熒光原位雜交技術(shù)在套細(xì)胞淋巴瘤石蠟切片的應(yīng)用研究

吳蔚，倪軍，王紅，孫幸，方悅之，顧健

(江蘇省蘇北人民醫(yī)院，揚(yáng)州市血液學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)室，江蘇揚(yáng)州225001)

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熒光原位雜交技術(shù)在套細(xì)胞淋巴瘤石蠟切片的應(yīng)用研究

吳蔚，倪軍，王紅，孫幸，方悅之，顧健

(江蘇省蘇北人民醫(yī)院，揚(yáng)州市血液學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)室，江蘇揚(yáng)州225001)

摘要:目的建立淋巴瘤石蠟切片應(yīng)用熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)檢測的操作流程，探討其在套細(xì)胞淋巴瘤（mantle cell lymphoma，MCL）診斷中的應(yīng)用價(jià)值。方法優(yōu)化石蠟切片F(xiàn)ISH檢測步驟和實(shí)驗(yàn)條件，在16例病理擬診斷MCL的石蠟切片上應(yīng)用FISH檢測IGH/CCND1融合基因。結(jié)果確立了本實(shí)驗(yàn)室石蠟切片F(xiàn)ISH檢測的實(shí)驗(yàn)方法和條件；擬診斷MCL的病例中IGH/CCND1融合基因陽性檢出率為75%（12/16）。結(jié)論淋巴瘤石蠟切片F(xiàn)ISH檢測可滿足臨床應(yīng)用要求；應(yīng)用FISH技術(shù)檢測IGH/CCND1融合基因有助于MCL的診斷。

關(guān)鍵詞：熒光原位雜交；石蠟包埋；套細(xì)胞淋巴瘤；IGH/CCND1

淋巴瘤是一組異質(zhì)性疾病，分類復(fù)雜，依據(jù)形態(tài)學(xué)和免疫組化鑒別有時仍難以確診和準(zhǔn)確分型。2008年WHO修訂和出版的第4版《造血和淋巴組織腫瘤》WHO分類，淋巴瘤診斷標(biāo)準(zhǔn)包括形態(tài)學(xué)特征、免疫特征、遺傳學(xué)改變，提出特異性的遺傳學(xué)改變是淋巴瘤的重要診斷指標(biāo)。

大部分惡性淋巴瘤只有在晚期侵犯骨髓時，骨髓的細(xì)胞遺傳學(xué)分析才能發(fā)現(xiàn)異常染色體；在臨床研究中，很難取得新鮮的病理組織制成單個核細(xì)胞懸液行遺傳學(xué)分析，所以淋巴瘤早期遺傳學(xué)信息比較缺乏。

為滿足淋巴瘤臨床診斷和分型提出的更高要求，提高本實(shí)驗(yàn)室淋巴瘤的遺傳學(xué)研究，我們在病理擬診斷套細(xì)胞淋巴瘤（mantle cell lymphoma， MCL）的石蠟切片上利用熒光原位雜交技術(shù)（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）檢測t(11；14) (q13；q32)形成的IGH/CCND1融合基因，探索本實(shí)驗(yàn)室FISH檢測石蠟切片的最佳實(shí)驗(yàn)條件，建立本實(shí)驗(yàn)室的操作步驟；初步評估FISH檢測IGH/CCND1融合基因在MCL診斷的應(yīng)用價(jià)值。

1　對象與方法

1.1病例資料選擇了江蘇省蘇北人民醫(yī)院2010 年1月至2014年12月病理擬診斷MCL的石蠟切片16例，切片標(biāo)本由病理科提供，診斷依據(jù)張之南主編的《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》[1]。其中男12例，女4例，年齡59～75歲，平均為67歲。對照組為5例反應(yīng)性增生的淋巴結(jié)石蠟切片。

1.2主要試劑和儀器位點(diǎn)特異性探針GLP IGH/ GLP CCND1購自北京金菩嘉醫(yī)療科技有限公司；胃蛋白酶購自SIGMA公司；熒光顯微鏡：Olympus BX51熒光顯微鏡（日本Olympus公司）；FISH圖像分析軟件：Imstar FISH 3.0進(jìn)行圖像采集和保存。

1.3方法

1.3.1根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室骨髓細(xì)胞FISH檢測[2]，查閱文獻(xiàn)[3－5]，建立初步的石蠟切片的FISH檢測步驟，發(fā)現(xiàn)雜交信號分析存在的問題：細(xì)胞核輪廓不清，出現(xiàn)重疊，信號雜亂無法分析等。

1.3.2優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件⑴石蠟切片厚度設(shè)為4μm。⑵脫蠟：初始的實(shí)驗(yàn)方法建議用高壓鍋煮沸EDTA溶液，將玻片浸入進(jìn)行抗原修復(fù)。此步驟在臨床操作過程中煩瑣，效果不好控制。我們改為：將玻片泡在蒸餾水（枸櫞酸鈉溶液）中用微波爐水煮，中高火5min，高火5min，待自然冷卻后取出。在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞輪廓是否清楚，背景是否干凈調(diào)整時間。這樣效果可控，操作可行。⑶初始使用胃蛋白酶的濃度為及消化時間：50mg/0.5ml胃蛋白酶儲存液，10min。我們改為：消化10min后，晾干玻片，加10μl DAPI蓋上蓋玻片，在熒光顯微鏡下DAPI通道下觀察細(xì)胞核，根據(jù)是否出現(xiàn)完整、清晰的細(xì)胞決定是否需要進(jìn)一步消化。如消化不完全，用2×SSC 1min洗去DAPI，繼續(xù)在胃蛋白酶中消化2～3min。⑷血液標(biāo)本常規(guī)變性的溫度78℃，但在石蠟切片上信號比較散，我們改為83℃。

3 FISH結(jié)果判斷IGH/CCND1融合基因結(jié)果判斷：IGH基因位于14號染色體長臂3區(qū)2帶斷裂點(diǎn)，由綠色熒光素標(biāo)記；CCND1基因位于11號染色體長臂1區(qū)3帶斷裂點(diǎn)，由紅色熒光素標(biāo)記。正常細(xì)胞為兩紅兩綠，異常細(xì)胞為二黃一紅一綠。

5例反應(yīng)性增生的淋巴結(jié)石蠟切片應(yīng)用FISH檢測IGH/CCND1融合基因，觀察200個細(xì)胞，有黃色融合信號的細(xì)胞為假陽性細(xì)胞。以陽性細(xì)胞數(shù)>平均數(shù)+ 3個標(biāo)準(zhǔn)差（x+3s）作為標(biāo)準(zhǔn)。5%以上的細(xì)胞出現(xiàn)異常的IGH/CCND1融合信號被判斷為陽性結(jié)果。

2　結(jié)果

2.1優(yōu)化后FISH檢測步驟⑴烤片：切好的片子于56℃烤片2h，待出現(xiàn)小蠟珠時，于二甲苯中進(jìn)行脫蠟。⑵脫蠟：室溫，二甲苯2min 2次，100%乙醇2min。⑶梯度酒精復(fù)水：室溫，100%乙醇、85%乙醇、70%乙醇各3min。⑷抗原修復(fù)：將玻片泡在枸櫞酸鈉溶液中，用微波爐水煮，中高火5min，高火5min。⑸消化：將40ml 0.01M的HCl溶液37℃進(jìn)行預(yù)熱。向HCl溶液加入胃酶0.05g，混合均勻。將切片浸泡消化10min，熒光顯微鏡下觀察消化結(jié)果。必要時延長消化時間。⑹消化結(jié)束后，室溫下將玻片置于2×SSC溶液靜置10min。⑺梯度酒精脫水：室溫，70%，85%，100%乙醇中各2min脫水，自然干燥玻片。⑻加探針，封片。將玻片放至濕盒，置83℃水浴鍋?zhàn)冃?min，移至42℃培養(yǎng)箱雜交過夜；⑼洗片。(10)熒光顯微鏡下選擇細(xì)胞分散好區(qū)域，分析雜交信號。

2.2圖像掃描與圖像分析用Olympus BX51熒光顯微鏡（日本Olympus公司）在UV/Rhodamine/ FITC三色濾光片的激發(fā)下觀察間期細(xì)胞的熒光雜交信號，并用染色體自動分析系統(tǒng)Imstar FISH 3.0進(jìn)行圖像采集和保存。

分析的細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰完整，背景熒光信號低，雜交信號強(qiáng)，能夠很好的判斷結(jié)果。病理擬診斷MCL的16例病例中，F(xiàn)ISH檢測出IGH/CCND1融合基因陽性為12例，如圖1、圖2。

圖1　石蠟切片F(xiàn)ISH圖像（IGH/CCND1陽性）

圖2　石蠟切片F(xiàn)ISH圖像（IGH/CCND1陰性）

3　討論

FISH技術(shù)起源于20世紀(jì)80年代后期，是目前細(xì)胞遺傳學(xué)重要的研究方法之一。基本原理是利用堿基互補(bǔ)配對，將熒光素標(biāo)記的探針直接雜交到染色體標(biāo)本上，通過檢測熒光信號，對染色體或基因異常進(jìn)行定性、定位及相對定量的分析。

石蠟切片應(yīng)用FISH技術(shù)檢測淋巴瘤遺傳學(xué)異常始于1999年[6]，利用特異性探針檢測淋巴瘤遺傳學(xué)改變。隨著目前淋巴瘤臨床診斷、分型的不斷細(xì)化，F(xiàn)ISH技術(shù)由于其具有準(zhǔn)確度、靈敏度和特異性高等優(yōu)點(diǎn)，已逐步應(yīng)用于淋巴瘤臨床診斷及科研中。文獻(xiàn)報(bào)道[7]，利用間期FISH檢測早期惡性淋巴瘤的骨髓IgH基因，可以區(qū)別良惡性腫瘤。畢蕊[8]等研究表明FISH技術(shù)檢測淋巴瘤特異的遺傳學(xué)異常對于復(fù)核組織病理診斷、鑒別其類型、亞型及病變的良惡性有重要參考價(jià)值。

石蠟切片進(jìn)行FISH檢測存在多方面影響因素[9－12]，如切片的因素、FISH雜交前石蠟切片的前期處理、雜交情況、雜交后洗滌情況等原因，任何環(huán)節(jié)失誤均可能導(dǎo)致檢測失敗。目前，國內(nèi)外沒有標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)驗(yàn)流程，各個實(shí)驗(yàn)室均需摸索適合本實(shí)驗(yàn)室的條件，建立操作步驟。李海燕[13]等通過優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，在石蠟包埋組織上成功地進(jìn)行FISH檢測間變性大細(xì)胞淋巴瘤病例中ALK基因。王靜[14]等研究建議不同實(shí)驗(yàn)室在進(jìn)行FISH技術(shù)雜交檢測之前，應(yīng)首先對酶消化時間進(jìn)行調(diào)整。

本研究最初建立的石蠟切片F(xiàn)ISH檢測步驟，發(fā)現(xiàn)雜交信號分析存在的問題：⑴細(xì)胞核輪廓模糊，雜交信號雜亂，無法分析；⑵雜交后未見雜交信號；⑶雜交信號弱；⑷熒光背景高，無法分析雜交信號；⑸細(xì)胞核重疊導(dǎo)致雜交信號重疊，影響結(jié)果判斷。通過多次實(shí)驗(yàn)條件摸索，我們認(rèn)為，F(xiàn)ISH雜交前的石蠟切片前期處理尤其重要，抗原修復(fù)和蛋白酶消化是實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵步驟。

抗原修復(fù)是通過高溫或化學(xué)處理消除福爾馬林固定所致蛋白交聯(lián)的影響，使探針能通過細(xì)胞膜接近靶細(xì)胞的DNA序列。此步驟在臨床操作過程中煩瑣，效果不好控制。我們在高溫處理過程中，通過光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞結(jié)構(gòu)，及時調(diào)整處理的時間，這樣效果可控，操作可行。蛋白酶消化，主要作用為去除胞質(zhì)，減少背景提高信號強(qiáng)度，并使單個胞核易于辨別，從而使FISH信號更容易分析。合適的消化，能保證探針能順利進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，而消化過度導(dǎo)致目的DNA上的雜交位點(diǎn)被破壞甚至組織切片的脫落。最初我們設(shè)定50mg/0.5ml胃蛋白酶37℃，消化時間10min，然后在熒光顯微鏡下DAPI通道下觀察細(xì)胞核，根據(jù)是否出現(xiàn)完整、清晰的細(xì)胞決定是否需要進(jìn)一步消化。如消化不完全，用2×SSC 1min洗去DAPI，繼續(xù)在胃蛋白酶中消化2～3min。同時，切片的厚度、及雜交變性的溫度對雜交結(jié)果分析也至關(guān)重要。處理后的細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰完整，背景熒光信號低，雜交信號強(qiáng)，能夠很好的判斷結(jié)果。

MCL為非霍奇金淋巴瘤中的一種B細(xì)胞淋巴瘤，具有獨(dú)特的組織病理學(xué)、免疫表型和分子遺傳學(xué)，侵襲性強(qiáng)，患者確診時多處于高度惡性階段，對放、化療均不敏感，預(yù)后差。MCL的正確診斷及與其它小B細(xì)胞淋巴瘤的鑒別診斷對臨床治療和預(yù)后評估均有重要意義。96%～100%的MCL與t (11；14)(q13；q32)密切相關(guān)。Chu[15]等提出t(11；14)易位是MCL特異的且有效的診斷標(biāo)志，對于MCL診斷具有重要意義。Monteil[16]等研究認(rèn)為FISH檢測t(11；14)(q13；q32)易位的特異性和敏感性高于PCR方法。本次研究中，16例病理擬診斷為MCL的患者中，12例FISH檢測IGH/CCND1融合基因?yàn)殛栃裕罱K臨床綜合診斷為MCL。

綜上研究，我們建議石蠟切片應(yīng)用FISH檢測，不同實(shí)驗(yàn)室應(yīng)建立適合自己的最佳操作流程，實(shí)驗(yàn)過程中根據(jù)顯微鏡下觀察的細(xì)胞結(jié)構(gòu)及時調(diào)整實(shí)驗(yàn)條件，以保證結(jié)果的可分析性以及準(zhǔn)確性。淋巴瘤石蠟切片應(yīng)用FISH檢測IGH/CCND1融合基因有助于提高M(jìn)CL臨床診斷率。

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·論著·

Applied research of fluorescence in situ hybridization in paraffin section of mantle cell lymphoma

WU Wei，NI Jun，WANG Hong，SUN Xing，F(xiàn)ANG Yuezhi，GU Jian. Subei People’s Hospital，Yangzhou Municipal Institute of Hematology，Yangzhou Jiangsu 225001，China.

Abstract：Objective To establish the operation process of fluorescence in situ hybridization(FISH) in paraffin section of lymphoma，and explore the application of FISH in diagnosis of mantle cell lymphoma (MCL). Methods The testing steps and experimental conditions of FISH in paraffin section were optimized，and 16 cases of quasi diagnosis of MCL were detected IGH/CCND1 fusion gene by FISH in paraffin section. Results The experiment methods and conditions of FISH in paraffin section were successfully established in our laboratory，and the positive detection rate of IGH/CCND1 fusion gene was 75%(12/16) in quasi diagnosis cases of MCL. Conclusion It can meet the requirements of clinical application by FISH in paraffin section of lymphoma；and the detection of IGH/CCND1 fusion gene by FISH is useful for the diagnosis of MCL.

Key words:FISH；Paraffin section；MCL；IGH/CCND1

(收稿日期2015－11－24；修回日期2016－02－29)

通信作者：顧健，女，1954年1月出生，教授，主任醫(yī)師，研究方向血栓與止血、惡性血液病，E- mail:maolujiu918@163.com

作者簡介：吳蔚，女，1977年10月出生，碩士學(xué)位，副主任技師，研究方向：惡性血液病遺傳學(xué)。

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（編號：81170104）

中圖分類號：R446.8，R551.2

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1674-1129(2016)02-0134-03

DOI：10.3969/j.issn.1674-1129.2016.02.002