生長(zhǎng)抑素對(duì)人肝癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的抑制作用

彭釗，鄺學(xué)軍，王建鈞，何松，劉力

(湘南學(xué)院附屬醫(yī)院，湖南郴州423000)

生長(zhǎng)抑素對(duì)人肝癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的抑制作用

彭釗，鄺學(xué)軍，王建鈞，何松，劉力

(湘南學(xué)院附屬醫(yī)院，湖南郴州423000)

目的 探討生長(zhǎng)抑素(SST)對(duì)人肝癌細(xì)胞系HepG2上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的影響及其可能機(jī)制。方法 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HepG2細(xì)胞，隨機(jī)分為對(duì)照組及SST低、中、高劑量組，分別給予0、100、200、400 μg/mL SST處理。各組繼續(xù)培養(yǎng)24 h，采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力(細(xì)胞存活率)，Transwell小室法檢測(cè)細(xì)胞遷移能力(跨膜細(xì)胞數(shù))，Western blotting法檢測(cè)細(xì)胞E-鈣黏蛋白(E-cadherin)和波形蛋白(Vimentin)表達(dá)。結(jié)果 對(duì)照組及SST低、中、高劑量組細(xì)胞存活率依次為100%、(78.7±6.36)%、(68.0±6.66)%和(44.0±7.23)%，跨膜細(xì)胞數(shù)依次為(53±6)、(41±2)、(28±5)和(22±3)個(gè)。SST低、中、高劑量組細(xì)胞存活率、跨膜細(xì)胞數(shù)均低于對(duì)照組(P均<0.05)，且隨著SST濃度升高，細(xì)胞存活率、跨膜細(xì)胞數(shù)逐漸降低(F分別為79.13、51.71，P均<0.05)。對(duì)照組及SST低、中、高劑量組E-cadherin相對(duì)表達(dá)量依次為0.20±0.04、0.28±0.04、0.46±0.06和0.75±0.07，Vimentin相對(duì)表達(dá)量依次為1.17±0.15、0.79±0.04、0.54±0.08和0.57±0.06；SST低、中、高劑量組E-cadherin相對(duì)表達(dá)量均高于對(duì)照組、Vimentin相對(duì)表達(dá)量均低于對(duì)照組(P均<0.05)，且隨著SST濃度升高，E-cadherin相對(duì)表達(dá)量逐漸升高(P均<0.05)，而Vimentin相對(duì)表達(dá)量降低(P均<0.05)。結(jié)論 SST可抑制人肝癌細(xì)胞系HepG2的侵襲能力，其機(jī)制可能與增加E-cadherin蛋白表達(dá)、降低Vimentin蛋白表達(dá)，繼而逆轉(zhuǎn)HepG2細(xì)胞的EMT有關(guān)。

肝癌；生長(zhǎng)抑素；上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化；E-鈣黏蛋白；波形蛋白

肝細(xì)胞癌(HCC)是臨床上常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率居惡性腫瘤的第5位，病死率為腫瘤相關(guān)死亡的第3位[1]。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是指上皮細(xì)胞在特定的生理和病理情況下轉(zhuǎn)化成有遷移能力的間質(zhì)細(xì)胞，其主要特征為細(xì)胞黏附分子[E-鈣黏蛋白(E-cadherin)等]表達(dá)減少、細(xì)胞骨架蛋白轉(zhuǎn)化為以波形蛋白(Vimentin)為主以及形態(tài)上具有間充質(zhì)細(xì)胞的特征等[2]。近年研究表明，EMT是HCC發(fā)生侵襲及轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)[3]。生長(zhǎng)抑素(SST)及其類似物是一種多肽類激素，目前臨床主要用于治療急性胰腺炎、胰腺損傷或胰腺手術(shù)后應(yīng)激性胰酶分泌和上消化道出血等疾病[4]。近年研究發(fā)現(xiàn)，SST還具有抑制細(xì)胞增殖、抑制促腫瘤生長(zhǎng)激素釋放及血管生成等多種抗腫瘤活性[5]。2014年3～12月，我們觀察了SST對(duì)人肝癌細(xì)胞系HepG2增殖、遷移能力的影響，現(xiàn)分析結(jié)果并探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 人肝癌細(xì)胞系HepG2，由中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物所細(xì)胞中心提供。注射用SST，揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)；DMEM培養(yǎng)基、四甲基偶氮唑鹽(MTT)、胰蛋白酶，美國(guó)Sigma公司；鼠抗人E-cadherin、Vimentin抗體，美國(guó)Proteintech公司；FBS，杭州四季青生物工程材料有限公司；Transwell系統(tǒng)，美國(guó)Corning公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及干預(yù) 將人肝癌細(xì)胞系HepG2置于含100 U/mL青-鏈霉素+10% FBS的DMEM培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí)傳代。取傳6代的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化后制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度至1×104/mL，接種于96孔板中，每孔100 μL，培養(yǎng)24 h。隨機(jī)分為對(duì)照組及SST低、中、高劑量組，每組設(shè)6個(gè)平行孔。SST低、中、高劑量組分別加入100、200、400 μg/mL SST溶液200 μL，對(duì)照組給予等體積的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.2.2 細(xì)胞增殖能力檢測(cè) 采用MTT法。每組取5孔，分別加入5 mg/mL MTT溶液20 μL。培養(yǎng)4 h，吸凈上清液，每孔加DMSO 150 μL，振蕩10 min，酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm波長(zhǎng)處的光密度值(OD值)。細(xì)胞存活率=試驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD 值×100%。

1.2.3 細(xì)胞遷移能力檢測(cè) 采用Transwell小室法。取100 μL單細(xì)胞懸液(細(xì)胞密度為5×104/mL)接種于Transwell上室中，并在下室加入含10% FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基600 μL。培養(yǎng)24 h倒置Transwell小室，濾膜下表面朝上，4%多聚甲醛室溫固定15 min，0.1%結(jié)晶紫染色15 min，封片。顯微鏡下(200倍)隨機(jī)取5個(gè)不同視野，計(jì)數(shù)穿過(guò)濾膜的細(xì)胞數(shù)(跨膜細(xì)胞數(shù))，每組平行設(shè)3個(gè)濾膜。

1.2.4 細(xì)胞E-cadherin、Vimentin表達(dá)檢測(cè) 采用Western blotting法。取各組細(xì)胞，提取總蛋白，BCA法進(jìn)行蛋白定量。取40 μg蛋白進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜，5% BSA封閉2 h，一抗4 ℃孵育過(guò)夜：E-cadherin(1∶1 000)、Vimentin(1∶1 000)、β-actin(1∶500)，TBST洗膜10 min×4次；相應(yīng)二抗室溫孵育2 h，TBST洗膜10 min×4次。加入ECL發(fā)光劑，化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)自動(dòng)提取結(jié)果，計(jì)算兩種蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞增殖能力比較 對(duì)照組細(xì)胞存活率為100%，SST低、中、高劑量組細(xì)胞存活率分別為(78.7±6.36)%、(68.0±6.66)%、(44.0±7.23)%。SST低、中、高劑量組細(xì)胞存活率均低于對(duì)照組(P均<0.05)，且隨著SST濃度升高，細(xì)胞存活率逐漸降低(F=79.13，P<0.05)。

2.2 各組細(xì)胞遷移能力比較 對(duì)照組跨膜細(xì)胞數(shù)為(53±6)個(gè)，SST低、中、高劑量組分別為(41±2)、(28±5)、(22±3)個(gè)。SST低、中、高劑量組跨膜細(xì)胞數(shù)均低于對(duì)照組(P均<0.05)，且隨著SST濃度升高，跨膜細(xì)胞數(shù)逐漸減少(F=51.71，P<0.05)。

2.3 各組E-cadherin、Vimentin表達(dá)比較 見(jiàn)表1。

表1 各組E-cadherin、Vimentin相對(duì)表達(dá)量比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與SST低劑量組比較，#P<0.05；與SST中劑量組比較，△P<0.05。

3 討論

肝癌的侵襲及轉(zhuǎn)移涉及多個(gè)環(huán)節(jié)，主要包括腫瘤細(xì)胞間的黏附能力下降、細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)的破壞、腫瘤細(xì)胞的遠(yuǎn)處移動(dòng)及腫瘤細(xì)胞定植后形成新生血管等多個(gè)過(guò)程，每個(gè)過(guò)程又受到許多因素的干擾[6]。研究發(fā)現(xiàn)，肝癌細(xì)胞的侵襲性與EMT密切相關(guān)[7]。腫瘤細(xì)胞EMT后，獲得侵襲特征，浸潤(rùn)至周圍的基質(zhì)中，形成促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移的微環(huán)境[8]；具體表現(xiàn)為細(xì)胞間黏附連接分子(E-cadherin/Catenins復(fù)合體)表達(dá)下調(diào)，伴隨間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物Vimentin等的表達(dá)、細(xì)胞骨架重排、形成新的細(xì)胞-基質(zhì)黏附等。E-cadherin被認(rèn)為是發(fā)生EMT的關(guān)鍵分子，在腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移中具有重要作用。當(dāng)E-cadherin正常存在時(shí)，腫瘤細(xì)胞相互黏附，而當(dāng)其表達(dá)下降時(shí)，腫瘤上皮細(xì)胞發(fā)生EMT，運(yùn)動(dòng)活性和遷移能力增強(qiáng)的腫瘤細(xì)胞具有向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的能力。Vimentin是一種重要的細(xì)胞骨架蛋白，在胚胎發(fā)育及細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化時(shí)出現(xiàn)，是EMT過(guò)程的標(biāo)志蛋白[9]。發(fā)生EMT的細(xì)胞可獲得穿透基底膜和間質(zhì)組織的能力，組織細(xì)胞間黏附減弱，并可穿過(guò)循環(huán)系統(tǒng)向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，使腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)[10]。大量研究證實(shí)，EMT是惡性腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的始動(dòng)環(huán)節(jié)。因此，靶向腫瘤EMT阻滯劑成為目前研究的新方向[11]。但迄今為止，尚無(wú)有效且安全的藥物用于臨床抗肝癌EMT及侵襲、轉(zhuǎn)移的治療。

本研究結(jié)果顯示，SST低、中、高劑量組細(xì)胞存活率、跨膜細(xì)胞數(shù)均低于對(duì)照組，隨SST濃度升高，細(xì)胞存活率及跨膜細(xì)胞數(shù)呈下降趨勢(shì)，表明SST對(duì)HepG2細(xì)胞增殖及遷移能力有抑制作用，并且這種抑制作用呈濃度依賴性。本研究還發(fā)現(xiàn)，SST低、中、高劑量組E-cadherin表達(dá)均上調(diào)，Vimentin表達(dá)均下降，二者均存在劑量依賴性。提示SST具有逆轉(zhuǎn)肝癌細(xì)胞EMT的作用，且這種作用與SST濃度有關(guān)。王慶才等[12]研究發(fā)現(xiàn)，72%的肝癌組織表達(dá)SST受體亞型SSTR-2和(或)SSTR-5。目前認(rèn)為，SSTR-2、SSTR-5為介導(dǎo)SST抗腫瘤增殖效應(yīng)的主要亞型[13]。SST逆轉(zhuǎn)肝癌細(xì)胞EMT的可能機(jī)制為SST與HepG2細(xì)胞表面的SSTR2結(jié)合，激活SSTR-2基因[14]，通過(guò)cAMP途徑、離子通道途徑、蛋白磷酸酶途徑等直接作用[15]，上調(diào)E-cadherin表達(dá)，減少Vimentin表達(dá)，導(dǎo)致肝癌細(xì)胞增殖及侵襲能力減弱。

綜上所述，SST能抑制人肝癌細(xì)胞系HepG2的侵襲及轉(zhuǎn)移能力，其機(jī)制可能與上調(diào)E-cadherin表達(dá)，下調(diào)Vimentin表達(dá)，逆轉(zhuǎn)HepG2細(xì)胞的EMT有關(guān)。但EMT的調(diào)控過(guò)程非常復(fù)雜，是腫瘤微環(huán)境和細(xì)胞內(nèi)部因素共同作用的結(jié)果，其具體機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。

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