不同2型糖尿病腎病模型建立方法及成模特點(diǎn)比較

閆永恒，李漸鵬，劉戰(zhàn)偉，徐志祥，王新春，徐同成，邱　斌，劉振華，杜方嶺(山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品研究所，濟(jì)南　5000;山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東泰安　7000;濟(jì)南誠匯雙達(dá)化工有限公司，濟(jì)南　500)

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不同2型糖尿病腎病模型建立方法及成模特點(diǎn)比較

閆永恒1，2，李漸鵬1，劉戰(zhàn)偉3，徐志祥2，王新春2，徐同成1，邱斌1，劉振華1，杜方嶺1
(1山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品研究所，濟(jì)南250100;2山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東泰安271000;3濟(jì)南誠匯雙達(dá)化工有限公司，濟(jì)南250101)

摘要:綜述不同的2型糖尿病腎病建模方式并進(jìn)行比較，以方便實(shí)驗(yàn)者根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、?shí)驗(yàn)室條件及經(jīng)驗(yàn)等，從中選擇出適合的建模方式，為2型糖尿病腎病的預(yù)防和治療提供科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞:2型糖尿病腎病;動物模型;鏈脲佐菌素

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病(diabetes mellitus，DM)常見的微血管并發(fā)癥，病因和發(fā)病機(jī)制目前尚不明確，研究成果提示為代謝紊亂、炎性反應(yīng)機(jī)制、氧化應(yīng)激、血流動力學(xué)改變、細(xì)胞因子、遺傳因素及自噬等多種因素共同導(dǎo)致了糖尿病腎病的發(fā)?。?］。糖尿病腎病發(fā)病不可逆，在服藥之外需要醫(yī)學(xué)營養(yǎng)治療的有效輔助，即通過調(diào)整營養(yǎng)素結(jié)構(gòu)來起到控制血糖、維持理想體重和預(yù)防營養(yǎng)不良發(fā)生的作用。根據(jù)2013年版《中國2型糖尿病防治指南》，中國患病人群中2型糖尿病占90.0%以上［2］。由于我國城市化進(jìn)程加快、老齡化水平上升、國民生活方式轉(zhuǎn)變加之肥胖和超重的比例上升，短期內(nèi)我國糖尿病患病率急劇增加，對社會醫(yī)療衛(wèi)生服務(wù)成本造成巨大壓力，因此對于2型糖尿病預(yù)防與治療手段的完善進(jìn)程亟需加快。

從Minkowski和Von Mehring用切除狗胰腺的方法建立糖尿病模型以來，隨著糖尿病研究范圍的擴(kuò)大，使用的實(shí)驗(yàn)動物種類也逐漸增多，如主要用于遺傳學(xué)、病因?qū)W、神經(jīng)學(xué)系統(tǒng)研究的靈長類動物獼猴等哺乳動物［3］和主要用于藥物篩選、血液生化、發(fā)病機(jī)制研究的大鼠等嚙齒類動物模型。其中鼠科動物因具有體積小、易繁殖、飼養(yǎng)條件要求低、飼料喂養(yǎng)依從性高、起病迅速等優(yōu)點(diǎn)成為公認(rèn)的誘導(dǎo)糖尿病腎病的理想模型。大鼠模型的建立模擬了2型糖尿病初期病理，為發(fā)病機(jī)理的進(jìn)一步研究，探索有效的降低糖尿病腎病發(fā)病風(fēng)險的生活干預(yù)方式提供了可能。國內(nèi)外學(xué)者長期嘗試建立大鼠糖尿病腎病模型的過程中，選用了不同的品種和途徑，然而，現(xiàn)階段普遍認(rèn)可及應(yīng)用最廣的建模方式質(zhì)量參差不齊，有成功率低、成功可復(fù)制率較低、成模標(biāo)準(zhǔn)未確立、耗時較長、無法兼顧高效和低廉及模型無法模擬人類糖尿病腎病后期病理等桎梏，本文旨在系統(tǒng)總結(jié)不同的糖尿病腎病建模方式并進(jìn)行比較，以方便實(shí)驗(yàn)者根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、?shí)驗(yàn)室條件及實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)，從中選擇出較為合適的建模方式。

1　自發(fā)性2型糖尿病腎病模型

2型糖尿病發(fā)生糖尿病腎病所占比例較高，是現(xiàn)階段醫(yī)學(xué)研究熱點(diǎn)之一，因此研究的自發(fā)性模型也相對較多，現(xiàn)簡述應(yīng)用較多的幾種自發(fā)性2型糖尿病腎病模型特點(diǎn)及應(yīng)用現(xiàn)狀(附表)。

自發(fā)性模型鼠雖然在一定程度上模擬了人類糖尿病腎病發(fā)病存在的遺傳性因素，但仍有自身桎梏。一方面，由于發(fā)病過程中遺傳因素占比巨大，導(dǎo)致這些動物模型后期飼養(yǎng)方式轉(zhuǎn)變對病變影響較小，也無法兼顧人類發(fā)病的生活方式影響因素。另一方面，雖然對于不同單一品種的自發(fā)性2型糖尿病模型的研究均顯示其具有典型的糖尿病腎病病理改變［4-8］，但不同模型鼠之間的橫向比較較少，導(dǎo)致部分實(shí)驗(yàn)者在選擇自發(fā)性模型時出現(xiàn)困惑。李娜等［9］在對自發(fā)性2型糖尿病KK-Ay/Ta和C57BL/KsJ-db/db小鼠比較后發(fā)現(xiàn)，品系的差異導(dǎo)致發(fā)病時間和異常持續(xù)時間均有不同，實(shí)驗(yàn)者須根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)傾向選擇模型。最后，自發(fā)性2型糖尿病動物模型建立標(biāo)準(zhǔn)并不統(tǒng)一，往往獲得渠道狹窄，因?yàn)檫z傳性病變導(dǎo)致存活時間短且不能生育，價格昂貴，日常實(shí)驗(yàn)需要耗時地進(jìn)行回交誘導(dǎo)突變來測試病理生理過程，不適用于大規(guī)模飼養(yǎng)探索。

附表　幾種自發(fā)性2型糖尿病腎病模型特點(diǎn)

2　誘導(dǎo)性糖尿病腎病模型

2.1實(shí)驗(yàn)動物的選擇

誘導(dǎo)性建模常用大鼠品系以Wister和SD為主。陳楓等［10］對比SD大鼠和Wistar大鼠成模成功率后發(fā)現(xiàn)，Wistar大鼠成模率高、死亡率低且成模后體征表現(xiàn)優(yōu)于SD大鼠。王曉琳等［11］在對比不同性別的Wistar大鼠建模結(jié)果后，得出雄性大鼠對鏈脲佐菌素(STZ)敏感程度高于雌性大鼠。陳靜等［12］選取7～9w齡雄性SD大鼠35只探討大鼠體質(zhì)量對1型糖尿病造模成功率的影響，發(fā)現(xiàn)體質(zhì)量180～240g大鼠糖尿病成模率較高，隨著體質(zhì)量的增加，成模率會降低，死亡率增大。綜上所述，7～9w 180～240g的雄性Wistar大鼠是較為理想的2型糖尿病腎病的動物模型。

2.2實(shí)驗(yàn)試劑

在誘導(dǎo)性模型建立過程中，鏈脲佐菌素(STZ)是不可或缺的關(guān)鍵試劑也是最關(guān)鍵的一環(huán)。在糖尿病腎病的發(fā)生和發(fā)展中，胰島β細(xì)胞生存狀態(tài)起關(guān)鍵性的作用［13］。STZ作為一種DNA烷基化試劑，能通過GLUT2葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(GLUT2 glucose transport protein)獨(dú)自進(jìn)入細(xì)胞，對胰腺胰島胰島素誘發(fā)的β－細(xì)胞具毒性。需要注意的是，隨著STZ誘導(dǎo)的糖尿病給藥方式不同，其成模效果上也隨之帶來差別。劉長青等［14］采用pH4.5檸檬酸磷酸鹽緩沖液(PBS)、pH 5.5、pH 7.0 Hanks，及pH 7.0生理鹽水4種溶劑溶解STZ對小鼠腹腔注射，觀察溶劑類型及其酸堿度對模型成功率的影響，發(fā)現(xiàn)pH 4.5檸檬酸造模成功率最高，有借鑒意義。模型制作的另一個關(guān)鍵是STZ溶液的保存及應(yīng)用，特別是檸檬酸磷酸鹽緩沖液濃度及PH值要符合要求，溶液應(yīng)充分混勻，避光保存?，F(xiàn)配現(xiàn)用，最好在配制后10min內(nèi)注射完畢。注射藥物后48h后，模型鼠即可出現(xiàn)血糖升高，飲水量、尿量增加，故給予充足水分和食物動物密度不宜過大，通風(fēng)要好，防止相互撕咬及各種感染，在有創(chuàng)操作時注意局部消毒。

2.3模型建立方式

實(shí)驗(yàn)室誘導(dǎo)模型基于實(shí)驗(yàn)條件和操作技術(shù)不同的影響，發(fā)展出若干不同的糖尿病腎病模型建立方式。以鏈脲佐菌素為主的注射定向破壞胰島β細(xì)胞，并在此基礎(chǔ)上做出不同的優(yōu)化與改進(jìn)，成為現(xiàn)在被廣泛接受的造模主要方式。

2.3.1單純腹腔注射在模型建立方法方面，無論哪種模型建立方法，STZ溶液都扮演著至關(guān)重要的角色。STZ注射劑量問題是模型建立的關(guān)鍵。在注射方式上，沈亞非等［15］對比了尾靜脈注射和腹腔注射鏈脲佐菌素，發(fā)現(xiàn)兩者都可以建立標(biāo)準(zhǔn)的糖尿病腎病模型，但尾靜脈注射較難掌握，易出現(xiàn)操作誤差，腹腔注射較易操作、準(zhǔn)確。在注射劑量上，李偉等［16］對比注射40、50、60、70mg/kg的STZ成模率和死亡率以后，得出注射60mg/ kg的STZ是致SD大鼠發(fā)生糖尿病腎病的最佳劑量的結(jié)論。李光輝等［17］對比注射55、65、75mg/kg的STZ成模率和死亡率以后，得出注射65mg/kg的STZ注射方式具有成模率高、病死率低、感染率低的優(yōu)點(diǎn)。

上述實(shí)驗(yàn)者結(jié)論均為高劑量STZ注射有利于建模，卻均未完全考慮STZ對胰島β細(xì)胞的強(qiáng)靶向作用，導(dǎo)致胰島素急劇下降，結(jié)果更接近于對于建立1型糖尿病模型，而非2型糖尿病模型。所以我們在建立2型糖尿病腎病模型時，不宜采用大劑量STZ注射。因此，陳楓等［10］對比55、45、35、25mg/kg不同劑量STZ造模的成功率和死亡率后，所提出的建立2型糖尿病腎病模型注射STZ 35mg/kg的最優(yōu)劑量是更為合理的。現(xiàn)今報道也有采用多次小劑量STZ的注射代替一次大劑量注射的方法，以減少STZ對腎臟的過大毒性作用。STZ溶液基本要求是現(xiàn)配先用，故而實(shí)驗(yàn)室條件不同，配置到注射時間間隔不同都有可能造成造模效果的差異。

2.3.2鏈脲佐菌配合單腎切除(結(jié)扎)該方法是在大鼠禁食12h后進(jìn)行腹腔注射3%的戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉，從左側(cè)脊柱與肋骨相交處稍下方切開皮膚及肌層，暴露腎臟，選擇性摘除左腎或于腎門處結(jié)扎，縫合肌層和皮膚，術(shù)后4w，禁食12h，再進(jìn)行小劑量STZ溶液的腹腔注射。單側(cè)腎臟切除導(dǎo)致保留的腎臟代償性肥大、高過濾，腎小球毛細(xì)血管壓力增大，促進(jìn)糖尿病腎小球損傷。邢淑麗等［18］通過腹腔注射鏈脲佐菌素45mg/kg(冬季)和35mg/kg (夏季)聯(lián)合單側(cè)腎臟切除成功制造出穩(wěn)定性強(qiáng)、可復(fù)制性高的大鼠DN模型，可以看到該方法從致病原理和注射劑量控制上都是較為合適的。李世芬等［19］比較了腹腔STZ注射配合單腎切除與腹腔STZ注射配合單腎結(jié)扎兩種造模方法，發(fā)現(xiàn)2種造模方法在模型成立上無較大差別，操作難度相同，隨病程加長不排除單腎切除存活率低于單腎結(jié)扎的可能，故而建議實(shí)驗(yàn)者在考慮此類方法時采取單腎結(jié)扎方式。該方法未能廣泛普及的原因有三點(diǎn):一是對于實(shí)驗(yàn)者經(jīng)驗(yàn)要求較高，手術(shù)過程繁瑣;二是單側(cè)腎臟切除后造成的健側(cè)腎臟的代償性增生并不完全符合人類2型糖尿病腎病疾病發(fā)展特點(diǎn);三是模型鼠相對于傳統(tǒng)腹腔注射死亡率升高。

2.3.3鏈脲佐菌素配合高脂高糖飲食研究表明，由胰島素代謝障礙而導(dǎo)致的高血糖是DN發(fā)生的最關(guān)鍵原因，飲食中蛋白含量過高是DN的危險因素，脂代謝紊亂亦是DN發(fā)生的一項獨(dú)立的影響因素。芝敏等［20］比較不同飲食結(jié)構(gòu)建立2型糖尿病腎病大鼠模型時發(fā)現(xiàn)，高糖高脂可導(dǎo)致糖尿病腎病大鼠更為明顯的高血壓和更加嚴(yán)重的微量白蛋白尿，且等易導(dǎo)致腎小球硬化，病理損害相對較重。故而STZ注射配合高脂高糖飲食法既繼承了高脂高糖法對于人類生活習(xí)慣的模擬性并誘導(dǎo)出胰島素抵抗，又加以注射STZ引起β細(xì)胞受損并誘發(fā)胰島素代償性分泌障礙，大大縮短了建模速度，同時與單側(cè)腎切除相比對實(shí)驗(yàn)者技術(shù)要求低，建模過程中動物模型死亡率低，成為目前運(yùn)用最廣泛的方法。建模通用標(biāo)準(zhǔn)高糖高脂飼料:蔗糖10%、豬油10%、植物油10%、膽固醇5%、普通基礎(chǔ)飼料65%、另有0.2%膽鹽以促進(jìn)對脂肪吸收。

董建一等［21］采用高脂飼料喂養(yǎng)4w加一次性注射25mg/kg的STZ溶液的方法探索建立2型糖尿病腎病模型，成模率僅為67%且模型不穩(wěn)定。郭俊秀等［22］對該方法合理性進(jìn)行了驗(yàn)證，通過高脂高糖飼養(yǎng)6w后，一周一次共兩周的30mg/kg的STZ腹腔注射，建立起了穩(wěn)定的大鼠糖尿病腎病的模型。證明了高脂高糖聯(lián)合STZ注射法是理想的造模方法。

需要注意的是，在高脂高糖飲食階段，高脂高糖飼養(yǎng)會造成強(qiáng)飽腹感，引起實(shí)驗(yàn)動物進(jìn)食量的減少，導(dǎo)致胰島素抵抗現(xiàn)象出現(xiàn)緩慢、血糖升高不明顯。對此，林瓊等［23］對原有方式進(jìn)行了改良，即高糖高脂飼料喂養(yǎng)+5%葡萄糖水飲水，一方面加速胰島素抵抗的出現(xiàn)(2w)，另一方面，高糖引起滲透性利尿也有加速腎臟損傷的作用。另外通過連續(xù)3d小劑量腹腔注射STZ (30mg/kg)，避免了一次性注射高劑量STZ導(dǎo)致的誘導(dǎo)1型糖尿病傾向和動物模型死亡，同時也減少了STZ本身的腎毒性所造成的腎臟損害。

2.3.4鏈脲佐菌素注射配合高糖高脂飲食合并單腎切除Mikio S等［24］為加速糖尿病腎臟病損傷的出現(xiàn)，采取用40mg/kg的STZ溶液靜脈注射加切除右腎，手術(shù)后2w再喂以高糖高脂飲食的方法。這種在高糖高脂飼養(yǎng)+腹腔注射小劑量STZ的基礎(chǔ)上進(jìn)行單側(cè)腎臟切除的方式建立糖尿病腎病模型的方法又稱“三聯(lián)法”，它結(jié)合了運(yùn)用最優(yōu)的建模因素:單側(cè)腎切除引起腎臟代償性肥大，鏈脲菌素注射耗損胰島B細(xì)胞，高脂高糖模擬人類致病因素。一方面，三聯(lián)法的優(yōu)勢在于大大縮短了造模用時，且造模的成功率以及成模后的穩(wěn)定性，病理改變的顯著性，蛋白尿的嚴(yán)重性也較單純的小劑量STZ加高脂或STZ加單側(cè)腎切除實(shí)驗(yàn)方案更加優(yōu)越。但另一方面，我們無法忽略這種方法的不足——合并了上述種種造模方式的短板，特別是實(shí)驗(yàn)流程上的繁瑣，使大多實(shí)驗(yàn)者望而卻步。

2.4成模標(biāo)準(zhǔn)

多年來，對于2型糖尿病腎病成模標(biāo)準(zhǔn)一直存在諸多差異，這些差異或會導(dǎo)致研究結(jié)果的可借鑒意義和可重復(fù)性大大下降。現(xiàn)在最普遍的成模標(biāo)準(zhǔn)為，開始72h后至少連續(xù)3d尾靜脈檢測血糖為基，以連續(xù)3次血糖＞16.65mmol/尿糖強(qiáng)陽性;尿量大于對照組的50 %的標(biāo)準(zhǔn)判定是否建模成功。上述標(biāo)準(zhǔn)雖被廣泛接受卻也存在問題:汪峰等［25］在對于鏈脲佐菌素誘導(dǎo)糖尿病大鼠模型穩(wěn)定性進(jìn)行探討時發(fā)現(xiàn)，腹腔注射STZ溶液3w后有30%的大鼠模型空腹血糖值回到正常水平，這表示模型建立時存在不穩(wěn)定的可能，所以提出參照目前的72h模型判定方式無法囊括造模不穩(wěn)定現(xiàn)象，建議采用腹腔注射STZ后第3w空腹血糖值≥16.7為模型建立新標(biāo)準(zhǔn)。曾玉琴等［26］通過OGTT葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)方式篩選成模大鼠。郭學(xué)軍等［27］發(fā)現(xiàn)，在有明確胰島病理改變的模型組大鼠中OGTT異常陽性率顯著高于空腹血糖異常陽性率，提出在動物實(shí)驗(yàn)中OGTT比空腹血糖監(jiān)測更有診斷意義，不易造成漏診。另外，在判斷DN模型是否成功時，從源頭實(shí)驗(yàn)動物的選擇到造模結(jié)束后動物模型基礎(chǔ)指標(biāo)(包括血壓、血糖、血肌酐、血尿素氮、尿蛋白定量等)的檢測方法的標(biāo)準(zhǔn)化均需要引起實(shí)驗(yàn)者們的重視。

3　結(jié)論與討論

第一，自發(fā)性的動物模型和誘發(fā)性的動物模型在一定程度上共同模擬了臨床糖尿病腎病的癥狀，包括胰島素抵抗、高血糖、高血脂等，但兩種模型的應(yīng)用價值卻不盡相同。誘發(fā)性糖尿病小鼠模型相比，自發(fā)性動物模型由于其存在遺傳因素作用，糖尿病腎病的產(chǎn)生與臨床患者更為相似，應(yīng)用價值更高。如db/db小鼠是由于瘦素(leptin)受體基因缺陷失去功能，在出生后2w內(nèi)就發(fā)生高胰島素血癥，3～4w發(fā)展為肥胖，8w后就發(fā)展為非常嚴(yán)重的高血糖癥，期間伴有胰島素抵抗，β細(xì)胞功能衰竭，一般在8～10個月內(nèi)死亡，可發(fā)生明顯的腎?。?8］。但是自發(fā)性模型相較于普通誘導(dǎo)鼠類模型的獲得渠道更為狹窄，成本較高，故而運(yùn)用未似誘發(fā)性模型廣泛。誘發(fā)性的動物模型則更強(qiáng)調(diào)了后天成長因素，與現(xiàn)代社會普遍不科學(xué)飲食和不健康生活方式相近，但亦有其缺點(diǎn):首先，其忽略了DN發(fā)病的遺傳因素;其次，其存在造模時間偏長、穩(wěn)定性不足的問題;最后，多數(shù)建模成功產(chǎn)生了血糖升高等類似2型糖尿病的癥狀后，模型體型缺與正常小鼠體型差異無顯著性，未出現(xiàn)肥胖現(xiàn)象。2種小鼠模型都存在一定的優(yōu)點(diǎn)與缺陷，研究者可根據(jù)實(shí)際需要參照相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行選擇。

第二，在模型建立方法方面。胰島素抵抗是2型糖尿病最顯著的特征，有無胰島素抵抗也是區(qū)別1型和2型糖尿病腎病動物模型的標(biāo)準(zhǔn)［29］。1型糖尿病的病理生理學(xué)和病理學(xué)特征是胰島B細(xì)胞數(shù)量顯著減少和消失所導(dǎo)致的胰島素分泌顯著下降或缺失，表現(xiàn)為起病迅速，中度至重度的臨床癥狀。由此可見2型糖尿病與1型糖尿病主要區(qū)別在于: 2型糖尿病較1型糖尿病胰島細(xì)胞破壞程度輕，發(fā)病速度慢，所以STZ注射法建立2型糖尿病一定要控制劑量，否則將有建模發(fā)展成1型糖尿病的可能性。有研究表明STZ對于腎臟損害是可疊加性的，所以實(shí)驗(yàn)者在糖尿病腎病建模過程中，在一次注射失敗情況下，采用二次補(bǔ)注的方法的合理性有待商榷。

第三，實(shí)驗(yàn)動物的存活是模型建立的前提，但糖尿病腎病模型建立過程容易發(fā)生動物死亡，王彥江等［30］探討了STZ誘導(dǎo)糖尿病大鼠造模過程中模型鼠的死亡原因，發(fā)現(xiàn)模型鼠的死亡可能與實(shí)驗(yàn)操作過程中感染、大鼠自身營養(yǎng)不良、淋巴循環(huán)受阻、STZ本身的毒性以及環(huán)境氣候條件的變化有關(guān)，實(shí)驗(yàn)者在實(shí)驗(yàn)過程中應(yīng)對以上因素加倍注意。

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(責(zé)任編輯李婷婷)

Comparison of Different Modeling Methods and Characteristics of Type 2 Diabetic Nephropathy Rat Model

YAN Yong-heng1，2，LI Jian-peng1，LIU Zhan-wei3，XU Zhi-xiang2，WANG Xin-chun2，XU Tong-cheng1，QIU Bin1，LIU Zhen-hua1，DU Fang-ling1
(1Institute of Agro-Food Science and Technology，Shandong Academy of Agricultural Science，Jinan 250100，China;2College of Food Science and Engineering，Shandong Agricultural University，Tai'an 271000，China)

Abstract:We summarized different modeling methods of type 2 diabetic nephropathy to facilitate the experimenters to choose suitable modeling methods according to the laboratory conditions to provide scientific basis for the prevention and treatment of tyre 2 diabetic nephropathy．

Keywords:type 2 diabetic nephropathy; animal model; STZ

通訊作者:杜方嶺(1972—)，男，碩士，研究員，研究方向:特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品。

作者簡介:閆永恒(1992—)，女，在讀碩士研究生，研究方向:特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品。

基金項目:國家自然科學(xué)基金(項目編號: 31401487) ;山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新重點(diǎn)項目(項目編號: 2014CXZ03)。