骨肉瘤組織p53、鼠雙微體2蛋白表達(dá)及意義

秦曉飛，韓志，張勇勇，郭建剛，張志勇，黃滿玉

(河南省洛陽(yáng)正骨醫(yī)院，河南洛陽(yáng)471002)

·臨床研究·

骨肉瘤組織p53、鼠雙微體2蛋白表達(dá)及意義

秦曉飛，韓志，張勇勇，郭建剛，張志勇，黃滿玉

(河南省洛陽(yáng)正骨醫(yī)院，河南洛陽(yáng)471002)

目的 觀察骨肉瘤患者癌組織p53、鼠雙微體2(MDM2)蛋白表達(dá)變化，并探討其與化療療效、預(yù)后的關(guān)系。方法 選擇新輔助化療前的骨肉瘤患者39例，取其活檢獲得的骨肉瘤組織及腫瘤周圍正常骨組織，采用免疫組化法檢測(cè)p53、MDM2蛋白表達(dá)?；颊呓?jīng)新輔助化療及手術(shù)后取其腫瘤組織，HE染色后以腫瘤壞死率評(píng)價(jià)化療敏感性。分析骨肉瘤組織p53、MDM2蛋白表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)(性別、年齡、組織學(xué)類型、化療敏感性)及無(wú)病生存時(shí)間(DFS)的關(guān)系。結(jié)果 39例患者術(shù)前活檢腫瘤組織中p53蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為23.1%(9/39)，MDM2蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為76.9%(30/39)，腫瘤周圍正常骨組織中均未見(jiàn)p53、MDM2蛋白陽(yáng)性表達(dá)；兩者比較P均<0.05。39例患者中，腫瘤壞死率<90%者27例，對(duì)化療敏感性低；≥90%者12例，對(duì)化療敏感性高?；熋舾行缘驼吣[瘤組織p53、MDM2蛋白陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于化療敏感性高者(P均<0.05)；腫瘤組織p53、MDM2蛋白陽(yáng)性表達(dá)率與患者性別、年齡、組織學(xué)類型均無(wú)關(guān)(P均>0.05)。腫瘤組織p53蛋白陰性與陽(yáng)性表達(dá)者DFS分別為34.0(18.8，42.0)、12.0(9.0，17.0)個(gè)月，兩者比較P<0.05；MDM2蛋白陰性與陽(yáng)性表達(dá)者DFS分別為53.0(42.0，63.5)、18.5(12.0，34.0)個(gè)月，兩者比較P<0.05。結(jié)論 骨肉瘤組織p53、MDM2蛋白陽(yáng)性表達(dá)率升高，可導(dǎo)致患者化療敏感性降低及預(yù)后不良。

骨肉瘤；p53；鼠雙微體2；化療敏感性；腫瘤壞死率；預(yù)后

骨肉瘤是青少年原發(fā)性惡性骨腫瘤中發(fā)病率最高的腫瘤之一[1]，自1982年Rosen引入新輔助化療后，骨肉瘤的5年生存率明顯提高，達(dá)到70%～80%[2]，但是仍有20%～30%的患者對(duì)新輔助化療不敏感，預(yù)后較差。在手術(shù)及化療前尋找合適的標(biāo)記物來(lái)區(qū)分這些患者，有助于臨床盡早采取其他有效治療措施，從而提高骨肉瘤患者的總生存率[3，4]。p53、鼠雙微體2(MDM2)與多種腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，但其是否可預(yù)測(cè)骨肉瘤患者的化療敏感性及預(yù)后少見(jiàn)報(bào)道。為此，我們進(jìn)行了如下研究。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2009年1月～2015年1月我院收治的骨肉瘤患者39例，男23例、女16例，年齡11～64歲、平均28歲，病程15天～18個(gè)月；組織學(xué)類型：低級(jí)別型8例(髓內(nèi)高分化骨肉瘤5例、皮質(zhì)旁骨肉瘤3例)，普通型31例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)術(shù)前病理穿刺確診為骨肉瘤；②穿刺前未經(jīng)放療、化療及藥物治療；③于我院擬采取新輔助化療后手術(shù)治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并除骨肉瘤以外的其他惡性腫瘤。②合并嚴(yán)重的心肝腎等系統(tǒng)性疾病。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均知情同意。

1.2 腫瘤組織p53、MDM2蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用免疫組化法。取患者術(shù)前活檢得到的腫瘤組織及腫瘤周圍正常骨組織，常規(guī)石蠟包埋，5 μm厚度切片。脫蠟水化，磷酸緩沖液沖洗，滴加p53、MDM2一抗，4 ℃過(guò)夜；磷酸緩沖液沖洗，滴加二抗，37 ℃孵育20 min；磷酸緩沖液沖洗，DAB顯色；自來(lái)水充分沖洗，復(fù)染，脫水透明，封片。鼠抗人單克隆抗體MDM2購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，鼠抗人p53單克隆抗體、Envision試劑盒購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。p53蛋白、MDM2蛋白陽(yáng)性為細(xì)胞核著色，呈棕黃色。隨機(jī)選擇5個(gè)高倍視野，計(jì)算每個(gè)高倍鏡視野內(nèi)陽(yáng)性細(xì)胞占所有腫瘤細(xì)胞的百分比，取平均值。p53、MDM2陽(yáng)性細(xì)胞比例>10%定義為陽(yáng)性，≤10%定義為陰性，計(jì)算陽(yáng)性表達(dá)率。

1.3 新輔助化療效果判斷及手術(shù)方法選擇 患者均接受甲氨蝶呤、阿霉素、順鉑、長(zhǎng)春新堿和異環(huán)磷酰胺的經(jīng)典方案，進(jìn)行新輔助化療1個(gè)周期?；熃Y(jié)束行CT或MRI檢查，根據(jù)原發(fā)病灶變化情況評(píng)價(jià)新輔助化療效果，并預(yù)計(jì)手術(shù)切緣及術(shù)后肢體功能。對(duì)預(yù)期可獲得陰性切緣并保留可接受術(shù)后肢體功能者行保肢手術(shù)，術(shù)后再行輔助化療；對(duì)由于腫瘤進(jìn)展預(yù)計(jì)無(wú)法獲得陰性切緣或切除腫瘤后殘留功能不優(yōu)于假肢者行截肢手術(shù),術(shù)后再行輔助化療。手術(shù)切除后的標(biāo)本根據(jù)Eaneking等[5]的方法進(jìn)行邊界判斷：囊內(nèi)切除和邊緣切除為邊界不足，廣泛切除和根治切除為邊界足夠。本研究患者均為廣泛切除，具有足夠的邊界。

1.4 術(shù)后化療敏感性評(píng)估 取患者術(shù)中切除的骨肉瘤組織，將其沿腫瘤最大截面處剖開(kāi)，斷面上應(yīng)用網(wǎng)格劃分出若干小塊(根據(jù)腫瘤大小可劃分20～40塊)，每一小塊加以編號(hào)。經(jīng)10%甲醛固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，3 μm厚度連續(xù)切片。脫蠟后分別進(jìn)行HE染色，梯度乙醇脫水，二甲苯透明后封片。將每一小塊封好的切片自然干燥，根據(jù)其大小分成若干視野，分別計(jì)算每一小塊標(biāo)本的腫瘤壞死率，取平均值得出整個(gè)腫瘤斷面的腫瘤壞死率。參照Huvos等[6]的方法，腫瘤壞死率<90%表示化療敏感性低，≥90%表示化療敏感性高。

1.5 骨肉瘤組織p53、MDM2蛋白表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系 采用Fisher′s精確概率法分析術(shù)前活檢骨肉瘤組織p53、MDM2蛋白表達(dá)與患者臨床病理特征(性別、年齡、組織學(xué)類型及化療敏感性)的關(guān)系。

1.6 骨肉瘤組織p53、MDM2蛋白表達(dá)與患者無(wú)病生存時(shí)間(DFS)的關(guān)系 術(shù)后隨訪，記錄患者的DFS，即從手術(shù)開(kāi)始至第1次復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的時(shí)間。分析術(shù)前骨肉瘤組織p53、MDM2蛋白表達(dá)與DFS的關(guān)系。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以M(P25，P75)表示，結(jié)果比較采用秩和檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率表示，結(jié)果比較采用Fisher′s精確概率法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 組織p53、MDM2蛋白表達(dá) 39例患者術(shù)前活檢腫瘤組織中p53蛋白陽(yáng)性表達(dá)9例(23.1%)，陰性表達(dá)30例(76.9%)；MDM2蛋白陽(yáng)性表達(dá)30例(76.9%)，陰性表達(dá)9例(23.1%)；腫瘤周圍正常骨組織p53、MDM2蛋白均為陰性表達(dá)；術(shù)前活檢腫瘤組織p53、MDM2蛋白陽(yáng)性表達(dá)率均高于腫瘤周圍正常骨組織(P均<0.05)。

2.2 化療敏感性 39例患者中，腫瘤壞死率<90%者27例，對(duì)化療敏感性低；≥90%者12例，對(duì)化療敏感性高。

2.3 骨肉瘤組織p53、MDM2蛋白表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系 骨肉瘤組織p53、MDM2蛋白表達(dá)與患者性別、年齡、組織學(xué)類型均無(wú)關(guān)(P均>0.05)?；熋舾行缘驼吣[瘤組織p53、MDM2蛋白陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于化療敏感性高者(P均<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 骨肉瘤組織p53、MDM2蛋白表達(dá)與患者 臨床病理特征的關(guān)系

2.4 骨肉瘤組織p53、MDM2蛋白表達(dá)與患者DFS的關(guān)系 術(shù)后隨訪時(shí)間3～79個(gè)月，中位隨訪時(shí)間28個(gè)月。腫瘤組織p53蛋白陰性及陽(yáng)性表達(dá)者DFS分別為34.0(18.8，42.0)、12.0(9.0，17.0)個(gè)月，兩者比較P<0.05；MDM2蛋白陰性及陽(yáng)性表達(dá)者DFS分別為53.0(42.0，63.5)、18.5(12.0，34.0)個(gè)月，兩者比較P<0.05。

3 討論

骨肉瘤患者接受化療前如能預(yù)測(cè)其化療敏感性，將有助于改善治療方案。近年來(lái)，預(yù)測(cè)新輔助化療療效標(biāo)志物的研究較多，戴閩等[7]研究表明,骨肉瘤中P-糖蛋白、Survivin的表達(dá)情況對(duì)化療療效均有一定的預(yù)測(cè)價(jià)值,其中Survivin價(jià)值更高。p53基因位于染色體17p13.1，是細(xì)胞生長(zhǎng)周期的負(fù)調(diào)節(jié)因子，與細(xì)胞周期調(diào)控、DNA修復(fù)、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡等生物學(xué)功能有關(guān)。p53分野生型和突變型兩種，野生型p53蛋白極不穩(wěn)定，半衰期20～30 min，具有抑癌作用，而免疫組化和原位雜交技術(shù)檢測(cè)到的實(shí)際是突變型p53蛋白，具有癌基因作用[8]。本研究39例患者腫瘤組織p53蛋白陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于腫瘤周圍正常骨組織，且p53蛋白陰性表達(dá)者DFS明顯長(zhǎng)于陽(yáng)性表達(dá)者。提示p53突變?cè)诠侨饬龅陌l(fā)生及發(fā)展中發(fā)揮重要作用，骨肉瘤患者腫瘤組織p53蛋白陽(yáng)性表達(dá)率升高與其預(yù)后差有關(guān)。

MDM2是目前為止發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的凋亡抑制因子之一，是一種與惡性腫瘤發(fā)生密切相關(guān)的癌基因，其編碼的蛋白質(zhì)可與p53蛋白結(jié)合，導(dǎo)致具有抑癌基因作用的野生型p53失活，下調(diào)細(xì)胞內(nèi)p53水平，從而使其形成負(fù)反饋調(diào)節(jié)環(huán)，精密調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)p53水平，使細(xì)胞轉(zhuǎn)化、增殖和惡變的能力增強(qiáng)[9，10]。近年來(lái)，已在多種人類腫瘤中證實(shí)MDM2蛋白基因突變、擴(kuò)增、過(guò)表達(dá)與患者的預(yù)后不良有關(guān)[11，12]。本研究39例患者腫瘤組織MDM2蛋白陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于腫瘤周圍正常骨組織，且MDM2蛋白陰性表達(dá)者DFS明顯長(zhǎng)于陽(yáng)性表達(dá)者。提示MDM2在骨肉瘤發(fā)生發(fā)展中起重要作用， MDM2蛋白陽(yáng)性表達(dá)率升高與患者預(yù)后差有關(guān)。另外，MDM2的小分子拮抗劑如Nutlin-3、RG7112、SAR405838等，能夠抑制MDM2與p53的結(jié)合，釋放出p53并恢復(fù)其功能，從而達(dá)到治療腫瘤的目的[13～15]。因此，MDM2可作為骨肉瘤治療的一個(gè)潛在靶點(diǎn)。

病理組織學(xué)觀察腫瘤壞死率是判斷化療敏感性及患者預(yù)后的金標(biāo)準(zhǔn)，也是指導(dǎo)術(shù)后化療的重要指標(biāo)[16～18]。本研究結(jié)果顯示，術(shù)前骨肉瘤組織p53、MDM2蛋白陽(yáng)性表達(dá)率與患者性別、年齡、組織學(xué)類型均無(wú)關(guān)，而化療敏感性低者p53、MDM2蛋白陽(yáng)性表達(dá)率均明顯高于化療敏感性高者。提示骨肉瘤組織p53、MDM2蛋白陽(yáng)性表達(dá)率升高與患者化療敏感性降低有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，術(shù)前腫瘤組織p53、MDM2蛋白陰性表達(dá)者DFS明顯長(zhǎng)于陽(yáng)性表達(dá)者，表明p53、MDM2蛋白參與了骨肉瘤病程的推進(jìn)，與骨肉瘤患者的不良預(yù)后密切相關(guān)，可作為評(píng)估患者預(yù)后的重要指標(biāo)。

綜上所述，骨肉瘤組織p53、MDM2蛋白陽(yáng)性表達(dá)率升高，與患者化療敏感性降低及預(yù)后不良有關(guān)。參考文獻(xiàn)：

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