間作緩解蠶豆連作障礙的根際微生態(tài)效應

胡國彬，董　坤，董　艷，*，鄭　毅，3，湯　利，李欣然，劉一鳴云南農(nóng)業(yè)大學資源與環(huán)境學院，昆明　6500云南農(nóng)業(yè)大學食品科技學院，昆明　65003西南林業(yè)大學，昆明　6504

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間作緩解蠶豆連作障礙的根際微生態(tài)效應

胡國彬1，董坤2，董艷1，*，鄭毅1，3，湯利1，李欣然1，劉一鳴1
1云南農(nóng)業(yè)大學資源與環(huán)境學院，昆明650201
2云南農(nóng)業(yè)大學食品科技學院，昆明650201
3西南林業(yè)大學，昆明650224

摘要:通過田間小區(qū)試驗，研究了3個品種蠶豆(92-24、云豆324、鳳豆6號)與小麥間作對蠶豆產(chǎn)量、枯萎病病情指數(shù)、根際鐮刀菌數(shù)量、根際真菌代謝功能多樣性和土壤酶活性的影響。結(jié)果表明:與單作蠶豆相比，云豆324與小麥間作(YD324/W)和鳳豆6號與小麥間作(FD6/W)處理均顯著提高了蠶豆地上部干重、籽粒產(chǎn)量和百粒重。YD324/W和FD6/W處理使蠶豆枯萎病發(fā)病初期病情指數(shù)分別降低57.14%和41.67%，鐮刀菌數(shù)量分別降低32.06%和29.88%，而92-24與小麥間作(92-24/W)處理蠶豆產(chǎn)量、枯萎病病情指數(shù)和鐮刀菌數(shù)量與單作蠶豆均無顯著差異。YD324/W和FD6/W處理顯著提高了蠶豆根際真菌的多樣性指數(shù)和豐富度指數(shù)，并使蠶豆根際真菌的AWCD值分別比單作蠶豆提高了61.75%和46.49%;YD324/W和FD6/W處理明顯改變了蠶豆根際真菌的群落結(jié)構(gòu)。而92-24/W處理對蠶豆根際真菌的多樣性指數(shù)、豐富度指數(shù)和AWCD值均無顯著影響，也未明顯改變真菌的群落結(jié)構(gòu)。不同發(fā)病時期，YD324/W和FD6/W處理均顯著提高了蠶豆根際土壤的蔗糖酶、脲酶和過氧化氫酶活性;而92-24/W處理蠶豆根際蔗糖酶、脲酶和過氧化氫酶活性與單作蠶豆均無顯著差異。總之，小麥與不同品種蠶豆間作改變了蠶豆根際的真菌群落結(jié)構(gòu)，提高了蠶豆根際真菌的活性、多樣性和豐富度，提高土壤酶活性并改善蠶豆生長，增加了蠶豆產(chǎn)量。表明小麥與蠶豆間作改善了根際土壤的微生態(tài)環(huán)境，降低了鐮刀菌的數(shù)量，緩解了蠶豆連作障礙，但蠶豆品種的差異影響間作控病效果。

關鍵詞:間作;蠶豆品種;蠶豆枯萎病;真菌代謝功能多樣性;土壤酶活性

胡國彬，董坤，董艷，鄭毅，湯利，李欣然，劉一鳴.間作緩解蠶豆連作障礙的根際微生態(tài)效應.生態(tài)學報，2016，36(4):1010-1020.

Hu G B，Dong K，Dong Y，Zheng Y，Tang L，Li X R，Liu Y M.Effects of cultivars and intercropping on the rhizosphere microenvironment for alleviating the impact of continuous cropping of faba bean.Acta Ecologica Sinica，2016，36(4):1010-1020.

蠶豆是世界上重要的豆科作物，因具糧食、蔬菜、飼料和綠肥兼用等特點，且適應性廣而具有較高的固氮量，在世界范圍內(nèi)超過70個國家均有種植［1］。連作種植造成蠶豆生長矮小，瘦弱、病害加重、結(jié)莢少、產(chǎn)量低，連作障礙已成為制約全球及我國蠶豆可持續(xù)發(fā)展的重要因子［2］。而土傳病害是導致連作障礙的重要因子之一，蠶豆連作種植中枯萎病的發(fā)生是威脅蠶豆生產(chǎn)最嚴重的病害之一，該病在德國、日本、英國等均有報道，在我國蠶豆主產(chǎn)區(qū)發(fā)病非常普遍，云南是枯萎病發(fā)生最重的省份。枯萎病發(fā)生造成根系腐爛、莖基部壞死直至植株萎蔫死亡，一般田塊枯死率30%，重病田塊發(fā)病率高達90%［3］。

不同作物連作障礙發(fā)生的原因差別很大，但主要來自土壤。在多種作物上的研究表明，單一作物長期連作使土壤微生物區(qū)系惡化和土壤酶活性下降，導致作物土傳病害高發(fā)而減產(chǎn)，產(chǎn)生連作障礙［4-5］。連作障礙是長期以來困擾農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的復雜問題，其形成機理與防治一直是國內(nèi)外學者的研究熱點。多年來，很多研究者從改善土壤微生物區(qū)系與多樣性的角度研究了緩解連作障礙的措施，如施用生物有機肥、植物生長激素，接種菌根，嫁接等措施，并取得了一定的效果［6-9］。間作緩解連作障礙、增加作物產(chǎn)量的現(xiàn)象已經(jīng)在多種間作體系中得到證實［10-12］，但有關間作對根際微生態(tài)的影響及其與連作障礙方面的研究較少。近年來少量研究報道了間作系統(tǒng)根際細菌群落結(jié)構(gòu)變化與土傳病害控制的關系，如西瓜與旱作水稻間作豐富了土壤細菌群落結(jié)構(gòu)，抑制了病原菌的生長而降低了土壤中病原菌密度，減輕了西瓜枯萎病的發(fā)生［13］;小麥與黃瓜間作改變了細菌群落結(jié)構(gòu)并抑制了黃瓜枯萎病的發(fā)生［14］。最近研究顯示，間套作系統(tǒng)地下部動物多樣性和真菌群落多樣性變化也顯著影響連作障礙的發(fā)生。如茅蒼術與花生間作控制花生根腐病并顯著增加了花生產(chǎn)量與間作改變根際動物群落組成和增加動物多樣性密切相關［15］。菇菜套作明顯改變了番茄根際真菌的群落結(jié)構(gòu)，控制了番茄枯萎病的危害并顯著提高了番茄產(chǎn)量［16］。但有關小麥與蠶豆間作系統(tǒng)根際真菌群落結(jié)構(gòu)和酶活性變化與土傳病害控制方面的研究還未見報道。

Biolog微生物分析系統(tǒng)從1991年起被廣泛應用于微生物群落結(jié)構(gòu)分析，具有靈敏度高、分辨力強、無需分離純種微生物、操作簡便等優(yōu)點。在研究微生物群落功能多樣性時通常采用GN或ECO板，通過GN或ECO板微孔中四唑紫染料(MTT)顯色反應來反映微生物代謝作用。由于許多真菌代謝過程不能使四唑紫染料顯色，因此真菌群落代謝功能多樣性變化不能在Biolog GN或ECO板上得到有效反映，而需要改用Biolog FF板來進行測定，F(xiàn)F板采用碘硝基四氮唑紫染料(NT)使真菌代謝過程能夠通過顯色反映出來而成為研究真菌代謝功能多樣性的有效方法之一［17］。

本課題小組在前期研究中發(fā)現(xiàn)蠶豆連作導致蠶豆枯萎病嚴重發(fā)生，蠶豆枯萎病在田間存在多種病原菌的復合侵染，而最主要的病原菌-尖孢鐮刀菌蠶豆專化型在田間侵染過程復雜，存活時間長，發(fā)病后常規(guī)化學方法很難控制。而采用小麥與蠶豆間作顯著增加了蠶豆根際微生物的數(shù)量并減輕了枯萎病的危害［18］。研究還發(fā)現(xiàn)不同品種蠶豆對枯萎病的抗性存在明顯差異［19］，那么不同抗性蠶豆品種與小麥間作對蠶豆枯萎病發(fā)生有何影響，蠶豆根際真菌群落結(jié)構(gòu)和酶活性有何變化尚不清楚。因此，本研究采用3個品種蠶豆與小麥間作，研究不同品種蠶豆與小麥間作對蠶豆產(chǎn)量、枯萎病病情指數(shù)、蠶豆根際病原菌數(shù)量和土壤酶活性的影響，采用Biolog FF板測定單間作條件下蠶豆根際真菌群落結(jié)構(gòu)的變化，旨在明確間作對根際微生態(tài)環(huán)境的影響，從根際微生態(tài)環(huán)境變化與連作障礙角度闡明間作控制土傳病害的作用機理，為間作控病增產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1試驗設計

試驗于2011—2012年在云南省安寧市祿脿鎮(zhèn)上村進行。土壤基本農(nóng)化性狀為有機質(zhì)含量14.51 g/kg，堿解氮59.83 mg/kg，速效磷29.90 mg/kg，速效鉀52.11 mg/kg，pH值為7.25。試驗采用2因素隨機區(qū)組設計，A因素為種植模式，設蠶豆單作(M)和蠶豆與小麥間作(I)2種種植模式，B因素為蠶豆品種，設3個蠶豆品種，分別為92-24(92-24)，云豆324(YD324)和鳳豆6號(FD6)，組合為6個處理，每個處理重復3次，隨機區(qū)組排列，共18個小區(qū)。

試驗供試肥料為尿素、普通過磷酸鈣和硫酸鉀，間作小麥尿素施用量為225 kg/hm2(以N計)，磷肥施用量為112.5 kg/hm2(以P2O5計)，鉀肥施用量為112.5 kg/hm2(以K2O計)，不施有機肥。單間作蠶豆氮肥用量相同，均為小麥的一半，即112.5 kg/hm2，磷鉀肥用量為112.5 kg/hm2。蠶豆氮肥、磷肥和鉀肥全部作為基肥一次性施入;間作小麥氮肥50%作為基肥，另外50%作為追肥，分兩次施入。

1.2種植規(guī)格

小區(qū)面積5.4 m×4 m，小麥條播，行距0.2 m，蠶豆點播，行距0.3 m，株距0.15 m。間作小區(qū)按6行小麥2行蠶豆的方式種植，間作小區(qū)內(nèi)有3個小麥種植帶，4個蠶豆種植帶(每個間作小區(qū)的第1和第4個蠶豆帶的最外1行為保護行，不采樣)。在整個試驗田的四周均種植1 m寬的蠶豆帶作為保護行。

1.3蠶豆枯萎病調(diào)查

于蠶豆枯萎病發(fā)病初期(蠶豆分枝期)、發(fā)病盛期(蠶豆開花期)和發(fā)病末期(蠶豆鼓莢期)進行調(diào)查，調(diào)查時單作小區(qū)按對角線法選5點，每點調(diào)查3株，每個小區(qū)共調(diào)查15株;間作小區(qū)在兩個蠶豆帶上選取5點(第1個帶選2點，第2個帶選3點)，每點調(diào)查3株，每個小區(qū)共調(diào)查15株(圖1)。蠶豆枯萎病調(diào)查按5級分類標準進行［18］。

1.4取樣

于病害調(diào)查的同時進行采樣，即病害調(diào)查完的蠶豆植株即作為采樣植株，蠶豆單間作處理的每個重復均采15株蠶豆，將15株蠶豆的根際土壤混合為1個樣品(圖1)。在田間取得的根際土樣立即放入冰盒中保存用于土壤真菌群落結(jié)構(gòu)和酶活性分析。

1.5土壤真菌群落功能多樣性分析

土壤真菌代謝功能多樣性采用Biolog FF板(FF MicroPlate)進行。稱取相當于5 g烘干土重的新鮮土樣加入45 mL無菌的0.85%的NaC1溶液中，在搖床上振蕩30 min，將土壤樣品稀釋至10－3，吸取150 μL稀釋液至FF板的微孔中。將接種好的測試板加蓋置于25℃下培養(yǎng)，每隔24 h在自動讀盤機上用Biolog Reader4.2軟件(Biolog，Hayward，CA，USA)讀取490 nm波長的光密度值，培養(yǎng)時間為168 h。采用培養(yǎng)96 h的數(shù)據(jù)計算單孔平均顏色變化率(AWCD)、Shannon多樣性指數(shù)(H)和豐富度指數(shù)(S)。

式中，Ci為各反應孔在490 nm下的光密度值;R為FF板對照孔的光密度值;Ci－R小于0的孔在計算中均記為0，即Ci－ R的值均大于等于0。

圖1　蠶豆單作和小麥與蠶豆間作種植及病害調(diào)查與采樣示意圖Fig.1Schematic diagram of faba bean monocropping and wheat and faba bean intercropping and disease investigation and sampling

Shannon多樣性指數(shù)(H):

H=－∑Pi×lnPi

式中，Pi=(Ci－R)/∑(Ci－R)。

豐富度指數(shù)(S)用碳源代謝孔的數(shù)目表示群落豐富度指數(shù)。

1.6鐮刀菌數(shù)量測定

尖孢鐮刀菌計數(shù)參照Booth C［20］的方法選擇PCNB培養(yǎng)基進行鐮刀菌培養(yǎng)，其具體配方為:KH2PO41.0 g、KCl 0.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、五氯硝基苯(PCNB)0.5 g，水1000 mL，培養(yǎng)基用10%磷酸調(diào)pH值至3.8± 0.2，裝瓶滅菌。待培養(yǎng)基冷卻至60℃以下，迅速加入0.3 g硫酸鏈霉素和0.5 g牛膽汁，然后倒平板備用。尖孢鐮刀菌計數(shù)方法為稱取待測根際土10 g，放入裝有90 mL無菌水的三角瓶中，振蕩30 min，將樣品稀釋至10－3，吸取100 μL菌懸液加入到冷卻的PCNB培養(yǎng)基中，刮勻，置于28℃黑暗條件下培養(yǎng)3天后計數(shù)。

1.7土壤酶活性測定

土壤蔗糖酶測定采用3，5-二硝基水楊酸比色法，脲酶測定采用氯酸鈉-苯酚鈉比色法，過氧化氫酶活性采用高錳酸鉀滴定法進行測定［21］。

1.8蠶豆產(chǎn)量測定

于蠶豆成熟期進行實收測產(chǎn)，單作小區(qū)和間作小區(qū)均采收2行蠶豆植株，測定蠶豆的地上部生物量、籽粒產(chǎn)量和百粒重。

1.9數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用Microsoft Excel進行數(shù)據(jù)處理，采用SAS 8.0軟件進行方差分析和主成分分析。

2　結(jié)果與分析

2.1小麥與蠶豆間作對蠶豆產(chǎn)量的影響

從圖1可看出，與單作蠶豆相比，92-24與小麥間作對蠶豆地上部干重、籽粒產(chǎn)量和百粒重均無顯著影響。而云豆324與小麥間作和鳳豆6號與小麥間作處理均顯著提高了蠶豆地上部干重、籽粒產(chǎn)量和百粒重。

與單作蠶豆相比，YD324/W處理使蠶豆地上部干重、籽粒產(chǎn)量和百粒重分別增加51.26%、52.84%和6.43%;而FD6/W處理使蠶豆地上部干重、籽粒產(chǎn)量和百粒重分別增加99.11%、44.29%和12.17%。表明YD324/W和FD6/W處理顯著改善了蠶豆的生長，增加了蠶豆的產(chǎn)量。

表1　小麥與不同品種蠶豆間作對蠶豆產(chǎn)量的影響(平均值±標準偏差)Table1　Effects of wheat intercropped with different faba bean varieties on faba bean yield(Mean±SD)

2.2間作對蠶豆枯萎病病情指數(shù)的影響

從圖2可看出，發(fā)病初期，YD324/W和FD6/W處理均顯著降低了蠶豆枯萎病的病情指數(shù)，分別比單作蠶豆降低病指57.14%和41.67%，而92-24/W處理蠶豆枯萎病病指與單作蠶豆無顯著差異。

發(fā)病盛期，與發(fā)病初期相似，表現(xiàn)為YD324/W和FD6/W處理均顯著降低了蠶豆枯萎病的病情指數(shù)，病指分別比單作蠶豆降低15.63%和10.00%，而92-24/W處理蠶豆枯萎病病指與單作蠶豆無顯著差異。

發(fā)病末期，與單作處理相比，F(xiàn)D6/W處理使蠶豆枯萎病病情指數(shù)顯著降低22.41%，而YD324/W和92-24/W處理單間作處理間無顯著差異(圖2)。

圖2　不同品種蠶豆與小麥間作對蠶豆枯萎病病情指數(shù)的影響Fig.2Effects of different varieties faba bean intercropped wheat on index of faba bean fusarium wiltM:單作Monocropping;I:間作Intercropping;圖中相同發(fā)病時期不同字母表示0.05水平下的差異顯著性(P＜0.05)

2.3間作對蠶豆枯萎病病原菌(尖孢鐮刀菌)數(shù)量的影響

從圖3可看出，發(fā)病初期，YD324/W和FD6/W處理顯著降低了蠶豆根際的鐮刀菌數(shù)量。與單作相比，YD324/W和FD6/W處理根際鐮刀菌數(shù)量分別降低32.06%和29.88%，而92-24/W處理蠶豆根際鐮刀菌數(shù)量與單作蠶豆無顯著差異。

發(fā)病盛期，與發(fā)病初期相似，YD324/W和FD6/W處理顯著降低了根際鐮刀菌的數(shù)量，分別比單作蠶豆降低45.57%和17.69%，而92-24/W處理蠶豆根際鐮刀菌數(shù)量與單作蠶豆無顯著差異。

發(fā)病末期，YD324/W和FD6/W處理分別比單作顯著降低蠶豆根際鐮刀菌數(shù)量39.24%和50.76%，而92-24/W處理蠶豆根際鐮刀菌數(shù)量與單作蠶豆無顯著差異(圖3)。

圖3　不同品種蠶豆與小麥間作對蠶豆根際鐮刀菌數(shù)量的影響Fig.3Effects of different varieties faba bean intercropped with wheat on faba bean rhizosphere fusarium oxysporum amount

2.4間作對蠶豆根際真菌代謝功能多樣性的影響

2.4.1間作對根際真菌群落代謝剖面的影響

各處理根際土壤Biolog代謝剖面，即平均顏色變化率(AWCD)隨培養(yǎng)時間呈明顯的“S”型曲線變化。AWCD值能表征微生物群落碳源利用率，是土壤微生物群落利用單一碳源能力的重要指標，其隨時間的變化是微生物碳源利用強度的反映，因此AWCD值可表征土壤微生物的活性［22］。土壤連續(xù)培養(yǎng)7 d，每隔24 h測得的AWCD值變化如圖4，AWCD值隨培養(yǎng)時間延長而提高，各處理的AWCD值在24 h之前很小，表明在24 h內(nèi)碳源基本未被利用;培養(yǎng)24 h后AWCD值快速升高，反映培養(yǎng)24 h后碳源被根際真菌大幅度利用(圖4)。

從培養(yǎng)96 h時的AWCD值來看，間作對根際真菌的AWCD值有顯著影響(F=7438.32，P＜0.01)，但間作效應受蠶豆品種的影響。FD6/W和YD324/W處理均顯著提高了根際真菌的活性，其中又以FD6的效果最好，間作比單作提高AWCD值61.75%;而間作YD324比單作YD324提高AWCD值46.49%;92-24/W處理蠶豆根際真菌的AWCD值比單作降低2.72%(圖4)。表明間作對蠶豆根際真菌活性的影響與蠶豆品種有密切的關系。

圖4　不同品種蠶豆與小麥間作對蠶豆根際真菌平均顏色變化率的影響Fig.4Different varieties faba bean intercropped with wheat on AWCD value of faba bean rhizosphereM92-24:92-24單作92-24 monocropping;I92-24:92-24與小麥間作92-24 and wheat intercropping;MYD324:云豆324單作Yundou324 monocropping;IYD324:云豆324與小麥間作Yundou324 and wheat intercropping;MFD6:鳳豆6號單作Fengdou6 monocropping;IFD6:鳳豆6號與小麥間作Fengdou6 and wheat intercropping

2.4.2間作對蠶豆根際真菌多樣性指數(shù)的影響

間作對蠶豆根際真菌香農(nóng)多樣性指數(shù)(H)和豐富度指數(shù)(S)的影響見表2。從表2可看出，與單作蠶豆相比，YD324/W處理使蠶豆根際H和S分別顯著提高1.15%和16.22%;FD6/W處理使蠶豆根際H和S分別顯著提高3.07%和8.30%;92-24/W處理對蠶豆根際H和S均無顯著影響。

2.4.3間作蠶豆根際真菌群落的主成分分析

利用培養(yǎng)96 h的數(shù)據(jù)進行真菌群落功能的主成分分析(Principal Component Analysis，PCA)。95個主成分因子中前7個累積方差貢獻率達100%，其中第1主成分(PC1)的方差貢獻率為32.85%，第2主成分(PC2) 為22.11%，第3—7主成分貢獻率較小，為4.71%—14.05%。從中選取累積方差貢獻率為54.96%的前兩個主成分PC1和PC2來進行真菌群落功能多樣性分析，PC1和PC2的特征根分別為32.85和21.11。

表2　間作對蠶豆根際真菌多樣性指數(shù)和豐富度指數(shù)的影響Table2　Effects of intercropping on fungi diversity index and richness index of faba bean rhizosphere

主成分分析表明(圖5)，間作明顯改變了根際真菌的群落結(jié)構(gòu)，但間作對蠶豆根際真菌群落結(jié)構(gòu)的影響與蠶豆品種有關。YD324/W和FD6/W處理與蠶豆單作處理在主成分向量空間中均有較好的分離，而92-24單間作處理在主成分向量空間中幾乎無分離。表明云豆324、鳳豆6號與小麥間作均明顯改變了蠶豆根際真菌的群落結(jié)構(gòu)，而92-24與小麥間作對蠶豆根際真菌群落結(jié)構(gòu)無明顯影響。

圖5　不同品種蠶豆與小麥間作系統(tǒng)蠶豆根際真菌群落結(jié)構(gòu)的主成分分析Fig.5Principal Component analysis of fungi community structures in different varieties faba bean intercropped with wheat system

2.5小麥與不同品種蠶豆對蠶豆根際土壤酶活性的影響

2.5.1間作對蠶豆根際土壤蔗糖酶活性的影響

蔗糖酶廣泛存在于所有土壤中，能使蔗糖水解成葡萄糖和果糖，成為植物和微生物能利用的營養(yǎng)物質(zhì)，因此蔗糖酶是表征土壤生物化學活性的重要酶［21］。從圖6可看出，蠶豆從發(fā)病初期開始到發(fā)病末期，不同品種蠶豆單間作處理根際土壤蔗糖酶活性均呈先上升后下降的趨勢，在發(fā)病盛期達到最高峰。

整個發(fā)病期，間作對蠶豆根際土壤蔗糖酶活性均具有顯著影響(發(fā)病初期，F(xiàn)=56.29，P＜0.01;發(fā)病盛期，F(xiàn)=25.38，P＜0.01;發(fā)病末期，F(xiàn)=6.34，P＜0.01)。發(fā)病初期，YD324/W和FD6/W處理蠶豆根際土壤蔗糖酶活性均顯著高于單作，分別比單作提高27.43%和23.94%。發(fā)病盛期和發(fā)病末期，F(xiàn)D6/W處理蠶豆根際土壤蔗糖酶活性均顯著高于單作，分別比單作提高53.89%和65.47%。而整個發(fā)病期，92-24/W處理蠶豆根際土壤蔗糖酶活性與單作無顯著差異(圖6)。

圖6　不同品種蠶豆與小麥間作對蠶豆根際蔗糖酶活性影響Fig.6Effect of different varieties faba bean intercropped with wheat on invertase activity in faba bean rhizosphere

2.5.2間作對蠶豆根際土壤脲酶活性的影響

脲酶是一種專性較強的酶，能酶促酰胺態(tài)有機氮化物水解轉(zhuǎn)化為植物可以直接吸收利用的無機氮化物，在土壤氮素轉(zhuǎn)化過程中起著重要作用，其活性在一定程度上可反映土壤供氮能力［21］。從圖7可看出，隨蠶豆發(fā)病程度的加重，各品種蠶豆單間作處理根際土壤脲酶活性均呈先上升后下降的趨勢，在發(fā)病盛期達到最高峰。

整個發(fā)病期，間作對蠶豆根際土壤脲酶活性均有顯著影響(發(fā)病初期，F(xiàn)=3.73，P＜0.05;發(fā)病盛期，F(xiàn)= 12.89，P＜0.01;發(fā)病末期，F(xiàn)=17.01，P＜0.01)。發(fā)病初期，YD324/W處理顯著提高了蠶豆根際土壤的脲酶活性，比單作提高35.58%;發(fā)病盛期，YD324/W和FD6/W處理蠶豆根際土壤脲酶活性均顯著高于單作，分別比單作提高25.13%和36.47%;發(fā)病末期，YD324/W和FD6/W處理蠶豆根際土壤脲酶活性分別比單作顯著提高84.92%和45.62%(圖7)。

而發(fā)病初期、盛期和末期，92-24/W處理蠶豆根際土壤脲酶活性與單作相比均無顯著差異(圖7)。

圖7　不同品種蠶豆與小麥間作對蠶豆根際土壤脲酶活性影響Fig.7Effect of different varieties faba bean intercropped with wheat on urease activity in faba bean rhizosphere

2.5.3間作對蠶豆根際土壤過氧化氫酶活性的影響

過氧化氫酶能破壞土壤中生化反應生成的過氧化氫，減輕對植物的危害，其活性在一定程度上可反映土壤解毒作用的強弱［21］。發(fā)病初期和發(fā)病盛期，間作對蠶豆根際土壤氧化氫酶活性均具有顯著影響(發(fā)病初期，F(xiàn)=7.64，P＜0.01;發(fā)病盛期，F(xiàn)=11.64，P＜0.01)。發(fā)病初期，YD324/W和FD6/W處理蠶豆根際土壤過氧化氫酶活性顯著高于單作，分別比單作高15.38%和14.98%。發(fā)病盛期，YD324/W和FD6/W處理蠶豆根際土壤過氧化氫酶活性比單作顯著提高17.71%和26.22%。而92-24/W處理與單作蠶豆根際土壤過氧化氫酶活性無顯著差異。發(fā)病末期，間作對蠶豆根際土壤過氧化氫酶活性無顯著影響(圖8)。

圖8　不同品種蠶豆與小麥間作對蠶豆根際土壤過氧化氫酶活性影響Fig.8Effect of different varieties faba bean intercropped with wheat on catalase activity in faba bean rhizosphere

3　討論

3.1根際真菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性對間作緩解連作障礙的響應

連作條件下土壤中致病真菌類微生物大量繁殖和微生物區(qū)系的變化，是連作障礙的主要原因之一［5，13，23］。馬鈴薯的連作較輪作顯著降低了塊莖產(chǎn)量、植株生物量及經(jīng)濟生產(chǎn)力，連作馬鈴薯根際真菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著變化［24］。研究表明對作物土傳病害的抑制在一定程度上是土壤微生物群體的作用，當微生物群落結(jié)構(gòu)越豐富、多樣性越高時對抗病原菌的綜合能力就越強，因此調(diào)控作物根際微生物活性、多樣性和群落結(jié)構(gòu)是減輕土傳病害的關鍵［25］。

間套作比單一栽培更有利于增加土壤微生物數(shù)量，維持土壤微生物的多樣性，最終減輕土傳病害的發(fā)生危害而成為緩解連作障礙的有效方法［13，26］。宋亞娜等［27］采用DGGE的研究表明，小麥與玉米間作顯著改變了玉米根際真菌群落結(jié)構(gòu)組成。本研究采用Biolog FF板的研究結(jié)果表明，YD324/W和FD6/W處理顯著提高了蠶豆根際真菌的多樣性指數(shù)和豐富度指數(shù)(表2)，明顯改變了蠶豆根際真菌的群落結(jié)構(gòu)(圖5)，顯著降低了蠶豆根際鐮刀菌的數(shù)量(圖3)，導致蠶豆根際病原真菌數(shù)量占真菌總數(shù)的百分比下降，使蠶豆枯萎病得到有效控制并顯著提高了蠶豆產(chǎn)量(表1)。這與旱作水稻和西瓜間作提高了西瓜根際土壤微生物群落多樣性，降低西瓜枯萎病病情指數(shù)的結(jié)論相同［13］。

研究證實，根系分泌物在塑造土壤微生物群落中起著重要的作用，由于根系分泌物的成分和含量不同，會對土壤微生物的生長和代謝產(chǎn)生不同的影響［28］。間作種植在增加地上部多樣性的同時，也顯著增加了根系分泌物的種類和數(shù)量，從而產(chǎn)生正反饋調(diào)節(jié)作用，增加根際土壤微生物的功能多樣性［12，29］。本研究中，蠶豆與小麥間作改變根際真菌群落結(jié)構(gòu)，緩解蠶豆連作障礙的原因可能是由于間作作物根系的交錯疊加作用，根系分泌物十分豐富，使根際土壤中含有更多的維生素、碳水化合物、氨基酸和有機酸等碳源，不僅為根際真菌的生存和繁殖提供了所需的營養(yǎng)和能源物質(zhì)，而且間作系統(tǒng)中不同作物會產(chǎn)生不同的特異根系分泌物，并形成與之相適應的根際真菌群落，從而促進土壤真菌群落結(jié)構(gòu)多樣化的形成，使土壤健康發(fā)展。

同時本研究中不同品種蠶豆與小麥間作對蠶豆枯萎病的控制效應存在差異，這可能與不同品種蠶豆根系分泌物的差異有關。我們的前期研究表明，云豆324、鳳豆6號根系分泌物中游離氨基酸和可溶性總糖含量較高，而92-24根系分泌物中游離氨基酸和可溶性總糖含量顯著低于云豆324和鳳豆6號(另文發(fā)表)。蠶豆根系分泌物種類和含量的差異通過影響小麥與蠶豆間作系統(tǒng)根際微生物群落結(jié)構(gòu)的變化而最終影響對病原菌的抑制效果，表現(xiàn)出小麥與不同品種蠶豆間作控病效果的差異。而有關小麥與不同品種蠶豆間作對根系分泌物的影響還需進一步深入研究。

3.2根際真菌活性對間作緩解連作障礙的響應

土壤微生物群落的AWCD與作物發(fā)病情況有較好的一致性，是表征與土壤防病能力密切相關的重要參數(shù)［22］。本研究中YD324/W和FD6/W處理顯著提高了蠶豆根際真菌對碳源的利用能力并降低了蠶豆枯萎病的病情指數(shù)(圖2)，原因一方面可能是YD324/W和FD6/W條件下蠶豆根際真菌活性提高(圖4)，能利用多種碳源且利用效率較高，使蠶豆根際真菌生長更好，從而大量消耗根際的能源和碳源，對病原菌來說可用的碳源較少而不能大量增殖，最終抑制了鐮刀菌的生長而降低病害的發(fā)生(圖3)。研究表明單一連作條件下，作物根系分泌和土壤中累積的自毒物質(zhì)會促進病原菌的增殖，惡化微生物群落環(huán)境，助長土傳病害的發(fā)生，而惡化的微生物群落結(jié)構(gòu)使土壤中自毒物質(zhì)降解緩慢，造成自毒物質(zhì)積累而進一步加重作物連作障礙［30］。因此YD324/W和FD6/W處理降低蠶豆枯萎病病情指數(shù)的另一方面原因可能是間作提高了蠶豆根際真菌的活性，從而促進根際真菌對自毒物質(zhì)的分解而減輕其對病原菌的刺激作用。

3.3根際土壤酶活性對間作緩解連作障礙的響應

土壤酶是土壤質(zhì)量或健康評價指標體系中的重要指標之一［23］。單一作物持續(xù)連作會使蔗糖酶、脲酶、磷酸酶等土壤酶活性隨連作時間延長而下降［31］。隨花生連作年限增加，過氧化氫酶活性下降，土壤中氧化作用降低，使過氧化氫分解減慢，導致過氧化氫在土壤中大量積累，容易使根系的毒害作用加重而引起連作障礙［32］。王樹起等［33］的研究表明，土壤酶活性降低是造成大豆連作障礙減產(chǎn)的重要原因之一。本研究結(jié)果表明，3個發(fā)病期，YD324/W和FD6/W處理均顯著提高了蠶豆根際土壤脲酶活性(圖7);FD6/W處理顯著提高了蠶豆根際土壤的蔗糖酶活性(圖6);發(fā)病初期和發(fā)病盛期，YD324/W和FD6/W處理均顯著提高了蠶豆根際土壤過氧化氫酶活性(圖8)。本研究結(jié)果與玉米大豆間作提高根際土壤脲酶、磷酸酶、轉(zhuǎn)化酶和蛋白酶活性的結(jié)論相似［34］。

間作提高土壤酶活性的原因可能是在間作系統(tǒng)中，兩種作物根系的互作不僅使有機物轉(zhuǎn)化速度加快，生物氧化代謝活動加強，而且增加了根際微生物數(shù)量和活性，使作物根系和微生物向土壤中釋放酶的數(shù)量增加;而間作系統(tǒng)酶活性提高并降低土傳病害的原因可能是間作系統(tǒng)中根際微生物活性增強，對土壤中自毒物質(zhì)進行加速分解而減輕自毒物質(zhì)對酶活性的抑制作用。本研究結(jié)果表明間作提高蠶豆根際土壤酶活性對控制蠶豆枯萎病發(fā)生具有影響，這與嫁接辣椒根際土壤過氧化氫酶和脫氫酶活性均顯著高于自根苗，嫁接辣椒較高的根際土壤酶活性是其青枯病抗性增強的重要原因之一的結(jié)論相似［35］。

總之，小麥與蠶豆間作系統(tǒng)中，蠶豆根際土壤中真菌群落的多樣性和豐富度顯著增加，真菌活性顯著增強，真菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯變化，蠶豆枯萎病致病菌—尖孢鐮刀菌的數(shù)量顯著降低，根際土壤酶活性增強，最終減輕了蠶豆枯萎病的危害并提高了蠶豆產(chǎn)量。小麥與蠶豆間作改變了蠶豆根際的微生態(tài)環(huán)境，使根際土壤朝著健康方向轉(zhuǎn)化，最終緩解了蠶豆連作障礙的不良影響。

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Effects of cultivars and intercropping on the rhizosphere microenvironment for alleviating the impact of continuous cropping of faba bean

HU Guobin1，DONG Kun2，DONG Yan1，*，ZHENG Yi1，3，TANG Li1，LI Xinran1，LIU Yiming1
1 College of Resources and Environment，Yunnan Agricultural University，Kunming 650201，China
2 College of Food Science and Technology，Yunnan Agricultural University，Kunming 650201，China
3 Southwest Forestry University，Kunming 650224，China

Abstract:A field trial was conducted to investigate the effects of three different faba bean cultivars［92-24(92-24)，Yundou 324(YD324)，F(xiàn)engdou 6(FD6)］and wheat intercropping on yield，disease index of fusarium wilt，amount of Fusarium oxysporum on faba bean，functional diversity of the fungal community，and enzyme activities in the rhizosphere of faba bean.Results showed that in comparison with that of mono-cropping，aboveground dry weight，grain yield，and 100-seed weight of faba bean were significantly increased by use of YD324 with wheat intercropping(YD324/W)，and by use of FD6 with wheat intercropping(FD6/W).The disease index of fusarium wilt，and the amount of Fusarium oxysporum on YD324 decreased significantly(57.14%and 32.06%，respectively)as did those of FD6(41.67%and 29.88%，book=1011,ebook=123respectively)as they were intercropped with wheat，but use of 92-24 caused no significant change.The Shannon diversity index(H)and substrate richness(S)in Biolog FF microplates of YD324/W and FD6/W were significantly higher than those for faba bean from mono-cropping.In comparison with the values for mono-cropping，the average well color development value(AWCD)of faba beans with YD324/W and FD6/W was increased by 61.75%and 46.49%，respectively.The fungal communities of faba bean rhizosphere were also changed with YD324/W and FD6/W，but use of 92-24 with wheat intercropping(92-24/W)had no significant impact on H，S，AWCD value，and fungal community.During different stages of fusarium wilt occurrence in the faba beans，the activity of invertase，urease，and catalase in the faba bean rhizosphere increased with YD324/W and FD6/W，but not with 92-24/W.Faba bean with wheat intercropping could change fungal communities;increase fungal activity，Shannon diversity index，and substrate richness;and promote soil enzyme activities.It is suggested that wheat and faba bean intercropping plays an important role in rhizosphere soil microenvironment.This could reduce the amount of Fusarium oxysporum and control the build-up of soil-borne disease caused by continuous faba bean cultivation，but the effects of intercropping are influenced by the faba bean cultivars used.

Key Words:intercropping;faba bean cultivar;faba bean fusarium wilt;functional diversity of fungi community;soil enzymes activity

*通訊作者

Corresponding author.E-mail:dongyanyx@163.com

收稿日期:2014-07-01;網(wǎng)絡出版日期:2015-07-09

基金項目:國家自然科學基金項目(31360507，31210103906，31260504，31460551，31060277)

DOI:10.5846/stxb201407011357