甘草次酸對人胃癌HGC－27的抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡作用①

賈洪巖，林　芳，王立敏，劉　丹

(1.沈陽藥科大學(xué)基于靶點的藥物設(shè)計與研究教育部重點實驗室，遼寧沈陽110000;2.佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江佳木斯154007)

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甘草次酸對人胃癌HGC－27的抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡作用①

賈洪巖1，2，林芳1，王立敏2，劉丹1

(1.沈陽藥科大學(xué)基于靶點的藥物設(shè)計與研究教育部重點實驗室，遼寧沈陽110000;2.佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江佳木斯154007)

摘要:目的:研究18β－甘草次酸(glycyrrhetinic acid，GA)對人胃癌細胞HGC－27生長抑制作用及對細胞凋亡的影響。方法:分別以12.5、25、50、100和200 μM的GA處理HGC－27細胞，MTT法檢測不同時間點(24、48和72h)的細胞增殖抑制率，以AO/EB法初步觀察GA誘導(dǎo)HGC－27凋亡的情況，以Annexin V－FITC/PI雙染色法檢測細胞凋亡率確定凋亡的發(fā)生。結(jié)果: GA能抑制HGC－27細胞生長，且呈劑量依賴性，GA可以引起HGC－27細胞核皺縮、染色質(zhì)濃縮、細胞膜發(fā)泡、等凋亡特征，提示了凋亡的參與，通過Annexin V/PI雙染色法最終確定GA可劑量依賴性地引起HGC－27的凋亡。結(jié)論: GA可抑制人胃癌細胞HGC－27增殖，其作用機制可能與GA引起HGC－27凋亡有關(guān)。

關(guān)鍵詞:甘草次酸; HGC－27細胞;細胞凋亡

胃癌是一種嚴(yán)重威脅人類健康的疾病，在許多惡性腫瘤當(dāng)中，其發(fā)病率高居第二位。在臨床上，利用Ki－67、RAB5A、VHL、Survivin以及HGF等的表達情況來診斷早期胃癌的發(fā)生［1～3］。多數(shù)早期胃癌的治療均采取局部切除的方法，而對于晚期胃癌，手術(shù)切除后仍有復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的可能，其術(shù)后5年生存率始終保持在30%左右。近幾年的研究表明，中藥不管是在腫瘤的早期或者中期作為手術(shù)、化療以及介入治療的一種輔助手段，還是在腫瘤的晚期由于患者失去了最佳手術(shù)機會且對化療的耐受力下降或者進行介入治療時其作為一種必要的治療手段均在臨床上表現(xiàn)出了優(yōu)越的效果［4，5］。18β－甘草次酸是中草藥甘草的一種重要有效成分?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，甘草次酸具有調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、抗肝毒素、抗腫瘤、抗?jié)?、抗病毒以及抗炎等多種生理活性［6～9］。GA對一些腫瘤細胞生長具有一定的抑制作用［10，11］，有關(guān)甘草次酸對胃癌細胞HGC－27生長作用的報道較少，對其抗腫瘤的確切機制亦不清楚，本研究觀察甘草次酸對胃癌細胞系HGC－27細胞生長的抑制作用，探討其可能的作用機制，為胃癌的臨床治療提供實驗依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

藥品與主要儀器: GA:購于Sigma公司; CO2培養(yǎng)箱:德國賀利氏公司;酶標(biāo)儀:美國Bio－Rad公司;熒光顯微鏡:德國Leica公司;流式細胞儀:美國Becton Dickson公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)

HGC－27細胞培養(yǎng)于含10 %胎牛血清100μg/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素、0.2% NaHCO3的RPMI－1640培養(yǎng)液中的中，置于37℃、5 % CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，0.25 %的胰酶消化傳代。

1.2.2顯微鏡下細胞形態(tài)的觀察

取對數(shù)生長期的細胞進行消化傳代，并且在培養(yǎng)24h后加入甘草次酸終濃度為25、50、100μM的培養(yǎng)液連續(xù)培養(yǎng)24h后置于倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況。

1.2.3 MTT法

細胞生長至培養(yǎng)皿的80%時棄去培養(yǎng)液，在消化和離心后收集細胞，加入新鮮的培養(yǎng)液，慢慢吹打培養(yǎng)液使其成單細胞懸液;之后將單細胞懸液稀釋至細胞數(shù)為2×105個/mL，吹均勻后，將96孔板中的每孔加入100μL的單細胞懸液，然后放于培養(yǎng)箱中，24h后加藥處理，每個濃度設(shè)置四個復(fù)孔，與細胞共同孵育24h、48h和72h后，每孔分別加入50μL 2mg/mL的MTT溶液，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4h;甩板后倒扣于濾紙上，在濾紙充分吸干殘留的液體后，每孔分別加入200μL的DMSO，然后放于振蕩器上振蕩10min以使得藍色結(jié)晶物溶解;用酶標(biāo)儀在570nm處測其吸光度值，設(shè)200μL DMSO為空白對照。

由以下公式計算細胞生長的抑制率:

抑制率(%) = 1－(對照細胞OD值－加藥細胞OD值) /對照細胞OD值×100%

將藥物濃度的對數(shù)值與細胞的存活率作線性回歸，可求出藥物對腫瘤細胞的半數(shù)生長抑制濃度及IC50值。

1.2.4 AO/EB雙染熒光試驗

取處于對數(shù)生長期的HGC－27細胞，以每孔的細胞密度為2×105個/mL接種于24孔板中，每孔800μL。然后分別用濃度為25、50、100μM的藥物處理后，收集細胞，離心，棄去上清液，重懸于100μL 的PBS中，然后加入AO/EB等體積混合液16μL (100 μg/mL AO，100μg/mL EB)，混勻后，吸一滴混合液于潔凈的載玻片上，用蓋玻片封片，放于熒光顯微鏡下觀察并拍照。EB拒染并出現(xiàn)細胞膜發(fā)芽、發(fā)泡、核皺縮以及凋亡小體的細胞則被認(rèn)為是凋亡細胞。

1.2.5 Annexin V－FITC/PI雙染色法檢測細胞凋亡

在36 h時收集各組的HGC－27細胞，用PBS洗滌2次，按Annexin V－FITC /PI試劑盒的說明書操作。在1h內(nèi)利用流式細胞儀檢測細胞的凋亡率，采用Cell Quest V 3.2軟件來獲取和分析數(shù)據(jù)。

2　結(jié)果

2.1細胞形態(tài)學(xué)觀察

倒置顯微鏡下觀察對照組細胞生長旺盛，形態(tài)成梭形或者多邊形，貼壁生長牢固，折光率較高，細胞膜生長完整。甘草次酸處理過的HCG－27細胞隨著濃度的增加增殖變慢且細胞逐漸變小變圓，折光變差等，部分細胞漂浮在培養(yǎng)瓶中。甘草次酸濃度越高，上述表現(xiàn)越明顯。見圖1。

A.對照; B.甘草次酸25μM; C.甘草次酸50μM; D.甘草次酸100μM圖1　不同濃度GA作用24 h后顯微鏡觀察細胞變化

A.對照; B.甘草次酸25 μM; C.甘草次酸50 μM; D.甘草次酸100 μM圖2　AO/EB檢測不同濃度GA作用48 h后HGC－27形態(tài)變化

2.2 GA對HGC－27細胞生長抑制情況

分別以12.5、25、50、100和200μM的GA處理HGC－27細胞，MTT法檢測不同時間點(24、48和72h)的細胞增殖抑制率，GA隨著作用時間的增加對HGC－27有一定的生長抑制作用，并且隨著時間的延長具有時間依賴性，見表1。

表1　藥物處理不同時間GA對HGC－27的IC50

2.3 GA對HGC－27的AO/EB染色結(jié)果

通過對先前細胞的形態(tài)學(xué)變化和GA對HGC－27的抑制作用，提示GA對HGC－27可能具有促進凋亡的作用，而細胞凋亡時，形態(tài)學(xué)的變化是重要的特征之一。圖2是不同濃度的GA作用在HGC－27細胞48h后熒光染色的結(jié)果。對照組細胞的細胞核形狀規(guī)則，染色均一。而GA處理組隨著濃度的升高出現(xiàn)了細胞核皺縮、染色質(zhì)濃縮、細胞膜發(fā)泡、邊緣化等明顯的凋亡形態(tài)學(xué)改變。

2.4細胞凋亡改變

Annexin V－FITC/PI雙染色后流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，對照組及25、50、100 μM的GA作用36h后早期凋亡率分為別0.72%、1.06 %、9.5%、17.58%。與對照組相比證明GA可以誘導(dǎo)HGC－27早期凋亡，見圖3。

A對照組B 25 μM組C 50 μM組D 100 μM組圖3　不同濃度GA作用36 h后HGC－27細胞流式凋亡分析

3　討論

通過光學(xué)顯微鏡我們初步觀察到GA可以抑制胃癌細胞HGC－27生長，MTT法檢測GA對HGC－27細胞72h的IC50為59.32μM，根據(jù)細胞形態(tài)，憑經(jīng)驗推測可能有凋亡發(fā)生，繼續(xù)采用AO/EB法初步提示凋亡確實存在。進而，Annexin V－FITC/PI法用來檢測細胞早期凋亡時膜上的磷脂酰絲氨酸(PS)外翻，該指標(biāo)一直作為細胞凋亡判斷的金指標(biāo)，我們的實驗結(jié)果證實了GA確實誘導(dǎo)了凋亡，且呈劑量依賴性。與文獻報道GA具有多種抗腫瘤活性相一致，GA具抗惡性胃癌細胞的作用，我們認(rèn)為在治療和預(yù)防早期胃癌可能有應(yīng)有前景。有報道稱，如果可以聯(lián)合用藥的幾種藥物之間存在協(xié)同效應(yīng)，那么其不僅可以減輕藥物副作用，同時可以增強藥物的療效［6］。甘草次酸屬于較溫和的天然產(chǎn)物，安全性高，高振北等［12］報道，全反式維甲酸與甘草次酸聯(lián)合應(yīng)用，則可以協(xié)同抑制PGCL3細胞(人肺癌細胞)的侵襲和轉(zhuǎn)移。本文發(fā)現(xiàn)甘草次酸單獨應(yīng)用有一定抗胃癌效果，這為開發(fā)其和相關(guān)藥物聯(lián)用研究提供了一定的參考價值。但其具體作用機制還有待進一步研究。開發(fā)甘草次酸與其他藥物合用治療胃癌，可能更具有臨床價值。

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(收稿日期:2015－05－24)

通訊作者:王立敏(1973～)女，黑龍江佳木斯人，博士，教授，碩士研究生導(dǎo)師。E－mail: wlmtong@163.com。

作者簡介:①賈洪巖(1990～)女，黑龍江綏化人，在讀碩士研究生。

中圖分類號:R735.2

文獻標(biāo)識碼:A

文章編號:1008－0104(2016) 02－0088－03