(yīng)面分析因素水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Experiment design of four factors and three levels of RSM

3.2.2響應(yīng)面分析方案及結(jié)果

以多糖提取率為響應(yīng)值（Y），以A =（a-50）/10，B = （b- 120）/ 30，C =（c - 3）/ 1，D =（d-9）/1為自變量，采用四因素三水平試驗(yàn)進(jìn)行響應(yīng)面分析，中心組合設(shè)計(jì)的試驗(yàn)結(jié)果及其預(yù)測值見表2。

表2　響應(yīng)面分析方案及試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Box-Behnkenl central composite design arrangement and experimentral results

對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多項(xiàng)擬合回歸，建立回歸方程Y =+3.07 -0.11A +0.038B +0.094C +0.032D +0.015AB -0.095AC-0.035AD-0.065BC+0.10BD+0.052CD-0.20A2-0.16B2-0.18C2-0.18D2，對(duì)模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。

表3　蒲公英多糖提取率的回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression equation on the extraction yield of Herba Taraxaci polysaccarides

從回歸方程模型因變量的方差分析知（表3），P= 0.006 0＜0.05，表明所選用的二次多項(xiàng)式模型具有高度的顯著性（P＜0.01）[10]，即回歸方程描述各因子與響應(yīng)值之間的關(guān)系時(shí)，其應(yīng)變量與全體自變量之間的線性關(guān)系是顯著的，即這種試驗(yàn)方法是可靠的；變異系數(shù)（5.25 %）較低，表明本試驗(yàn)穩(wěn)定性較好；模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.850，說明該模型可靠性較好。失擬項(xiàng)用來表示所用模型與試驗(yàn)擬合的程度，P=0.200 2＞0.05，表明失擬不顯著。模型一次項(xiàng)A從回歸方程模型因變量的方差分析知，模型一次項(xiàng)C（P=0.000 2）差異極顯著，B （P=0.048 5）差異顯著，A（P=0.144 2），D（P=0.473 7）差異不顯著；交互項(xiàng)AB（P=0.197），AC（P=0.225 2），差異顯著CD（P=0.234 5），BD（P=0.590 7），AD（P=0.663 2），BC（P=0.917 5）差異不顯著；二次項(xiàng)A2（P=0.010 6），D2（P=0.010 8）差異顯著，C2（P=0.056 5），B2（P=0.458 4）差異不顯著。表明酶濃度對(duì)多糖提取率的主效應(yīng)明顯，且在酶解時(shí)間、酶解溫度、酶濃度和pH之間存在交互作用。依據(jù)系數(shù)值A(chǔ)=2.39，B=4.67，C=25，D=0.54可知因素的主效應(yīng)關(guān)系為:酶濃度＞酶解時(shí)間＞酶解溫度＞pH值。

3.2.3響應(yīng)面圖分析

響應(yīng)面可直接反映出各因子對(duì)響應(yīng)值的影響大小，回歸方程繪制的響應(yīng)曲面分析，見圖5～圖10。

圖5　酶解時(shí)間和溫度對(duì)多糖提取率的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface plot of time and temperaturevs extraction yield of polysaccharides

在試驗(yàn)范圍內(nèi)，酶解時(shí)間不變，隨著酶解溫度的增加，多糖提取率增加到最大值然后有所下降；酶解溫度不變，酶解時(shí)間增加，多糖提取率逐漸增大然后下降；這與單因素試驗(yàn)分析結(jié)果相吻合。多糖提取率的變化速率顯示酶解時(shí)間主效應(yīng)大于酶解溫度。

圖6　酶濃度和溫度對(duì)多糖提取率的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface plot of enzyme concentration and temperaturevs extraction yield of polysaccharides

在試驗(yàn)范圍內(nèi)，酶解溫度不變，隨著酶濃度的增加，蒲公英多糖提取率增加到最大值后有所下降；酶濃度一定，隨酶解時(shí)間增加，多糖提取率逐漸增大之后下降。這與單因素試驗(yàn)分析結(jié)果亦吻合?？梢姡嗵翘崛÷实淖兓俾曙@示酶濃度主效應(yīng)大于酶解溫度，與統(tǒng)計(jì)結(jié)果相符。

在試驗(yàn)范圍內(nèi)，酶解溫度不變，隨著pH的增加，多糖提取率增加到最大值然后有所下降；pH不變，酶解溫度增加，多糖提取率逐漸增大然后下降。這與單因素試驗(yàn)結(jié)果相一致。多糖提取率的變化速率顯示酶解溫度主效應(yīng)大于pH，與統(tǒng)計(jì)結(jié)果一致。

圖7　pH和溫度對(duì)多糖提取率的響應(yīng)面圖Fig.7 Response surface plot of pH and temperaturevs extraction yield of polysaccharides

圖8　酶濃度和時(shí)間對(duì)多糖提取率的響應(yīng)面圖Fig.8 Response surface plot of enzyme concentration and time vs extraction yield of polysaccharides

在試驗(yàn)范圍內(nèi)，酶解時(shí)間不變，隨著酶濃度的增加，多糖提取率增加到最大值然后有所下降；酶濃度不變，酶解時(shí)間增加，多糖提取率逐漸增大然后下降；與單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果相吻合。多糖提取率的變化速率顯示酶濃度主效應(yīng)大于酶解時(shí)間，與統(tǒng)計(jì)分析相符。

圖9　pH和時(shí)間對(duì)多糖提取率的響應(yīng)面圖Fig.9 Response surface plot of pH and time vs extraction yield of polysaccharides

圖10　pH和酶濃度對(duì)多糖提取率的響應(yīng)面圖Fig.10　Response surface plot of pH and enzyme concentration vs extraction yield of polysaccharides

在試驗(yàn)范圍內(nèi)，酶解時(shí)間不變，隨著pH的增加，多糖提取率增加到最大值然后有所下降；pH不變，酶解時(shí)間增加，多糖提取率逐漸增大然后下降。這與單因素試驗(yàn)分析結(jié)果一致。多糖提取率的變化速率顯示酶解時(shí)間主效應(yīng)大于pH，與統(tǒng)計(jì)結(jié)果相符。

在試驗(yàn)范圍內(nèi)，酶濃度不變，隨pH的增加，多糖提取率增加到最大值然后有所下降；pH不變，酶濃度增加，多糖提取率逐漸增大然后下降。與單因素試驗(yàn)分析相吻合。多糖提取率的變化速率顯示酶濃度主效應(yīng)大于pH，與統(tǒng)計(jì)結(jié)果相符。

3.2.4最優(yōu)工藝條件求取

為進(jìn)一步確定最佳點(diǎn)值，對(duì)所得回歸方程取一階偏導(dǎo)為零，得到曲面的最大點(diǎn)，求導(dǎo)方程整理為:

-22-80A+3B-19C-7D=0

38+15A-320B-65C+100D=0

94-95A-65B-360C+52D=0

32-35A+100B+52C-320D=0

求解方程組得：A=-0.378 5；B=0.089；C= 0.374 5；D= 0.204 5。最后求得酶解溫度、酶解時(shí)間、酶濃度、pH分別為：a = 46.18℃，b=123min，c=3.38 %，d=9.20。此時(shí)蒲公英多糖的最大提取率為3.11 %。對(duì)提取條件進(jìn)行中心組合設(shè)計(jì)優(yōu)化，最佳提取工藝參數(shù)為：酶解溫度46.18℃、酶解時(shí)間123min，酶濃度3.38 %，pH= 9.2，此時(shí)多糖提取率理論值可達(dá)到3.07 %。驗(yàn)證試驗(yàn)表明，多糖提取率為3.11 %。

3.3酶解法與常規(guī)水煮法的對(duì)比試驗(yàn)

在前面試驗(yàn)基礎(chǔ)上確定了酶解法最優(yōu)工藝，利用這些確定的參數(shù)與常規(guī)水煮法進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)。

準(zhǔn)確稱取0.5 g蒲公英粉3份，分別置于100 mL錐形瓶中，然后加入蒸餾水50 mL，分別提取8 h，然后離心，合并上清液，并將上清液稀釋25倍，進(jìn)行吸光度檢測。試驗(yàn)結(jié)果見表4。

表4　兩種方法的多糖提取結(jié)果對(duì)比Table 4 Contrast of the extraction yield of Herba Taraxaci polysaccharides between two ways of extraction

由表4可知，酶解提取蒲公英中的多糖，其提取率遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于傳統(tǒng)水解提取法。這與酶解對(duì)蒲公英細(xì)胞的破壞是均勻的，多糖較易溶出有關(guān)；而傳統(tǒng)水煮提取法盡管耗時(shí)很長（8 h），但細(xì)胞結(jié)構(gòu)沒有遭到破壞，故而提取率較低。

4　結(jié)論

1）采用酶解法提取蒲公英多糖的提取率可達(dá)3.11%。

2）基于單因素試驗(yàn)得到的較優(yōu)工藝條件：pH為9.00，酶解溫度為50℃，酶解時(shí)間為120min，酶含量為3 %（酶質(zhì)量/蒲公英質(zhì)量）。

3）在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，酶解溫度、酶解時(shí)間、pH和酶含量選取4個(gè)因素進(jìn)行中心組合設(shè)計(jì)，使用Design Expert 7.0.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合，建立了酶解提取蒲公英中多糖的工藝數(shù)學(xué)模型Y=+3.07-0.11A+ 0.038B+0.094C+0.032D+0.015AB-0.095AC-0.035AD-0.065BC +0.10BD +0.052CD -0.20A2-0.16B2-0.18C2-0.18D2?；貧w分析表明該模型穩(wěn)定性較好；通過模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)，得到因素的主效應(yīng)關(guān)系為:酶濃度＞酶解時(shí)間＞酶解溫度＞pH值。

4）由響應(yīng)面法得到的模型進(jìn)行探討，蒲公英中多糖的酶解提取過程優(yōu)化工藝：pH為9.2，酶解溫度為46.18℃，酶解時(shí)間為123min，酶含量為3.38 %（酶質(zhì)量/蒲公英質(zhì)量），在該優(yōu)化條件下，提取率為3.11 %。驗(yàn)證試驗(yàn)表明，蒲公英多糖的提取率為3.08 %，與理論值相符。因此，響應(yīng)面法優(yōu)化工藝獲得的蒲公英多糖的酶解提取條件，數(shù)據(jù)準(zhǔn)確，科學(xué)可行。

5）酶解法與常規(guī)水煮提取法的對(duì)比試驗(yàn)表明，采用酶解法提取工藝提取蒲公英中的多糖，提取率高于常規(guī)水煮提取工藝。

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Optimization of Extraction Technology of Polysaccharides from Herba Taraxaci by Enzymatic Hydrolysis

XU Lan1，WANGming-hua1，QU Juan-juan1，AN Wei2
（1.Department of Biology，Xinzhou Teachers University，Xinzhou 034000，Shanxi，China；2.Maize Research Institute，Shanxi Academy of Agricultural Sciences，Xinzhou 034000，Shanxi，China）

Abstract：To optimize the extraction technology of polysaccharides from Herba Taraxaci，contrast experiment were carried out.The single factor experiment and Box-Behnken experiment were designed to study the effects of the pH，enzymolysis time，enzyme solution temperature，enzyme concentration on the extraction yield by enzymatic hydrolysis .On the basis of the type selection of enzyme，the optimum parameters of Herba Taraxaci polysaccharide extraction yield was determined.Results analysis of variance showed that enzyme concentration could have a greater impact on the extraction rate of polysaccharides，then was enzymolysis time and enzyme solution temperature，the last was the pH.The extraction yield by papaya protease was the highest（3.11 %）；The optimal conditions of extraction by enzymatic hydrolysis were:pH 9.20，enzyme solution temperature 46.18℃，enzymolysis time 123min，enzyme content 3.38 %（enzyme quality/quality of dandelion）.

Key words：Herba Taraxaci；polysaccharides；enzymatic hydrolysis；response surface methodology

DOI:10.3969/j.issn.1005-6521.2016.05.012

基金項(xiàng)目:公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)（201503124）；忻州師范學(xué)院大學(xué)生科技創(chuàng)新項(xiàng)目（自然科學(xué)類201428）；忻州師范學(xué)院青年基金項(xiàng)目（201208）

作者簡介:徐瀾（1975—），女（漢），副教授，博士，從事植物有效成分提?。缓底髟耘嗯c農(nóng)業(yè)生態(tài)研究等。

收稿日期:2015-09-06