急性髓系白血病患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞FANCD2表達(dá)及意義

鄧娜，婁曄，于一冰，王曉鷗，樊華

(1中國醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院，沈陽110032；2大慶市油田總醫(yī)院；3秦皇島市第一醫(yī)院)

急性髓系白血病患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞FANCD2表達(dá)及意義

鄧娜1，婁曄2，于一冰3，王曉鷗1，樊華1

(1中國醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院，沈陽110032；2大慶市油田總醫(yī)院；3秦皇島市第一醫(yī)院)

目的 探討急性髓系白血病(AML)患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞范可尼貧血互補(bǔ)群蛋白質(zhì)D2(FANCD2)表達(dá)及意義。方法 選擇AML患者111例，其中初診64例、完全緩解27例、復(fù)發(fā)20例；另選缺鐵性貧血患者28例、血小板減少性紫癜患者14例作為對(duì)照組。患者均于入院時(shí)抽取骨髓，提取骨髓單個(gè)核細(xì)胞，采用Western blotting法檢測骨髓單個(gè)核細(xì)胞FANCD2表達(dá)。分析骨髓單個(gè)核細(xì)胞FANCD2的相對(duì)表達(dá)量與AML患者性別、年齡、AML分型的關(guān)系。結(jié)果 初診AML患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞FANCD2的相對(duì)表達(dá)量為0.477±0.127，完全緩解AML患者為1.284±0.067，復(fù)發(fā)AML患者為0.410±0.026，對(duì)照組為1.352±0.066；初診及復(fù)發(fā)AML患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞FANCD2的相對(duì)表達(dá)量均低于對(duì)照組(P均<0.05)，其余組間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。AML患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞FANCD2的相對(duì)表達(dá)量與性別、年齡、AML分型均無關(guān)(P均>0.05)。結(jié)論 AML患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞FANCD2表達(dá)降低，F(xiàn)ANCD2表達(dá)降低或缺失可能參與AML的發(fā)病及復(fù)發(fā)。

急性髓系白血??；范可尼貧血互補(bǔ)群蛋白質(zhì)D；骨髓單個(gè)核細(xì)胞

范可尼貧血(FA)是一種常染色體隱性遺傳病，以染色體不穩(wěn)定且高度易患急性髓系白血病(AML)[1]、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌、婦科腫瘤等為特征。FA的發(fā)病機(jī)制為基因表達(dá)異常所致FA/BRCA通路失活，導(dǎo)致DNA損傷修復(fù)功能缺陷[2～5]。范可尼貧血互補(bǔ)群蛋白質(zhì)D2(FANCD2)是FA/BRCA通路中的關(guān)鍵蛋白，其表達(dá)異常與乳腺癌、宮頸癌、卵巢癌等多種腫瘤的發(fā)病有關(guān)，但FANCD2表達(dá)變化與AML關(guān)系的研究鮮見報(bào)道。本研究探討AML患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞FANCD2的表達(dá)變化及意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2007年9月～2015年7月中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院和第四醫(yī)院收治的AML患者111例(AML組)，男62例、女49例，年齡19～78歲、中位年齡56歲，AML分型：M1型5例、M2型28例、M3型35例、M4型10例、M5型25例、M6型8例；初診64例，完全緩解27例、復(fù)發(fā)20例。AML緩解和復(fù)發(fā)均符合骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)(M)、細(xì)胞免疫學(xué)(I)、細(xì)胞遺傳學(xué)(C)和分子生物學(xué)(M)標(biāo)準(zhǔn)，即MICM標(biāo)準(zhǔn)。同期另選缺鐵性貧血患者28例、血小板減少性紫癜患者14例作為對(duì)照組，男24例、女18例，年齡25～72歲、中位年齡54歲。兩組性別、年齡具有可比性。

1.2 骨髓單個(gè)核細(xì)胞FANCD2表達(dá)檢測 采用Western blotting法。兩組均于入院時(shí)選擇髂前或髂后上棘作為穿刺點(diǎn)，常規(guī)方法抽取骨髓3～5 mL，肝素抗凝；緩慢注入4 mL淋巴細(xì)胞分離液，2 100 r/min離心20 min；取中間細(xì)胞層，PBS洗滌(1 500 r/min離心5 min)，棄上清；加入蒸餾水2 mL作用1 min，再加入1.8% NaCl 2 mL，1 500 r/min離心5 min，棄上清液；留取1×106個(gè)單個(gè)核細(xì)胞(約50 μL細(xì)胞沉淀)，-80 ℃冰箱凍存。將提取的骨髓單個(gè)核細(xì)胞在RIPA-buffer蛋白裂解液中裂解，超聲破碎細(xì)胞，4 ℃、12 000 r/min離心20 min，取上清液，采用分光光度計(jì)檢測FANCD2表達(dá)；取25 μg置于10% SDS-PAGE凝膠上電泳；將電泳產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，加入兔抗人FANCD2一抗，4 ℃孵育過夜；加入山羊抗兔二抗，顯影劑顯影。以β-actin為內(nèi)參。采用GTS圖像分析系統(tǒng)掃描目的條帶，以校正值K對(duì)目的條帶灰度值進(jìn)行半定量分析。K=FANCD2條帶灰度值/β-actin條帶灰度值。并分析骨髓單個(gè)核細(xì)胞FANCD2的相對(duì)表達(dá)量與AML患者性別、年齡、AML分型的關(guān)系。

2 結(jié)果

初診AML患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞FANCD2的相對(duì)表達(dá)量為0.477±0.127，完全緩解AML患者為1.284±0.067，復(fù)發(fā)AML患者為0.410±0.026，對(duì)照組為1.352±0.066；初診及復(fù)發(fā)AML患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞FANCD2的相對(duì)表達(dá)量均低于對(duì)照組(P均<0.05)，其余組間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。AML患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞FANCD2的相對(duì)表達(dá)量與性別、年齡、AML分型均無關(guān)(P均>0.05)，見表1。

表1 骨髓單個(gè)核細(xì)胞FANCD2的相對(duì)表達(dá)量與AML患者性別、年齡、AML分型的關(guān)系

3 討論

FANCD2基因定位于3p25.3，有44個(gè)外顯子，編碼兩種均含有1 451個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)(FANCD2-S和FANCD2-L)，兩種蛋白質(zhì)通過化學(xué)修飾可實(shí)現(xiàn)相互轉(zhuǎn)換。FANCD2作為FA/BRCA通路的關(guān)鍵基因，是FA/BRCA通路激活的標(biāo)志。FANCD2的主要功能是參與細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞凋亡、DNA損傷修復(fù)及維持染色體和基因組穩(wěn)定。當(dāng)細(xì)胞DNA受到損傷或處于細(xì)胞周期S期時(shí)，F(xiàn)ANCD2在上游FA/BRCA通路核心復(fù)合體的作用下發(fā)生單泛素化，轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核DNA損傷部位，進(jìn)而招募更多的 DNA 修復(fù)蛋白，參與DNA損傷修復(fù)過程[6]?；蛲蛔?、microRNA序列變異等多種因素均可調(diào)控FANCD2的泛素化及表達(dá)[7]，當(dāng)FANCD2低表達(dá)或功能缺失時(shí)，F(xiàn)A/BRCA通路的正常功能受損，細(xì)胞失去保護(hù)機(jī)制，導(dǎo)致細(xì)胞染色體不穩(wěn)定，最終引起腫瘤的發(fā)生。

目前已在多種實(shí)體腫瘤中證實(shí)，F(xiàn)ANCD2蛋白低表達(dá)或功能缺失與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及患者預(yù)后相關(guān)[8,9]。FANCD2在乳腺癌中的研究較多，10%～20%的乳腺癌細(xì)胞中 FANCD2表達(dá)缺失[10]；Zhang等[11]發(fā)現(xiàn)，乳腺癌組織FANCD2陽性細(xì)胞表達(dá)率明顯低于正常乳腺組織，且部分侵襲性乳腺癌中FANCD2表達(dá)缺失。但也有報(bào)道稱，F(xiàn)ANCD2基因在卵巢癌早期高表達(dá)，Ⅲ期低表達(dá)，推測可能臨界腫瘤在惡性轉(zhuǎn)化過程中激活了相關(guān) DNA 修復(fù)和維持基因組穩(wěn)定的基因，進(jìn)而導(dǎo)致這些基因表達(dá)上調(diào)[12]。有研究還發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ANCD2在正常肺組織中不表達(dá)，在非小細(xì)胞肺癌組織中可見表達(dá)，但表達(dá)量與腫瘤分期無關(guān)[13]。FANCD2在不同組織中表達(dá)不同，可能與組織特異性、樣本量、種族或檢測方法不同有關(guān)。

本研究以AML初診、復(fù)發(fā)及完全緩解患者為研究對(duì)象，并選取缺鐵性貧血和血小板減少性紫癜患者作為對(duì)照組。因健康成年人的骨髓難以得到，臨床研究獲取其骨髓不符合倫理學(xué)要求，缺鐵性貧血和血小板減少患者臨床常規(guī)進(jìn)行骨髓檢查，且二者骨髓各階段造血細(xì)胞比例與正常個(gè)體大致相同，因此選擇二者作為對(duì)照。結(jié)果顯示，對(duì)照組及AML完全緩解患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞FANCD2的相對(duì)表達(dá)量均高于AML初診和復(fù)發(fā)患者，提示FANCD2低表達(dá)參與了AML的發(fā)生及復(fù)發(fā)。其機(jī)制可能為FANCD2表達(dá)降低或缺失可能使下游FANCD2單泛素化缺失，F(xiàn)A/BRCA通路缺陷，導(dǎo)致DNA修復(fù)能力下降，細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制逐漸喪失，使細(xì)胞抵御外來損害的能力下降。本研究還發(fā)現(xiàn)，AML患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞FANCD2的相對(duì)表達(dá)量與性別、年齡及AML分型均無關(guān)，可能與本研究病例數(shù)較少、研究方法單一有關(guān)，確切結(jié)果及具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

總之，AML患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞FANCD2表達(dá)降低，F(xiàn)ANCD2表達(dá)降低或缺失可能與AML的發(fā)病及復(fù)發(fā)有關(guān)。

[1] Joenje H, Patel KJ. The emerging genetic and molecular basis of Fanconi anaemia[J]. Nat Rev Genet, 2001,2(6):446-457.

[2] Alter BP. Fanconi anemia and the development of leukemia[J]. Best Pract Res Clin Haematol, 2014,27(3-4):214-221.

[3] Stoepker C, Hain K, Schuster B, et al. SLX4, a coordinator of structure-specific endonucleases, is mutated in a new Fanconi anemia subtype[J]. Nat Genet, 2011,43(2):138-141.

[4] Mouw KW, D′Andrea AD. Crosstalk between the nucleotide excision repair and Fanconi anemia/BRCA pathways[J]. DNA Repair (Amst), 2014(19):130-134.

[5] Shen Y, Zhang J, Yu H, et al. Advances in the understanding of Fanconi Anemia Complementation Group D2 Protein (FANCD2) in human cancer[J]. Cancer Cell Microenviron, 2015,2(4):e986.

[6] Koczorowska AM, Bialkowska A, Kluzek K, et al. The role of the Fanconi anemia pathway in DNA repair and maintenance of genome stability[J]. Postepy Hig Med Dosw (Online), 2014(68):459-472.

[7] Suresh B, Kumar AM, Jeong HS, et al. Regulation of Fanconi anemia protein FANCD2 monoubiquitination by miR-302[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2015,466(2):180-185.

[8] Rudland PS, Platt-Higgins AM, Davies LM, et al. Significance of the Fanconi anemia FANCD2 protein in sporadic and metastatic human breast cancer[J]. Am J Pathol, 2010,176(6):2935-2947.

[9] Alexander BM, Wang XZ, Niemierko A, et al. DNA repair biomarkers predict response to neoadjuvant chemoradiotherapy in esophageal cancer[J]. Int J Radiat Oncol Biol Phys, 2012,83(1):164-171.

[10] van der Groep P, Hoelzel M, Buerger H, et al. Loss of expression of FANCD2 protein in sporadic and hereditary breast cancer[J]. Breast Cancer Res Treat, 2008,107(1):41-47.

[11] Zhang B, Chen R, Lu J, et al. Expression of FANCD2 in sporadic breast cancer and clinicopathological analysis[J]. J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci, 2010,30(3):322-325.

[12] Ganzinelli M, Mariani P, Cattaneo D, et al. Expression of DNA repair genes in ovarian cancer samples: biological and clinical considerations[J]. Eur J Cancer, 2011,47(7):1086-1094.

[13] Ferrer M, Span SW, Vischioni B, et al. FANCD2 expression in advanced non-small-cell lung cancer and response to platinum-based chemotherapy[J]. Clin Lung Cancer, 2005,6(4):250-254.

遼寧省科技廳資助項(xiàng)目(2013225021)。

樊華(E-mail： fanhua66@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.24.030

R733.71

B

1002-266X(2016)24-0079-03

2016-01-12)