LMX1B基因多態(tài)性與兒童原發(fā)性腎病綜合征的相關性分析

于海紹，雷鳳英，陳秀萍，蔣玲，覃遠漢

(廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院，南寧530021)

LMX1B基因多態(tài)性與兒童原發(fā)性腎病綜合征的相關性分析

于海紹，雷鳳英，陳秀萍，蔣玲，覃遠漢

(廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院，南寧530021)

目的 探討LMX1B基因第3外顯子突變及其多態(tài)性與兒童原發(fā)性腎病綜合征(PNS)的相關性。方法 選取PNS患兒94 例(PNS組)，其中糖皮質激素敏感48例、耐藥46例，同期體檢健康兒童60例作為對照組。采用聚合酶鏈反應-DNA直接測序技術觀察兩組LMX1B基因第3外顯子突變情況，并分析其多態(tài)性與PNS的關系。結果 PNS組與對照組LMX1B基因第3外顯子均未發(fā)現(xiàn)突變，僅發(fā)現(xiàn)一個多態(tài)性位點rs2277158，且兩組等位基因頻率及基因型分布比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。PNS組糖皮質激素敏感者與糖皮質激素耐藥者等位基因頻率及基因型分布比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結論 LMX1B基因第3外顯子及rs2277158位點多態(tài)性可能與兒童PNS的發(fā)生無關，其rs2277158位點多態(tài)性與兒童PNS糖皮質質素治療反應也無明確關聯(lián)。

原發(fā)性腎病綜合征；LMX1B基因；單核苷酸多態(tài)性；兒童

原發(fā)性腎病綜合征(PNS)是因腎小球基膜通透性升高，導致血漿內大量蛋白質由尿丟失的臨床綜合征，其病因和發(fā)病機制尚不明確。Podocin是構成濾過隙膜的主要蛋白質，并與Nephrin、CD2AP相互作用[1]。LMX1B基因敲除小鼠會出現(xiàn)腎臟足細胞分化障礙、Podocin和CD2AP表達下調[2]和Col4a3和Col4a4轉錄表達喪失，從而影響構成腎小球基膜的Ⅳ型膠原表達[3]。有文獻報道，LMX1B基因突變導致的指甲髕骨綜合征患者可表現(xiàn)為腎病綜合征，并對激素耐藥[4，5]。PNS患兒LMX1B基因第4外顯子存在突變，且與激素耐藥有關[6]。既往研究發(fā)現(xiàn)，LMX1B基因第3外顯子突變發(fā)生率遠高于第4～6外顯子[4]。因此，我們采用聚合酶鏈反應-DNA直接PCR測序技術檢測PNS患兒LMX1B基因第3外顯子的突變情況，并探討其多態(tài)性與PNS的發(fā)生及糖皮質激素治療反應的關系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 研究對象為2010年1月～2014年2月廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院兒科就診的94例PNS患兒(PNS組)，男72例、女22例，年齡(6.5±3.7)歲。糖皮質激素治療敏感48例，耐藥46例。PNS的診斷標準及糖皮質激素治療反應類型參照中華醫(yī)學會兒科學分會腎臟病學組制定的兒童常見腎臟疾病診治循證指南[7]。 對照組為同期我院體檢健康兒童60例，男40例、女20例，年齡(6.9±3.8)歲。兩組性別、年齡具有可比性。

1.2 LMX1B基因突變及多態(tài)性檢測 抽取兩組外周靜脈血2 mL，置于EDTA抗凝試管中，采用北京康為世紀生物科技有限公司提供的外周血基因組DNA提取試劑盒提取DNA，并于-20 ℃凍存。采用聚合酶鏈反應-DNA直接測序技術對LMX1B基因第3外顯子測序并對其多態(tài)性位點進行基因型分型。聚合酶鏈反應引物序列：F為5′-CAGGTGACTCTAGGCAGGATG-3′，R為5′-CACACAGGTGGACACGTCA-3′。聚合酶鏈反應體系和條件：50 μL PCR反應體系：基因組DNA 100 ng，正、反向引物(20 μmol/L)各1 μL，Mix (RR901大連TaKaRa公司)25 μL，滅菌雙蒸水；反應條件：95 ℃預變性10 min，95 ℃變性30 s，63 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)30次，最后72 ℃延伸10 min。取3 μL PCR產物進行2%瓊脂糖凝膠電泳，100 V電泳30 min，紫外燈下觀察電泳結果，選取明亮特異性條帶進行測序(華大基因生物科技有限公司)。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料采用頻數(shù)或百分率表示，結果比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 LMX1B基因測序結果 兩組均未發(fā)現(xiàn)LMX1B基因第3外顯子存在突變，LMX1B基因rs2277158位點測序結果見插頁Ⅱ圖1。測序圖中純合子呈單峰，雜合子呈雙峰。

2.2 兩組rs2277158位點多態(tài)性分析 兩組LMX1B 基因rs2277158位點基因型分布及等位基因頻率比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。見表1。

表1 兩組rs2277158位點基因型分布及等位基因頻率比較

2.3 激素敏感與耐藥患兒rs2277158位點多態(tài)性分析 激素敏感與激素耐藥患兒rs2277158位點基因型及等位基因頻率比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。見表2。

表2 激素治療敏感與耐藥患兒rs2277158位點基因型分布和等位基因頻率比較

3 討論

LMX1B基因屬于轉錄因子家族，具有LIM-同源區(qū)，LIM區(qū)包括LIM-A和LIM-B，主要參與蛋白間的相互結合，而同源區(qū)主要參與DNA的結合。該基因位于常染色體9q34.1，其長度大約為82 kb，由8個外顯子組成。第3外顯子編碼LIM-B，4～6外顯子則編碼同源區(qū)。LMX1B基因廣泛存在于脊柱動物的胚胎中，并在四肢、腎臟(腎小球)、眼及大腦發(fā)育等過程中發(fā)揮重要作用。

近年來，因LMX1B基因突變可導致腎臟疾病而成為研究熱點[8,9]。LMX1B出現(xiàn)于腎小球足細胞分化開始的S小體期[10]，該基因敲除會導致腎小球足細胞分化障礙或足突消失以及腎小球基膜不規(guī)則增厚[2]。Zhou等[11]研究發(fā)現(xiàn)，LMX1B可以抑制多種促纖維化成分的表達，對腎間質具有保護作用。Bongers等[12]在研究指甲髕骨綜合征患者臨床表型與LMX1B基因突變關系時發(fā)現(xiàn)，基因突變患者中同源區(qū)比LIM區(qū)腎病發(fā)生率高。近期有文獻報道，LMX1B在PNS患兒同源區(qū)中發(fā)生突變，且與激素治療耐藥有關[6]，而LIM-B在已知LMX1B基因突變中占38%，同源區(qū)僅占18%[4]。目前尚無關于PNS患兒LIM-B基因突變的相關報道。研究發(fā)現(xiàn)，LMX1B基因突變會導致指甲髕骨發(fā)育異常、眼部疾病、腎臟損害以及神經系統(tǒng)癥狀[13]；LMX1B基因多態(tài)性與青光眼、自閉癥和精神分裂癥等疾病有關[14～16]，但其與腎臟疾病的關系鮮見報道。本研究對所有PNS患兒進行基因測序并未發(fā)現(xiàn)編碼LIM-B區(qū)的第3外顯子存在突變，提示PNS的發(fā)生可能與LIM-B無關。對該外顯子的多態(tài)性分析發(fā)現(xiàn)，rs2277158位點多態(tài)性在正常人群與PNS患兒中的基因型分布及等位基因頻率無統(tǒng)計學差異，表明該位點多態(tài)性可能與PNS發(fā)病無關。本研究激素治療敏感與耐藥患兒rs2277158位點基因型及等位基因頻率比較無統(tǒng)計學差異，提示該位點多態(tài)性可能與糖皮質激素治療反應無明顯關系。目前，關于LMX1B基因突變導致腎臟疾病的機制尚不清楚，有學者認為是突變導致單體型劑量不足[17]，但也有證據(jù)提示其突變會產生顯性負作用從而導致相關疾病發(fā)生[18]。最近Lemley等[19]研究認為，LMX1B可能通過氨基酸序列和輔助作用因子調控不同靶基因，如R246及后面的氨基酸主要結合足細胞相關調控基因，而L226及之前氨基酸結合骨骼肌調控序列。白麗春等[6]發(fā)現(xiàn)的突變位點位置與此推測一致。因此，本研究在PNS患兒LIM-B區(qū)未發(fā)現(xiàn)突變的原因可能為LIM-B區(qū)不存在與腎臟疾病相關蛋白結合的位點。

本研究對LMX1B基因第3外顯子進行測序分析，未發(fā)現(xiàn)PNS患兒LMX1B基因第3外顯子存在突變，其LMX1B基因rs2277158位點多態(tài)性可能與兒童PNS的發(fā)生及其對糖皮質激素的治療反應無關。由于本研究樣本量較少，并且選取了LMX1B基因上的一個外顯子進行測序分析，因而無法確定該基因其他外顯子上是否存在突變，也無法確定該多態(tài)性位點與其他外顯子多態(tài)性所構成的單體型與PNS的發(fā)生及糖皮質激素治療反應的相關性?？傊?，LMX1B基因與兒童PNS 的相關性尚需進一步深入研究。

[1] Schwarz K, Simons M, Reiser J, et al. Podocin, a raft-associated component of the glomerular slit diaphragm, interacts with CD2AP and nephrin[J]. J Clin Invest, 2001,108(11):1621-1629.

[2] Miner JH, Morello R, Andrews KL, et al. Transcriptional induction of slit diaphragm genes by Lmx1b is required in podocyte differentiation[J]. J Clin Invest, 2002,109(8):1065-1072.

[3] Massella L, Gangemi C, Giannakakis K, et al. Prognostic value of glomerular collagen IV immunofluorescence studies in male patients with X-linked Alport syndrome[J]. Clin J Am Soc Nephrol, 2013,8(5):749-755.

[4] Marini M, Bocciardi R, Gimelli S, et al. A spectrum of LMX1B mutations in Nail-Patella syndrome: new point mutations, deletion, and evidence of mosaicism in unaffected parents[J]. Genet Med, 2010,12(7):431-439.

[5] Hari P, Mantan M, Dinda A, et al. Steroid-responsive nephrotic syndrome in a patient with nail-patella syndrome[J]. Pediatr Nephrol, 2006,21(8):1197-1199.

[6] 白麗春,覃遠漢,黃韋芳,等.LMX1B基因突變檢測對激素耐藥型腎病綜合征患兒的早期診斷價值[J].山東醫(yī)藥,2015,55(12):21-23.

[7] 中華醫(yī)學會兒科學分會腎臟病學組.兒童常見腎臟疾病診治循證指南(一):激素敏感、復發(fā)/依賴腎病綜合征診治循證指南(試行)[J].中華兒科雜志, 2009,47(3):167-170.

[8] Zhang LW, Wang LP. Recent advances in the research on mechanisms underlying podocyte-specific gene mutation-related steroid-resistant nephrotic syndrome[J]. Zhongguo Dang Dai Er Ke Za Zhi, 2014,16(1):99-102.

[9] Kopp JB. An expanding universe of FSGS genes and phenotypes: LMX1B mutations cause familial autosomal dominant FSGS lacking extrarenal manifestations[J]. J Am Soc Nephrol, 2013,24(8):1183-1185.

[10] Little MH, McMahon AP. Mammalian kidney development: principles, progress, and projections[J]. Cold Spring Harb Perspect Biol, 2012,4(5):a008300.

[11] Zhou TB, Ou C, Qin YH, et al. LIM homeobox transcription factor 1B expression affects renal interstitial fibrosis and apoptosis in unilateral ureteral obstructed rats[J]. Am J Physiol Renal Physiol, 2014,306(12):1477-1488.

[12] Bongers EM, Huysmans FT, Levtchenko E, et al. Genotype-phenotype studies in nail-patella syndrome show that LMX1B mutation location is involved in the risk of developing nephropathy[J]. Eur J Hum Genet, 2005,13(8):935-946.

[13] Ghoumid J, Petit F, Holder-Espinasse M, et al. Nail-Patella Syndrome: clinical and molecular data in 55 families raising the hypothesis of a genetic heterogeneity[J]. Eur J Hum Genet, 2016,24(1):44-50.

[14] Thanseem I, Nakamura K, Anitha A, et al. Association of transcription factor gene LMX1B with autism[J]. PLoS One, 2011,6(8):e23738.

[15] Bergman O, Westberg L, Nilsson LG, et al. Preliminary evidence that polymorphisms in dopamine-related transcription factors LMX1A, LMX1B and PITX3 are associated with schizophrenia[J]. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry, 2010,34(6):1094-1097.

[16] Park S, Jamshidi Y, Vaideanu D, et al. Genetic risk for primary open-angle glaucoma determined by LMX1B haplotypes[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci, 2009,50(4):1522-1530.

[17] Bongers EM, de Wijs IJ, Marcelis C, et al. Identification of entire LMX1B gene deletions in nail patella syndrome: evidence for haploinsufficiency as the main pathogenic mechanism underlying dominant inheritance in man[J]. Eur J Hum Genet, 2008,16(10):1240-1244.

[18] Cross SH, Macalinao DG, McKie L, et al. A dominant-negative mutation of mouse Lmx1b causes glaucoma and is semi-lethal via LBD1-mediated dimerisation[J]. PLoS Genet, 2014,10(5):e1004359.

[19] Lemley KV. LMX1B mutations with nails and kneecaps: a new paradigm[J]. Nephrol Dial Transplant, 2014,29(1):9-12.

Association of LMX1B gene with primary nephritic syndrome in children

YUHaishao,LEIFengying,CHENXiuping,JIANGLing,QINYuanhan

(TheFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China)

Objective To investigate the associations between gene mutations and the polymorphisms in exon 3 of LIM homeobox transcription factor 1-beta (LMX1B) and primary nephritic syndrome (PNS) in children. Methods We studied 94 children with PNS (PNS group, 48 with glucocorticoid-sensitive, 46 with glucocorticoid-resistant) and 60 healthy controls (control group) to observe the genetic mutations in exon 3 of LMX1B gene and analyze the associations between the polymorphisms and PNS in the two groups by PCR-DNA direct sequencing. Results No gene mutations of the LMX1B gene but rs2277158 polymorphism and no significant difference either in genotypic or allelic frequencies of rs2277158 polymorphism were observed between PNS group and the control group (allP>0.05). Allele frequency and genotype distribution also showed no significant difference between the glucocorticoid-sensitive group and the glucocorticoid-resistant group (P>0.05). Conclusions There is no clear association between gene mutations and rs2277158 polymorphism in exon 3 of LMX1B gene and the risk for PNS in children. Rs2277158 polymorphism may not be associated with glucocorticoid treatment response in children with PNS.

primary nephritic syndrome; LMX1B gene; single nucleotide polymorphism; child

廣西科學研究與技術開發(fā)計劃課題資助項目(桂科攻1140003A-6)。

于海紹(1988-)，男，碩士研究生，主要研究方向為小兒腎臟病基礎與臨床。E-mail： yhsgxykdx@163.com

覃遠漢(1964-)，男，主任醫(yī)師，主要研究方向為小兒腎臟病基礎與臨床。E-mail: qinyuanhan603@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.20.005

R692

A

1002-266X(2016)20-0015-03

2015-11-11)