ADAM17和Notch1在浸潤(rùn)性乳腺癌組織中的表達(dá)及意義

張艷，胡寶山，楊慧敏，孫影，張雪鵬

(1華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院，河北唐山063000；2華北理工大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院)

ADAM17和Notch1在浸潤(rùn)性乳腺癌組織中的表達(dá)及意義

張艷1，胡寶山1，楊慧敏2，孫影2，張雪鵬1

(1華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院，河北唐山063000；2華北理工大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院)

目的 探討解聚素-金屬蛋白酶17(ADAM17)、Notch1在浸潤(rùn)性乳腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。方法 采用免疫組化法檢測(cè)正常乳腺組織、乳腺纖維腺瘤組織及浸潤(rùn)性乳腺癌組織石蠟標(biāo)本(均為30例份)ADAM17和Notch1染色指數(shù)及蛋白陽(yáng)性表達(dá)率，分析二者的相關(guān)性及二者與浸潤(rùn)性乳腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系。采用Western blotting法檢測(cè)新鮮凍存正常乳腺組織、乳腺纖維腺瘤組織及浸潤(rùn)性乳腺癌組織(均為10例份)ADAM17、Notch1蛋白相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果 正常乳腺、乳腺纖維腺瘤、浸潤(rùn)性乳腺癌標(biāo)本及組織中ADAM17、Notch1染色指數(shù)和蛋白相對(duì)表達(dá)量均依次升高(P<0.05或<0.01)。正常乳腺、乳腺纖維腺瘤及浸潤(rùn)性乳腺癌標(biāo)本ADAM17蛋白陽(yáng)性表達(dá)率分別為3.3%、10.0%、83.3%，Notch1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率分別為0、6.7%、76.7%；浸潤(rùn)性乳腺癌標(biāo)本 ADAM17、Notch1陽(yáng)性表達(dá)率均高于正常乳腺、乳腺纖維腺瘤標(biāo)本(P均<0.05)。浸潤(rùn)性乳腺癌標(biāo)本ADAM17和Notch1陽(yáng)性表達(dá)率呈正相關(guān)(r=0.504，P<0.05)。浸潤(rùn)性乳腺癌標(biāo)本ADAM17和Notch1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率均與患者的年齡、腫瘤直徑無關(guān)(P均>0.05)，均與腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05或<0.01)。結(jié)論 浸潤(rùn)性乳腺癌組織中ADAM17和Notch1蛋白表達(dá)升高，其異常表達(dá)可能與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。

浸潤(rùn)性乳腺癌；解聚素-金屬蛋白酶17；Notch1

調(diào)控腫瘤生長(zhǎng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是個(gè)龐大而復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，涉及到多條通路之間的交互和整合。目前研究表明Notch信號(hào)通路是細(xì)胞間信息交流的重要通路，也是許多重要細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的交匯點(diǎn)之一[1]。研究發(fā)現(xiàn)，解聚素-金屬蛋白酶17(ADAM17)對(duì)Notch信號(hào)途徑的激活和轉(zhuǎn)錄具有促進(jìn)作用[2]。在Notch受體家族中，Notch1受體與腫瘤的關(guān)系最受人們關(guān)注，其介導(dǎo)的Notch1信號(hào)通路幾乎與所有類型的惡性腫瘤有關(guān)。既往研究發(fā)現(xiàn)，ADAM17可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移[3～5]，但ADAM17和Notch1在乳腺癌組織中的表達(dá)變化及其與患者臨床病理特征的關(guān)系鮮見報(bào)道。為此我們進(jìn)行了如下研究。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2010年1月～2013年12月華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院病理科保存的正常乳腺組織、乳腺纖維腺瘤組織及浸潤(rùn)性乳腺癌組織石蠟標(biāo)本各30例份(分別簡(jiǎn)稱為正常乳腺標(biāo)本、乳腺纖維腺瘤標(biāo)本及乳腺癌標(biāo)本)，2013年6月～2014年12月華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院于-70 ℃保存的新鮮正常乳腺組織、乳腺纖維腺瘤組織及浸潤(rùn)性乳腺癌組織各10例份(分別簡(jiǎn)稱為正常乳腺組織、乳腺纖維腺瘤組織及乳腺癌組織)。采集標(biāo)本者均為女性，具有完整的臨床資料；浸潤(rùn)性乳腺癌患者均為首次發(fā)病，術(shù)前均未行放、化療或其他抗腫瘤治療，術(shù)后均經(jīng)病理確診。不同組織患者年齡具有可比性。

1.2 ADAM17和Notch1蛋白表達(dá)檢測(cè) ①正常乳腺標(biāo)本、乳腺纖維腺瘤標(biāo)本及乳腺癌標(biāo)本ADAM17和Notch1蛋白檢測(cè)采用免疫組化法。將不同組織石蠟切片經(jīng)脫蠟、高壓抗原修復(fù)后，3% H2O2室溫浸泡30 min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。血清封閉后滴加抗ADAM17、抗Notch1的一抗(1∶100稀釋)，置于4 ℃ 冰箱過夜。次日PBS沖洗，滴加二抗，孵育30 min，PBS沖洗，滴加DAB顯色液。用已知陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性對(duì)照，以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。ADAM17定位于細(xì)胞質(zhì)，Notch1定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)。染色指數(shù)以染色強(qiáng)度評(píng)分與陽(yáng)性細(xì)胞比例評(píng)分的乘積表示。染色強(qiáng)度評(píng)分：細(xì)胞無著色為0分，淡黃色為1分，黃色為2分，棕褐色為3分；陽(yáng)性細(xì)胞比例評(píng)分：陰性為0分，≤10%為1分，11%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。染色指數(shù)>3定義為陽(yáng)性，計(jì)算陽(yáng)性表達(dá)率。分析浸潤(rùn)性乳腺癌組織ADAM17和Notch1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率的關(guān)系。②正常乳腺組織、乳腺纖維腺瘤組織及乳腺癌組織ADAM17和Notch1蛋白檢測(cè)采用Western blotting法。將凍存的不同組織冰上解凍，經(jīng)組織裂解液制成勻漿，提取細(xì)胞總蛋白。取50 μg蛋白100 ℃變性5 min，5%濃縮膠電泳后，轉(zhuǎn)至醋酸纖維素(PVDF)膜。TBST漂洗PVDF膜3次，封閉液中孵育1 h，分別加入兔抗人ADAM17、兔抗人Notch1抗體(1∶1 000稀釋)及GAPDH抗體(1∶1 000稀釋)，4 ℃過夜。TBST沖洗，二抗室溫震蕩孵育1 h，TBST洗滌后，DAB顯色。以GAPDH為參照，采用Image J圖像分析系統(tǒng)分析PVDF中蛋白條帶的灰度值，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白條帶灰度值的比值計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.3 乳腺癌標(biāo)本ADAM17和Notch1蛋白表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系 記錄浸潤(rùn)性乳腺癌患者的年齡、腫瘤直徑和腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況，分析其與乳腺癌標(biāo)本ADAM17和Notch1蛋白表達(dá)的關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 ADAM17和Notch1蛋白表達(dá)情況 正常乳腺標(biāo)本、乳腺纖維腺瘤標(biāo)本及乳腺癌標(biāo)本ADAM17染色指數(shù)分別為1.03±0.38、2.03±0.48、7.31±2.58，Notch1染色指數(shù)分別為0.59±0.20、2.38±0.53、6.41±1.88；三種標(biāo)本中ADAM17和Notch1染色指數(shù)均依次升高(P<0.05或<0.01)。正常乳腺標(biāo)本、乳腺纖維腺瘤標(biāo)本及乳腺癌標(biāo)本ADAM17蛋白陽(yáng)性表達(dá)率分別為3.3%(1/30)、10.0%(3/30)、83.3%(25/30)，Notch1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率分別為0、6.7%(2/30)、76.7%(23/30)；乳腺癌標(biāo)本ADAM17、Notch1陽(yáng)性表達(dá)率均高于正常乳腺標(biāo)本、乳腺纖維腺瘤標(biāo)本(P<0.05)。乳腺癌標(biāo)本ADAM17和Notch1雙陰性表達(dá)率為10.0%(3/30)，雙陽(yáng)性表達(dá)率為70.0%(21/30)，二者陽(yáng)性表達(dá)率呈正相關(guān)(r=0.504，P<0.05)。②正常乳腺組織、乳腺纖維腺瘤組織及乳腺癌組織ADAM17蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.27±0.05、0.37±0.06、0.78±0.10，Notch1蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.15±0.04、0.32±0.05、0.45±0.07；三種組織中ADAM17和Notch1蛋白相對(duì)表達(dá)量依次升高(P<0.05或<0.01)。

2.2 乳腺癌標(biāo)本ADAM17和Notch1蛋白表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系 乳腺癌標(biāo)本ADAM17和Notch1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率均與患者的年齡、腫瘤直徑無關(guān)(P均>0.05)，均與腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05或<0.01)。見表1。

表1 乳腺癌標(biāo)本ADAM17和Notch1蛋白表達(dá) 與患者臨床病理特征的關(guān)系

3 討論

ADAM是一類具有多種生物學(xué)功能的細(xì)胞膜表面糖蛋白家族，也是鋅離子依賴的金屬蛋白酶家族，目前已經(jīng)有40多個(gè)家族成員相繼被發(fā)現(xiàn)。ADAM17是其中研究較廣泛的重要成員之一，因其具有水解TNF-ɑ的作用又稱TNF-ɑ轉(zhuǎn)化酶[6]。ADAM17具有蛋白剪切酶樣作用，通過剪切活化雙調(diào)蛋白、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子等重要的受體配體，從而激活相應(yīng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生物學(xué)活性[7]。ADAM17可通過不同的途徑促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，正常狀態(tài)下在哺乳動(dòng)物的多種細(xì)胞中廣泛表達(dá)，但表達(dá)量較少；而在多種惡性腫瘤組織中呈高表達(dá)狀態(tài)，因此有一定的腫瘤特異性[7]。研究顯示，卵巢癌、胃癌及胰腺癌組織ADAM17表達(dá)升高[8～10]；ADAM17在乳腺癌組織表達(dá)升高，與乳腺癌的惡性程度、臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[4，11,12]。特異性ADAM17小干擾RNA可以有效沉默ADAM17在乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)，使乳腺癌細(xì)胞的增殖能力明顯下降[5]。

目前已在哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)4種Notch基因，分別命名為Notch1、Notch2、Notch3和Notch4。Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)主要發(fā)生在細(xì)胞間，是介導(dǎo)細(xì)胞和細(xì)胞之間直接接觸的信號(hào)通路之一，可以調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化和凋亡。在Notch受體家族中，Notch1受體與腫瘤的關(guān)系最受關(guān)注，但活化形式不同的Notch1對(duì)腫瘤的調(diào)節(jié)作用不一致，且即使在同一種腫瘤，隨著腫瘤發(fā)展階段的不同，Notch1信號(hào)通路的作用也可不一致。Notch1在結(jié)腸癌組織中呈高表達(dá)，與腫瘤病理分型、病程和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，提示Notch1在結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用[13]。研究顯示，Notch1在非小細(xì)胞肺癌、胃癌及卵巢上皮性癌組織中表達(dá)明顯升高[14～16]。

本研究免疫組化法和Western blotting法檢測(cè)結(jié)果均顯示，正常乳腺、乳腺纖維腺瘤及乳腺癌組織和標(biāo)本中ADAM17、Notch1蛋白表達(dá)均依次升高；同時(shí)乳腺癌標(biāo)本ADAM17、Notch1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率均與患者的年齡、腫瘤直徑無關(guān)，與腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。說明浸潤(rùn)性乳腺癌標(biāo)本ADAM17、Notch1蛋白表達(dá)升高，提示患者預(yù)后不良。ADAM17與Notch1受體活化及隨后的Notch1信號(hào)通路激活密切相關(guān)，ADAM17蛋白可通過激活Notch1受體引發(fā)Notch1信號(hào)通路的激活[17，18]。本研究中，乳腺癌標(biāo)本ADAM17和Notch1雙陰性表達(dá)率為10.0%，雙陽(yáng)性表達(dá)率為70.0%，二者陽(yáng)性表達(dá)率呈顯著正相關(guān)。證實(shí)了ADAM17蛋白可以促進(jìn)Notch1信號(hào)途徑的活化，但活化的ADAM17蛋白是通過水解Notch1受體配體、促進(jìn)配體與受體的結(jié)合而啟動(dòng)Notch1信號(hào)途徑，還是直接水解Notch1受體激活Notch1通路，仍需進(jìn)一步研究。

綜上所述，浸潤(rùn)性乳腺癌組織中 ADAM17和Notch1蛋白表達(dá)升高，其異常表達(dá)可能促進(jìn)腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

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河北省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(C2010001767)；唐山市科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(14130256B)。

張雪鵬(E-mail： syzxp@sina.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.32.025

R737.9

B

1002-266X(2016)32-0071-03

2015-12-20)