二十二碳六烯酸對脊髓損傷大鼠神經(jīng)功能恢復的影響及其機制

蔣春閃，呂游，陳金傳，孟祥圣，張劍，劉藝

(1徐州醫(yī)科大學附屬連云港醫(yī)院，江蘇連云港222000；2徐州醫(yī)科大學)

二十二碳六烯酸對脊髓損傷大鼠神經(jīng)功能恢復的影響及其機制

蔣春閃1，呂游1，陳金傳1，孟祥圣1，張劍2，劉藝1

(1徐州醫(yī)科大學附屬連云港醫(yī)院，江蘇連云港222000；2徐州醫(yī)科大學)

目的 觀察二十二碳六烯酸(DHA)對脊髓損傷大鼠神經(jīng)功能恢復的影響，并探討其可能的機制。方法 將60只成年雄性SD大鼠按隨機數(shù)字表法分為假手術組、模型組和觀察組，每組20只。模型組和觀察組制備脊髓損傷模型，假手術組只暴露但不損傷脊髓。造模后0.5 h，觀察組經(jīng)尾靜脈注射DHA 1 000 nmol/kg，連用3天。各組分別于造模前1天(t0)及造模后1天(t1)、3天(t2)、7天(t3)、21天(t4)，記錄斜板試驗最大角度和脊髓損傷評分(BBB評分)；于T1～T4分別取5只大鼠，觀察脊髓病理形態(tài)，采用免疫組化法檢測脊髓神經(jīng)元核抗原(NeuN)與神經(jīng)膠質纖維酸性蛋白(GFAP)表達。結果 模型組和觀察組T1～T4斜板試驗最大角度及BBB評分均明顯低于T0和假手術組同時間點，模型組T3、T4斜板試驗最大角度及BBB評分均明顯低于觀察組同時間點(P均<0.05)。與假手術組比較，模型組和觀察組T1～T4脊髓形態(tài)均發(fā)生病理性改變，觀察組較模型組病理性改變有所改善。與假手術組比較，模型組和觀察組T1～T4脊髓背角和腹角NeuN表達均降低，但模型組降低更明顯(P均<0.05)。與假手術組比較，模型組和觀察組T1～T4GFAP表達均升高，但模型組T3、T4升高更明顯(P均<0.05)。結論 DHA能夠減輕脊髓損傷大鼠的病理損傷，促進神經(jīng)功能的恢復；升高脊髓NeuN表達、降低GFAP表達可能是其作用機制。

脊髓損傷；二十二碳六烯酸；神經(jīng)元核抗原；神經(jīng)膠質纖維酸性蛋白；大鼠

脊髓損傷常導致嚴重傷殘，神經(jīng)修復與再生是脊髓損傷恢復的關鍵環(huán)節(jié)。目前其治療方法主要是手術減壓和大劑量甲強龍沖擊治療，但療效尚存在爭議[1～3]。n-3多不飽和脂肪酸(n-3 PUFAs)主要包含二十二碳六烯酸(DHA)、二十碳五烯酸(EPA)和α-亞麻酸(ALA)，其中DHA廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)細胞膜上，其含量占n-3 PUFAs的50%以上，對神經(jīng)修復與再生具有關鍵作用[4，5]。2015年3～10月，我們觀察了DHA對脊髓損傷大鼠神經(jīng)功能恢復的影響，并探討其相關機制。

1 材料與方法

1.1 材料 成年雄性SD大鼠60只，健康清潔級，6～7周齡，體質量200～250 g，購于徐州醫(yī)科大學動物實驗中心。試劑及儀器：DHA(Sigma公司，美國)，Anti-NeuN試劑盒(Abcam公司，英國)，Anti-GFAP試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；BX41光學顯微鏡(Olympus公司，日本)。

1.2 模型制備及分組處理 將60只成年雄性SD大鼠按隨機數(shù)字表法分為假手術組、模型組和觀察組，每組20只。模型組和觀察組采用改良Allen打擊法[6]制備脊髓損傷模型：兩組均以10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射麻醉，固定于動物實驗臺上，剪去術野背毛，常規(guī)消毒鋪巾。以胸椎T10為中心，取后正中切口約4 cm逐層切開，剝離椎板兩旁肌肉，充分暴露T9～T11椎板及棘突；小心去除T9、T10椎板，充分顯露T10節(jié)段脊髓(約1.0 cm×0.6 cm)。在脊髓上置一塊薄明膠墊，以10 g打擊棒自10 cm處垂直自然下落，精確致傷明膠墊處脊髓，致傷能量約100 gcf(gram cm force)，打擊棒停留1 min后移開。清洗、止血、縫合，肌注2.5萬U/(kg·d)青霉素預防感染，連用3天。假手術組只暴露但不損傷脊髓。模型組和觀察組均出現(xiàn)雙下肢軀體回縮樣撲動，尾巴出現(xiàn)痙攣性擺動，證實造模成功。各組術后每日早中晚按摩膀胱輔助排尿3次，直至恢復自主排尿。造模后0.5 h，觀察組參照Lim等[7]的方法經(jīng)尾靜脈注射DHA 1 000 nmol/kg，連用3天。

1.3 相關指標觀察

1.3.1 神經(jīng)功能 各組分別于造模前1天(t0)及造模后1天d(t1)、3 天(t2)、7天(t3)、21天(t4)行斜板試驗和脊髓損傷評分(BBB評分)。①斜板試驗：將大鼠置于一長方形帶橫紋膠墊木制斜板上，保持大鼠身體縱線與斜板縱軸垂直放置，逐漸升高斜板高度，記錄大鼠在斜板上停留5 s的最大角度，重復5次，取平均值。②BBB評分：將大鼠置于寬闊活動場地自由活動5 min，觀察其后肢運動、軀干位置及穩(wěn)定性、步態(tài)、協(xié)調性、爪的置放及尾巴的位置，對左右下肢分別評分并取平均值，滿分為21分。斜板試驗和BBB評分均由兩位熟悉評分標準但不參與實驗分組的人員進行操作，斜板試驗最大角度越大、BBB評分越高，說明神經(jīng)功能越好。

1.3.2 脊髓病理形態(tài) 各組于t1～t4分別取5只大鼠，取仰臥位。經(jīng)左心房插管至主動脈內(nèi)固定，剪開右心耳，用生理鹽水灌注至右心耳流出澄清液體，再以4%多聚甲醛先快后慢灌注至大鼠四肢抽搐，尾巴僵直。取損傷中心上下約2 cm的脊髓，置于10%多聚甲醛中保存24 h，常規(guī)石蠟包埋。損傷中心連續(xù)橫斷切片10張，片厚約為5 μm。隨機選取3張脊髓橫斷面切片行HE染色，光學顯微鏡下觀察脊髓病理形態(tài)。

1.3.3 脊髓神經(jīng)元核抗原(NeuN)和神經(jīng)膠質纖維酸性蛋白(GFAP)表達 取各組t1～t4的脊髓橫斷面切片，采用免疫組化SP法檢測NeuN和GFAP表達，嚴格按照試劑盒說明書操作。以神經(jīng)細胞染成棕黃色定義為陽性，每張切片隨機選取脊髓腹角與背角各3個不重疊的高倍視野，采用Image-Pro Plus 6.0軟件檢測脊髓背角與腹角NeuN、GFAP陽性顆粒平均分光光密度值(OD值)，取平均值。

2 結果

2.1 三組神經(jīng)功能比較 模型組和觀察組t1～t4斜板試驗最大角度及BBB評分均明顯低于同組t0和假手術組同時間點，模型組t3、t4斜板試驗最大角度及BBB評分均明顯低于觀察組同時間點(P均<0.05)。見表1。

2.2 三組脊髓病理形態(tài)比較 假手術組各時間點脊髓形態(tài)完整，灰白質分界清楚，神經(jīng)細胞呈典型多極神經(jīng)元，尼氏體分布均勻，白質纖維走形正常。模型組t1可見彌漫性出血，神經(jīng)元明顯減少，灰白質分界不清，白質空泡明顯；t2出血相對減少，可見灰質碎解，結構消失，有膠質細胞聚集；t3出血基本消失，神經(jīng)元固縮變形，核偏移，可見小空洞形成；t4神經(jīng)元減少，部分嗜酸性變，反應性膠質細胞增多，白質纖維走形紊亂，有形成膠質瘢痕的趨勢。與模型組比較，觀察組相同時間點出血明顯減少，灰白質結構相對清晰，可見神經(jīng)元水腫變性及白質空泡；隨著時間推移，觀察組神經(jīng)細胞逐漸恢復為典型的多極神經(jīng)元形態(tài)，白質空泡減少，結構近乎正常。

表1 三組不同時間點斜板試驗最大角度和 BBB評分比較

注：與同組t0比較，*P<0.05；與假手術組同時間點比較，#P<0.05；與模型組同時間點比較，△P<0.05。

2.3 三組脊髓NeuN和GFAP表達比較 與假手術組比較，模型組和觀察組t1～t4脊髓背角和腹角NeuN表達均降低，但模型組降低更明顯(P均<0.05)。與假手術組比較，模型組和觀察組t1～t4GFAP表達均升高，但模型組t3、t4升高更明顯(P均<0.05)。見表2。

表2 三組脊髓NeuN和GFAP表達比較(OD值，

注：與假手術組同時間點比較，#P<0.05；與模型組同時間點比較，△P<0.05。

3 討論

脊髓損傷包括神經(jīng)元及血管破壞引起的原發(fā)性損傷和一系列生化機制改變引起的繼發(fā)性損傷，二者共同導致神經(jīng)元的退變、壞死和膠質細胞活化等病理反應[8]。研究表明，DHA可以通過多種抗炎機制減少損傷后神經(jīng)元的丟失，促進神經(jīng)修復與再生[9,10]。DHA屬于n-3多不飽和脂肪酸的一種，有“腦黃金”之美譽，主要從深海魚油和藻類中提煉，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)多不飽和脂肪酸的主要成分，可促進嬰兒大腦發(fā)育[11]。DHA具有高度不飽和性，可以增加神經(jīng)元細胞膜的流動性，在神經(jīng)元的生化反應中具有重要作用。Pu等[12]研究發(fā)現(xiàn)，n-3 PUFAs 可改變腦損傷小鼠神經(jīng)細胞膜上的脂筏結構，與花生四烯酸競爭代謝，減輕炎癥介質的釋放，抑制膠質細胞活化與興奮性神經(jīng)毒性，減少神經(jīng)元的丟失與脫髓鞘變化。本研究觀察組神經(jīng)功能較模型組明顯提高，說明DHA可以促進大鼠神經(jīng)功能恢復； 觀察組脊髓組織出血、水腫及滲出、壞死情況較模型組有明顯改善，說明DHA可減輕脊髓損傷后的炎癥反應，抑制脊髓繼發(fā)性損害。

脊髓損傷后成熟神經(jīng)元的數(shù)量可直接反映神經(jīng)功能狀態(tài)。NeuN是成熟神經(jīng)元的特異性標記物，有46、48 kD兩個亞型，分別在細胞核和細胞質表達[13]。脊髓損傷后即可發(fā)生神經(jīng)元的變性、壞死和凋亡，NeuN蛋白可反映神經(jīng)元存活狀態(tài)。打擊傷可對直接打擊側(背角)與間接打擊側(腹角)均造成損傷，因此本研究采用NeuN蛋白評價神經(jīng)元的損傷程度。結果顯示，與模型組比較，觀察組脊髓背角與腹角NeuN蛋白表達均顯著增高，說明DHA可促進神經(jīng)元的修復與再生。

GFAP是活化星形膠質細胞標志物，其表達水平可反映星形膠質細胞的功能狀態(tài)。雖然星形膠質細胞是形成膠質瘢痕的主要因素，但其活化后聚集于損傷組織周圍，可以分泌一系列細胞因子，改善損傷組織的微環(huán)境，有利于損傷區(qū)域神經(jīng)元的修復與再生[14]。GFAP在脊髓損傷后廣泛分布，區(qū)域性分布并不顯著。因此，本研究未分別觀察脊髓背角與腹角GFAP表達。本研究結果顯示，與模型組各時間點比較，觀察組GFAP表達均降低，且t3、t4降低更明顯。考慮到模型組早期神經(jīng)元大量變性壞死，相對于觀察組應有大量星形膠質細胞活化聚集，但本研究結果顯示模型組早期星形膠質細胞活化程度并不明顯強于觀察組。我們猜測雖然DHA可以減少GFAP表達，在一定程度上抑制星形膠質細胞活化，但在早期可能對其活化有一定的促進作用。但是目前尚無研究報道證實，有待于進一步研究。

綜上所述，DHA能促進脊髓損傷大鼠的神經(jīng)功能恢復，其機制可能與升高脊髓NeuN表達、降低GFAP表達有關。

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劉藝(E-mail： 80600026@qq.com)

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