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    腺苷預(yù)處理對局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠的腦保護(hù)作用及其機(jī)制

    2016-05-10 06:27:54尉娜李靜李娟譚軍
    山東醫(yī)藥 2016年20期
    關(guān)鍵詞:內(nèi)源性腺苷陽性細(xì)胞

    尉娜,李靜,李娟,譚軍

    (新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院,河南新鄉(xiāng) 453003)

    腺苷預(yù)處理對局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠的腦保護(hù)作用及其機(jī)制

    尉娜,李靜,李娟,譚軍

    (新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院,河南新鄉(xiāng) 453003)

    目的 探討腺苷預(yù)處理對局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠的腦保護(hù)作用及其機(jī)制。方法 將健康雄性成年SD大鼠224只隨機(jī)分為假手術(shù)組、腺苷預(yù)處理后假手術(shù)組、缺血再灌注組和腺苷預(yù)處理組,每組56只。各組均采用線栓法制備大鼠大腦中動脈閉塞模型,假手術(shù)組及腺苷預(yù)處理后假手術(shù)組不插線栓;手術(shù)前3天,假手術(shù)組和缺血再灌注組腹腔注射生理鹽水,腺苷預(yù)處理后假手術(shù)組和腺苷預(yù)處理組腹腔注射腺苷注射液。各組于缺血再灌注3、7、14、21天分別處死大鼠16只,并制備大腦組織切片。應(yīng)用HE染色觀察局灶性腦缺血再灌注后皮質(zhì)及海馬神經(jīng)元的形態(tài)學(xué)改變,采用免疫組化法觀察局灶性腦缺血再灌注后皮質(zhì)及海馬區(qū)Nestin陽性細(xì)胞數(shù)。結(jié)果 HE染色:假手術(shù)組、腺苷預(yù)處理后假手術(shù)組腦組織各層神經(jīng)元排列整齊、規(guī)則,無壞死細(xì)胞。缺血再灌注組缺血再灌注3天,大鼠腦皮質(zhì)及海馬神經(jīng)元排列稀疏,有崩解、丟失現(xiàn)象;缺血再灌注7、14、21天,上述病理變化減緩。腺苷預(yù)處理組在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)較缺血再灌注組腦組織病理改變有明顯改善,尤以7天后改善更明顯。免疫組織化學(xué)染色:假手術(shù)組、腺苷預(yù)處理后假手術(shù)組皮質(zhì)少見Nestin陽性細(xì)胞表達(dá),海馬區(qū)有少量Nestin陽性細(xì)胞表達(dá);缺血再灌注組、腺苷預(yù)處理組Nestin陽性細(xì)胞數(shù)量于再灌注3天開始增加,缺血再灌注組于7天達(dá)高峰,腺苷預(yù)處理組于14天達(dá)高峰,隨后開始逐漸下降;腺苷預(yù)處理組各時(shí)間點(diǎn)皮質(zhì)、海馬區(qū)Nestin陽性細(xì)胞數(shù)量均明顯高于缺血再灌注組(P均<0.05)。結(jié)論 腺苷預(yù)處理能顯著減輕大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷后腦組織神經(jīng)元的損傷程度,可能與其促進(jìn)內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的增殖有關(guān)。

    腦缺血再灌注;腺苷;內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞;大鼠

    缺血性腦血管病是一類常見病、多發(fā)病,腦缺血后神經(jīng)細(xì)胞損傷的不可再生性導(dǎo)致其極高的致殘率與病死率。減輕腦缺血后的神經(jīng)損傷、提高腦組織對缺血的耐受一直是臨床預(yù)防和治療缺血性腦血管病的重點(diǎn)和難點(diǎn)。本研究即探討腺苷預(yù)處理對局灶性腦缺血再灌注大鼠內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)增殖的影響。

    1 材料與方法

    1.1 材料 實(shí)驗(yàn)動物及分組:健康雄性SD大鼠224只,體質(zhì)量250~300 g,由新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供。腺苷注射液(沈陽光大制藥有限公司,批準(zhǔn)文號:國藥準(zhǔn)字H20030320、規(guī)格:6 mg/2 mL),Nestin多克隆抗體、即用型SABC免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司),Nikon MODEL YS100顯微鏡(Nikon),照相顯微鏡HPIAS-2000顯微圖象定量分析系統(tǒng)(鄭州太陽電子科技有限公司)。

    1.2 造模與分組處理 將224只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、腺苷預(yù)處理后假手術(shù)組、缺血再灌注組和腺苷預(yù)處理組,各56只。各組均采用改良尼龍線栓塞法制備大腦中動脈阻塞模型[1,2];阻斷大腦中動脈2 h后,輕輕向外抽拉尼龍線至頸外動脈主干,大腦動脈Willis環(huán)和大腦中動脈已恢復(fù)血供,保持體溫至清醒。假手術(shù)組及腺苷預(yù)處理后假手術(shù)組不插線栓,其余處理同缺血再灌注組和腺苷預(yù)處理組。假手術(shù)組和缺血再灌注組于手術(shù)前3天開始腹腔注射生理鹽水,2 mL/次、1次/d;腺苷預(yù)處理后假手術(shù)組和腺苷預(yù)處理組于手術(shù)前3天開始腹腔注射腺苷注射液,劑量為1.5 mg/kg,生理鹽水稀釋到2 mL,1次/d。大鼠術(shù)后單籠飼養(yǎng),自由飲水和進(jìn)食。

    1.3 相關(guān)指標(biāo)觀察 各組根據(jù)再灌注時(shí)間于缺血再灌注3、7、14、21天分別處死大鼠14只,取出大腦至培養(yǎng)皿中,切取視交叉前后各2 mm厚的腦組織,放入4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.4)中固定24 h,脫水透明,石蠟包埋,20 μm切片,用于HE染色及免疫組化染色。

    1.3.1 皮質(zhì)及海馬區(qū)神經(jīng)元形態(tài)改變 采用HE染色法。將制備好的切片脫蠟、水化,浸入蘇木素染液,淡氨水中返藍(lán),伊紅染液染色3~4 min,脫水、透明、中性樹膠封片,光鏡下觀察。

    1.3.2 皮質(zhì)及海馬區(qū)NSCs增殖情況 采用免疫組化染色法。按照Nestin免疫組化染色試劑盒說明書進(jìn)行,光鏡觀察并應(yīng)用HPIAS-2000顯微圖像處理系統(tǒng)采集圖片,每張切片隨機(jī)取8~10個視野,計(jì)數(shù)Nestin陽性細(xì)胞數(shù),求其平均值為該張切片Nestin陽性細(xì)胞數(shù)。Nestin陽性判斷標(biāo)準(zhǔn):胞質(zhì)呈棕褐色,胞體呈圓形、橢圓形、椎體形和三角形等,排列不規(guī)則,有聚集現(xiàn)象,并可見有深染的1個或多個突起,胞核淡染。

    2 結(jié)果

    2.1 各組皮質(zhì)及海馬區(qū)神經(jīng)元形態(tài)學(xué)變化 假手術(shù)組、腺苷預(yù)處理后假手術(shù)組皮質(zhì)各層神經(jīng)元排列緊密而整齊,結(jié)構(gòu)清晰,胞體飽滿,分布均勻,無數(shù)量減少及異常形態(tài)學(xué)改變,未見到死亡神經(jīng)元;海馬CAI區(qū)錐體細(xì)胞層排列規(guī)則、緊致,細(xì)胞輪廓清楚。缺血再灌注3天,大腦皮質(zhì)、海馬區(qū)神經(jīng)元排列稀松,神經(jīng)組織失去完整結(jié)構(gòu),有細(xì)胞破裂、胞核溶解現(xiàn)象,細(xì)胞周圍高度水腫,梗死周圍有膠質(zhì)細(xì)胞增殖。再灌注7、14、21天上述病理改變趨勢減緩。腺苷預(yù)處理組在相應(yīng)再灌時(shí)間點(diǎn)較缺血再灌注組腦組織病理改變明顯改善,缺血再灌注7天改善尤為明顯。見插頁Ⅲ圖4。

    2.2 各組皮質(zhì)及海馬區(qū)NSCs增殖情況比較 見表1、2。

    表1 各組不同時(shí)間點(diǎn)皮質(zhì)Nestin陽性細(xì)胞數(shù)量比較±s)

    注:與缺血再灌注組比較,▲P<0.05。

    表2 各組不同時(shí)間點(diǎn)海馬區(qū)Nestin陽性細(xì)胞數(shù)量比較±s)

    注:與假手術(shù)組、腺苷預(yù)處理后假手術(shù)組比較,▲P<0.01;與缺血再灌注組比較,★P<0.05。

    3 討論

    腦缺血預(yù)處理(CIP)是指對腦進(jìn)行二次或多次短暫的亞致死性缺血、缺氧或藥物預(yù)處理,調(diào)動機(jī)體組織的自身保護(hù)機(jī)制,達(dá)到減輕腦缺血再灌注損傷的目的,CIP是目前認(rèn)為較為有效地避免腦缺血再灌注損傷的治療方法,在實(shí)際臨床工作中多采用藥物預(yù)處理,目前常用藥物主要有中藥、麻醉藥、鈣離子通道拮抗劑等。研究發(fā)現(xiàn),許多外源性藥物應(yīng)用于腦缺血再灌注時(shí),通過不同途徑刺激內(nèi)源性腺苷的分泌來達(dá)到保護(hù)腦組織的目的[3],因此我們考慮外源性腺苷也可以治療腦缺血再灌注損傷[4~6]。本研究腺苷預(yù)處理組在相應(yīng)再灌時(shí)間點(diǎn)較缺血再灌注組腦組織缺血有明顯改善,缺血再灌注7天改善更明顯,證實(shí)腺苷預(yù)處理可改善大鼠腦缺血再灌注損傷。

    近年研究發(fā)現(xiàn),腦組織受到缺血性損傷時(shí)可以刺激內(nèi)源性NSCs的增殖、分化,從而促進(jìn)神經(jīng)再生和功能的重建[7~9]。然而在這種狀態(tài)下的NSCs增殖能力十分有限,對受損腦組織的功能修復(fù)作用甚微。因此,深入研究腦缺血后NSCs增殖的發(fā)生機(jī)制及影響因素,通過不同途徑和方法促進(jìn)內(nèi)源性NSCs適時(shí)增殖和分化是治療缺血性腦血管病的關(guān)鍵。Nestin是能夠特異性表達(dá)在早期原始神經(jīng)細(xì)胞上的分子標(biāo)記物,在出生后表達(dá)停止,隨著干細(xì)胞分化、成熟,逐漸可以被膠質(zhì)纖維酸性蛋白、神經(jīng)絲蛋白等中間絲蛋白替代[10]。Nestin作為目前識別NSCs的重要標(biāo)志蛋白之一,已被廣泛用于標(biāo)記NSCs。Nestin陽性表達(dá)的細(xì)胞,可看作是NSCs[11~13]。本研究結(jié)果顯示,假手術(shù)組與腺苷預(yù)處理后假手術(shù)組皮質(zhì)未見到Nestin陽性細(xì)胞,海馬區(qū)有少量Nestin陽性細(xì)胞,提示內(nèi)源性NSCs在成年大鼠腦內(nèi)基本處于靜息狀態(tài)。缺血再灌注組腦缺血再灌注后Nestin陽性細(xì)胞表達(dá)有所增加,說明腦損傷后存在內(nèi)源性NSCs增殖。腺苷預(yù)處理組Nestin陽性細(xì)胞明顯多于缺血再灌注組,且隨處理時(shí)間延長表達(dá)增加,峰值出現(xiàn)在缺血再灌注后第14天;第21天Nestin陽性表達(dá)仍高于缺血再灌注組,說明腺苷可促進(jìn)在體NSCs的增殖,并能增強(qiáng)NSCs的增殖能力。其可能的作用機(jī)制:腺苷主要通過4種膜受體發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng),分別為A1、A2a、A2b和A3,A1腺苷受體可在NSCs上表達(dá),其活化也能促進(jìn)NSCs的增殖,活化的A1腺苷受體可能通過激活MEK/ERK和AKt信號通路,促進(jìn)NSCs的增殖[14,15]。

    綜上所述,腺苷預(yù)處理能顯著減輕大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷后腦組織神經(jīng)元的損傷程度,其機(jī)制可能為促進(jìn)局灶性腦缺血損傷后內(nèi)源性NSCs增殖。

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    新鄉(xiāng)市重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目(ZD2011-27)。

    譚軍(E-mail: tanjun1997@126.com)

    10.3969/j.issn.1002-266X.2016.20.011

    R734.3

    A

    1002-266X(2016)20-0033-03

    2015-10-13)

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