EGCG對帕金森病大鼠行為、學習記憶能力的影響及機制

王楠，梁戰(zhàn)華，齊中華

(大連醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院，遼寧大連116600)

EGCG對帕金森病大鼠行為、學習記憶能力的影響及機制

王楠，梁戰(zhàn)華，齊中華

(大連醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院，遼寧大連116600)

目的 觀察表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)對帕金森病(PD)大鼠行為及學習記憶能力的影響，探討其可能的作用機制。方法 將50只Wistar大鼠隨機分為對照組、模型組、左旋多巴組及EGCG低、高劑量組，每組10只。除對照組外，其余各組建立PD模型。模型建立成功后，左旋多巴組給予100 mg/kg左旋多巴灌胃，EGCG低、高劑量組分別給予EGCG 2、6 mg/kg灌胃，對照組及模型組均給予等量蒸餾水灌胃，均1次/d，連續(xù)給藥4周。末次灌胃后，各組均于后頸部皮下注射鹽酸阿撲嗎啡(0.25 mg/kg)，記錄大鼠向右側旋轉的圈數(shù)；采用Morris水迷宮檢測潛伏期；采用Western blotting法檢測紋狀體單胺氧化酶B(MAO-B)和TNF-α表達。結果 與對照組比較，其余各組旋轉圈數(shù)均增加(P均<0.05)；與模型組比較，左旋多巴組、EGCG低及高劑量組旋轉圈數(shù)均減少(P均<0.05)。與對照組比較，其余各組潛伏期均延長(P均<0.05)；與模型組比較，左旋多巴組、EGCG高劑量組潛伏期均縮短(P均<0.05)。與對照組比較，模型組紋狀體MAO-B、TNF-α表達均增高(P均<0.05)；EGCG高、低劑量組紋狀體MAO-B、TNF-α表達較模型組降低(P均<0.05)。結論 EGCG可改善PD大鼠行為及學習記憶能力，其機制可能與下調紋狀體MAO-B和TNF-α表達有關。

帕金森?。槐頉]食子兒茶素沒食子酸酯；單胺氧化酶B；腫瘤壞死因子α

帕金森病(PD)是一種以黑質-紋狀體通路多巴胺能神經(jīng)元退行性病變?yōu)橹饕卣鞯牡诙笊窠?jīng)退行性疾病，以肌肉僵直、靜止震顫、運動遲緩和姿勢反射受損為主要臨床表現(xiàn)，且常伴有認知功能障礙[1,2]；氧化應激在PD多巴胺能神經(jīng)元變性過程中發(fā)揮重要作用。迄今為止，PD的治療均為對癥處理，無法阻止疾病進展。近年研究表明，表沒食子兒

茶素沒食子酸酯(EGCG)具有抗氧化和減少活性氧自由基的作用，低濃度即能發(fā)揮對凋亡神經(jīng)元的保護作用[3,4]，但其對PD的作用未見報道。2015年3～ 8月，本研究觀察了EGCG對PD大鼠行為及學習記憶能力的影響，現(xiàn)分析結果，探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性Wistar大鼠50只，體質量250～300 g，購自上海斯萊克公司。6-羥基多巴胺(6-OHDA)、EGCG、左旋多巴、鹽酸阿撲嗎啡(APO)，美國Sigma公司。BCA試劑盒，上海碧云天生物技術有限公司。兔抗單胺氧化酶B(MAO-B)抗體、小鼠單克隆抗TNF-α抗體，Abcam公司。腦立體定位儀(51600型)，美國Stoelting公司。Morris水迷宮，北京碩林苑生物科技有限公司。

1.2 動物分組及處理 將大鼠隨機分為對照組、模型組、左旋多巴組及EGCG低、高劑量組，每組10只。除對照組外，其余各組參照文獻[5]方法采用戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉建立PD大鼠模型。大鼠固定于腦立體定位儀；依照Paxinos & Watson圖譜確定左側紋狀體坐標點，即前后囟后0.8 mm、中線左側3.0 mm、硬膜下5.0 mm；磨鉆于顱骨上述坐標點打孔，以0.5 μL/min的速度向紋狀體部位緩慢注射20 μg 6-OHDA(溶于3 μL含0.2%維生素C的生理鹽水中)，留針5 min后緩慢退針；縫合頭皮。假手術組只定位打孔，不注射6-OHDA，余操作同其他組。術后2周于后頸部皮下注射APO(0.25 mg/kg)以誘導大鼠對側旋轉行為，大鼠旋轉頻率均達到210圈/30 min，提示PD模型建立成功。模型建立后，左旋多巴組灌胃給予100 mg/kg左旋多巴、EGCG低劑量及高劑量組分別灌胃給予EGCG 2、6 mg/kg，對照組及模型組均灌胃給予蒸餾水，均1次/d，給藥體積均為1 mL/只，均連續(xù)給藥4周。

1.3 相關指標觀察 ①對側旋轉情況：給藥結束后，各組均于后頸部皮下注射APO(0.25 mg/kg)。將大鼠置于一半球形容器中，穩(wěn)定10 min，記錄其向右側旋轉的圈數(shù)，每個360°旋轉計為1圈，共記錄30 min。②定位航行情況：對側旋轉試驗結束后各組大鼠均放于Morris水迷宮中檢測逃避潛伏期[6]，訓練期為2天，2次/d；于第3天開始記錄潛伏期，3次/d，連續(xù)記錄3天(第3、4、5天)。③紋狀體MAO-B、TNF-α表達：采用Western blotting法。完成各項行為學測試后，各組以40 mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，斷頭，取出新鮮腦組織置于冰上，根據(jù)大鼠腦立體定位圖譜，快速取視交叉前部腦組織(紋狀體)，置于1 mL預冷的裂解緩沖液中，制成勻漿。于4 ℃、12 000 g/min離心10 min，取上清，BCA法進行蛋白定量，置-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。取等量蛋白樣?30 μg)加上樣緩沖液混合，于95 ℃金屬浴變性10 min，以SDS-PAGE電泳分離，將目的蛋白轉移至PVDF膜；PVDF膜封閉處理，分別加入MAO-B抗體(1∶2 000)及TNF-α抗體(1∶500)，室溫孵育1.5 h，4 ℃孵育過夜；次日加入二抗，室溫孵育2 h，TBST沖洗3次，ECL發(fā)光。同一樣本重復檢測3次，以條帶灰度值進行統(tǒng)計學分析。

2 結果

2.1 對側旋轉及定位航行情況 與對照組比較，其余各組旋轉圈數(shù)均增加(P均<0.05)；與模型組比較，左旋多巴組、EGCG低及高劑量組旋轉圈數(shù)均減少(P均<0.05)。各組第3、4、5天潛伏期均逐漸縮短；與對照組比較，其余各組潛伏期均延長(P均<0.05)；與模型組比較，左旋多巴組、EGCG高劑量組潛伏期均縮短(P均<0.05)；EGCG低劑量組第3天潛伏期比左旋多巴組延長(P<0.05)。見表1。

表1 各組旋轉圈數(shù)及潛伏期比較±s)

注：與對照組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05；與左旋多巴組比較，△P<0.05。

2.2 紋狀體MAO-B、TNF-α表達 與對照組比較，模型組紋狀體MAO-B、TNF-α表達均升高(P均<0.05)；EGCG低及高劑量組紋狀體MAO-B、TNF-α表達均較模型組降低(P均<0.05)。見表2。

表2 各組紋狀體MAO-B、TNF-α表達比較

注：與對照組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05。

3 討論

茶葉中含有大量茶多酚物質，主要成分是兒茶素類化合物，并以EGCG含量最高，具有抗氧化、抗衰老、神經(jīng)保護、抗腫瘤等作用[7～9]。Guo等[10]研究表明，茶多酚可以通過抗氧化作用保護腦神經(jīng)，抑制PD發(fā)生。Ng等[11]對PD果蠅模型的研究顯示，EGCG可能具有治療PD的作用，并確認了其作用靶點。但國內鮮見EGCG抗PD的相關研究。本研究結果顯示，與模型組比較，左旋多巴組及EGCG低、高劑量組旋轉圈數(shù)均減少。各組第3、4、5天潛伏期均逐漸縮短；左旋多巴組、EGCG高劑量組潛伏期均縮短；EGCG低劑量組第3天潛伏期長于左旋多巴組；EGCG低劑量組與高劑量組旋轉圈數(shù)及潛伏期比較無明顯統(tǒng)計學差異。證實EGCG可改善PD大鼠的行為障礙及增強其學習記憶能力，其作用效果與經(jīng)典抗PD藥左旋多巴相似，即具有明確的抗PD功效，低劑量和高劑量的作用效果均較好。

研究證實，氧化應激在PD病變過程中發(fā)揮重要作用。Guo等[10]研究發(fā)現(xiàn)，茶多酚可降低細胞內活性氧、抑制6-OHDA誘導的NO、神經(jīng)元型一氧化氮合酶及誘導型一氧化氮合酶高表達，進而改善神經(jīng)細胞的高氧化應激狀態(tài)，發(fā)揮神經(jīng)保護作用。MAO-B是多巴胺分解代謝的關鍵酶之一。在PD的發(fā)病過程中MAO-B活性明顯增高，其在氧化分解多巴胺的同時產(chǎn)生一些自由基，引起氧化應激，最終使神經(jīng)元死亡。抑制MAO-B活性可提高腦內多巴胺濃度，同時可延緩神經(jīng)元的變性過程，發(fā)揮神經(jīng)保護作用[12,13]。研究發(fā)現(xiàn)，PD患者及PD動物模型血清TNF-α水平升高，并具有損傷神經(jīng)元的作用[14～19]。本研究結果顯示，模型組紋狀體MAO-B和TNF-α表達明顯高于對照組，而EGCG低劑量及高劑量組明顯低于模型組、其中MAO-B甚至低于對照組；提示EGCG抗PD的作用可能是下調MAO-B和TNF-α，并以下調MAO-B為主。

綜上所述，EGCG可改善PD大鼠模型行為障礙及學習記憶能力下降，下調紋狀體MAO-B和TNF-α表達可能是其作用機制之一。

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遼寧省省直醫(yī)院改革重點臨床科室診療能力建設項目(LNCCC-C06-2015)。

齊中華(E-mail: qzhdl770716@126.com)

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2016-01-07)