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    急性早幼粒細(xì)胞白血病PML/RARα融合基因檢測(cè)的臨床意義

    2016-05-11 06:35:03劉小寧李元媛甘宜敏陳鳳麗衡春于亮

    劉小寧,李元媛,甘宜敏,陳鳳麗,衡春,于亮

    (南京醫(yī)科大學(xué)附屬淮安市第一人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室,江蘇淮安223300)

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    急性早幼粒細(xì)胞白血病PML/RARα融合基因檢測(cè)的臨床意義

    劉小寧,李元媛,甘宜敏,陳鳳麗,衡春,于亮

    (南京醫(yī)科大學(xué)附屬淮安市第一人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室,江蘇淮安223300)

    摘要:目的探討熒光原位雜交技術(shù)(FISH)檢測(cè)PML/RARα融合基因在急性早幼粒細(xì)胞白血?。ˋPL)診斷中的應(yīng)用價(jià)值。方法應(yīng)用常規(guī)細(xì)胞遺傳學(xué)分析28例APL患者的染色體核型,同時(shí)用FISH法檢測(cè)PML/RARα融合基因。結(jié)果28例初診的APL患者254例常規(guī)核型分析檢出t(15;17)(q22;q12);2例患者核型正常;另1例未檢出t(15;17),核型分析結(jié)果為涉及15和17號(hào)染色體的復(fù)雜異常;FISH檢測(cè)所有病例均存在PML/RARα融合基因。結(jié)論FISH法行PML/RARα融合基因檢測(cè)特異性和敏感性好,是診斷APL的可靠方法。

    關(guān)鍵詞:急性早幼粒細(xì)胞白血病;PML/RARα融合基因;熒光原位雜交技術(shù)(FISH);染色體

    急性早幼粒細(xì)胞白血?。ˋPL)是急性白血病中的一種特殊類型,其臨床特點(diǎn)是出血傾向嚴(yán)重,常易并發(fā)DIC及原發(fā)性纖溶亢進(jìn),早期病死率高,所以,APL早期診斷和及早治療至關(guān)重要。現(xiàn)已明確,t(15;17)是APL特征性染色體異常,并在分子水平上導(dǎo)致PML/RARα融合基因形成[1]。為進(jìn)一步明確臨床上表現(xiàn)為APL特征的患者,我們經(jīng)過(guò)對(duì)住院治療的28例APL患者進(jìn)行染色體和PML/ RARα融合基因的檢查,以探討他們?cè)贏PL診斷中的應(yīng)用價(jià)值。

    1 材料與方法

    1.1對(duì)象一般資料選取2009年1月至2011年3月在我院血液科初診的28例APL患者,其中男16例,女12例,年齡14~82歲,平均年齡39.6歲。所有患者初診時(shí)均有臨床癥狀,并經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)及組化染色初步診斷為APL。正常對(duì)照選用5例血液系統(tǒng)正常者的骨髓標(biāo)本。

    1.2方法

    1.2.1染色體核型分析取治療前患者和正常對(duì)照組的骨髓細(xì)胞(肝素抗凝),采用直接法和24h短期培養(yǎng)法培養(yǎng)細(xì)胞,按常規(guī)方法收獲細(xì)胞,用R顯帶進(jìn)行核型分析,染色體異常按《人類細(xì)胞遺傳學(xué)國(guó)際命名體制(ISCN2005ISCN2013)》的有關(guān)規(guī)定加以描述[2]。剩余細(xì)胞懸液凍存于-20℃冰箱內(nèi)以供FISH檢測(cè)。

    1.2.2熒光原位雜交(FISH)檢測(cè)

    1.2.2.1融合基因探針雙色融合(PML/RARα)探針購(gòu)自Vysis公司,-20℃保存?zhèn)溆?。PML和RARα分別應(yīng)用SpectrumOrange和SpectrumGreen兩種熒光素標(biāo)記。

    1.2.2.2雜交取儲(chǔ)存于-20℃的骨髓細(xì)胞懸液,更換新鮮的甲醇/冰醋酸(3:1)固定液,滴片,晾干,過(guò)夜老化。加探針混合物,蓋片,封膠,置雜交儀濕盒中變性雜交。變性:72℃,2min;雜交:37℃,16~24h。次日將雜交后標(biāo)本依次浸入72℃0.4×SSC、2×SSC/ 0.1%NP40中漂洗,避光晾干后加DAPI復(fù)染,封片。

    1.2.2.3熒光顯微鏡檢查應(yīng)用熒光顯微鏡在DAPI/FITC濾色鏡的激發(fā)下觀察間期細(xì)胞的熒光雜交信號(hào)。正常細(xì)胞為:2個(gè)紅色2個(gè)綠色彼此分離的4個(gè)熒光信號(hào);伴有t(15;17)染色體易位的細(xì)胞核中可見(jiàn)1個(gè)紅色、1個(gè)綠色和2個(gè)黃色融合信號(hào);正常對(duì)照組取值方法參考有關(guān)文獻(xiàn)[3,4],以大于x+3s作為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn),PML/RARα的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)為>2.56%。每例至少分析200個(gè)細(xì)胞,計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分比。

    2 結(jié)果

    2.1染色體核型分析結(jié)果染色體分析28例患者中25例檢出t(15;17),陽(yáng)性率為89.3%;2例染色體核型結(jié)果正常;另1例未檢出t(15;17),但核型分析為涉及15和17號(hào)染色體的復(fù)雜異常核型。對(duì)照組5例核型分析結(jié)果均正常。見(jiàn)(表1、圖1。)

    表1 28例APL患者與對(duì)照組核型

    圖1 核型分析結(jié)果圖

    2.2 FISH檢測(cè)結(jié)果28例APL患者經(jīng)FISH檢測(cè)均發(fā)現(xiàn)有PML/RARα融合基因存在。見(jiàn)表2、圖2。

    3 討論

    APL是一種特殊類型的白血病,具有相對(duì)特異的形態(tài)學(xué)特征及細(xì)胞分子遺傳學(xué)特征,其形態(tài)特征為胞漿含有大量顆粒的異常早幼粒細(xì)胞,細(xì)胞分子遺傳學(xué)特征為染色體檢查可見(jiàn)特異的t(15;17),該易位導(dǎo)致17q的維甲酸受體α(RARα)基因與位于15q上的早幼粒細(xì)胞白血病(PML)基因融合,形成了PML/RARα融合基因,后者產(chǎn)生的PML/RARα融合蛋白通過(guò)一系列信號(hào)途徑,使造血干細(xì)胞分化阻斷在早幼粒階段而發(fā)生白血病轉(zhuǎn)化[5]。

    表2 FISH法檢測(cè)PML/RARα

    圖2 FISH檢測(cè)結(jié)果圖

    以往APL的診斷通常依靠細(xì)胞形態(tài)學(xué)及常規(guī)染色體檢查,但由于骨髓早階段細(xì)胞形態(tài)有相似之處,且少數(shù)變異型APL(M3v)形態(tài)學(xué)不典型,因此形態(tài)學(xué)有時(shí)難以診斷APL;常規(guī)染色體檢測(cè)也是常用的手段,約85%的APL可檢出t(15;17),然而臨床上仍有15%左右的病例由于核型分析的中期細(xì)胞數(shù)量少、質(zhì)量差或15;17隱匿性及變異型易位而導(dǎo)致t(15;17)漏檢[6]。我們總結(jié)28例APL患者,有89.3%的患者通過(guò)常規(guī)染色體核型分析檢出t(15;17),與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果相似[7];28例APL中有2例患者的核型正常,另1例APL的核型分析未檢出t(15;17),只檢測(cè)到涉及15號(hào)和17號(hào)異常的復(fù)雜核型,但其臨床癥狀和細(xì)胞形態(tài)學(xué)支持APL的診斷,染色體核型結(jié)果不能排除15;17隱匿性及變異型易位。由此可見(jiàn)常規(guī)細(xì)胞遺傳學(xué)結(jié)果并不能全面反映APL群體,核型分析有時(shí)難以肯定是否伴有特征性分子異常,因此我們對(duì)上述標(biāo)本進(jìn)行了分子生物學(xué)的檢測(cè)。

    分子檢測(cè)手段包括RT-PCR、Southern雜交、Northern雜交、FISH等技術(shù)。臨床上檢測(cè)PML/ RARα常用熒光定量RT-PCR技術(shù)[8]R,T-PCR技術(shù)其盡管敏感性高,但易出現(xiàn)假陰性和假陽(yáng)性,引物的設(shè)計(jì)也影響檢出[9,10]。Southern和Northern雜交技術(shù)操作過(guò)程繁瑣,不適宜常規(guī)臨床檢測(cè)。FISH技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種較理想的快速、可定量檢測(cè)方法,在本組研究中的初診APL患者PML/RARα融合基因檢出率為28/28(100%),高于常規(guī)核型的陽(yáng)性檢出率24/28(89.3%),核型檢出t (15;17)的25例患者PML/RARα融合基因均陽(yáng)性;本組的2例核型正?;颊逷ML/RARα融合基因亦為陽(yáng)性,表明他們是隱匿性t(15;17)易位的APL;另1例累及15、17號(hào)染色體的復(fù)雜核型經(jīng)FISH檢測(cè)除PML/RARα融合基因陽(yáng)性外,發(fā)現(xiàn)易位還涉及15、17號(hào)之外的第3條染色體,提示不典型的FISH信號(hào)模式的患者存在更為復(fù)雜的遺傳學(xué)異常[11]。結(jié)果提示其為復(fù)雜變異易位。由此可見(jiàn)FISH法檢測(cè)PML/RARα融合基因的敏感性及特異性均優(yōu)于常規(guī)細(xì)胞遺傳學(xué),尤其對(duì)于核型檢測(cè)正常和具有復(fù)雜變異易位的病例起到了明確診斷的作用[12]。

    臨床上凡具有t(15;17)易位或有PML/RARα融合基因的APL對(duì)維甲酸和砷制劑治療有效,但還有少數(shù)APL患者伴有變異型染色體易位如t(5;17),t (11;17)等,這類患者對(duì)維甲酸治療反映差[13,14],故準(zhǔn)確檢測(cè)t(15;17)易位和PML/RARα融合基因?qū)τ贏PL診斷、指導(dǎo)治療有重要的指導(dǎo)作用,鑒于FISH法檢測(cè)t(15;17)易位形成的PML/RARα融合基因高靈敏度,在APL的診斷中具有重要價(jià)值,而染色體核型分析和FISH兩種檢測(cè)方法同時(shí)應(yīng)用具有一定的互補(bǔ)性[15]。而PML/RARα融合基因在APL的預(yù)后判斷及治療效果方面的意義還值得我們進(jìn)一步研究。

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    ·論著·

    Clinical significance of detecting PML/RARα fusion gene in acute promyelocytic leukemia

    LIU Xiaoning,LI Yuanyuan,GAN Yimin,CHEN Fengli,HENG Chun,YU Liang,et al. Central Laboratory,No.1 Hospital of Huai’an,Nanjing Medical University,Huai’an Jiangsu 223300,China.

    Abstract:Objective To explore the application value of detecting PML/RARα fusion gene in the diagnosis of acute promyelocytic leukemia(APL) with fluorescence in situ hybridization(FISH). Methods The chromosome karyotype of 28 cases of APL patients was analyzed with the conventional cytogenetic analysis method and the PML/RARα fusion gene was detected with FISH method. Results Among 28 first diagnosed APL patients,the t (15;17)(q22;q12) was detected in 24 25 patients with the conventional karyotype analysis;Two patients were detected to be normal karyotype;And the t (15;17) was not detected in one case. The karyotype analysis results showed the complex abnormalities involving in the chromosome 15 and 17;The PML/RARα fusion gene was detected to exist in all cases with FISH detection. Conclusion The PML/RARα fusion gene detection with FISH method is a reliable way for the diagnosis of APL with fine specificity and sensitivity.

    Key words:Acute promyelocytic leukemia;PML/RARα fusion gene;Fluorescence in situ hybridization(FISH);Chromosome

    (收稿日期2014-08-22;修回日期2016-03-15)

    作者簡(jiǎn)介:劉小寧,女,1969年2月出生,副主任技師,醫(yī)學(xué)學(xué)士,臨床檢驗(yàn)專業(yè)。研究方向:血液學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)診斷。

    基金項(xiàng)目:江蘇省自然科學(xué)基金項(xiàng)目,編號(hào):BK20141254。

    DOI:10.3969/j.issn.1674-1129.2016.02.004

    中圖分類號(hào):R733.71,R446.62

    文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

    文章編號(hào):1674-1129(2016)02-0140-03

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