口腔扁平苔蘚患者血清差異蛋白表達(dá)檢測及意義

劉健，劉鐵軍，安欣，李昆珊，賈楠，許彥枝

(河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院，石家莊050011)

口腔扁平苔蘚患者血清差異蛋白表達(dá)檢測及意義

劉健，劉鐵軍，安欣，李昆珊，賈楠，許彥枝

(河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院，石家莊050011)

目的 探討口腔扁平苔蘚(OLP)患者血清差異蛋白表達(dá)及意義。方法 選擇6例OLP患者(觀察組)和6例健康志愿者(對照組)，抽取空腹靜脈血后采用苯酚抽提法提取血清蛋白，Bradford法測定蛋白含量，雙向熒光差異凝膠電泳法分離檢測差異蛋白點(diǎn)，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)鑒定差異蛋白。選擇其中研究較少的蛋白，采用Western blotting法檢測兩組蛋白相對表達(dá)量。結(jié)果 兩組血清差異蛋白點(diǎn)(583±183)個(gè)，其中重復(fù)性好的蛋白差異點(diǎn)20個(gè)，質(zhì)譜分析蛋白序列鑒定出12種蛋白質(zhì)。12種蛋白質(zhì)中，7種(補(bǔ)體C3、激肽原、α-2-巨球蛋白、人抗凝血酶Ⅲ、分泌型IgA、補(bǔ)體C9、β-1-金屬結(jié)合球蛋白)在觀察組血清中表達(dá)降低，5種(結(jié)合珠蛋白、銅藍(lán)蛋白、載脂蛋白AⅠ、維生素D、人類因子B)表達(dá)升高。觀察組血清補(bǔ)體C3和人抗凝血酶Ⅲ蛋白相對表達(dá)量均低于對照組，載脂蛋白AⅠ高于對照組(P均<0.01)。結(jié)論 OLP患者血清中存在12種差異蛋白質(zhì)，血清補(bǔ)體C3和人抗凝血酶Ⅲ蛋白表達(dá)均降低，載脂蛋白AⅠ表達(dá)升高，其發(fā)病可能與免疫功能降低及感染有關(guān)。

口腔扁平苔蘚；雙向熒光差異凝膠電泳；蛋白質(zhì)組；補(bǔ)體C3；載脂蛋白AⅠ；人抗凝血酶Ⅲ

蛋白質(zhì)組學(xué)是以一個(gè)生物體內(nèi)基因編碼的所有蛋白質(zhì)作為研究對象，對蛋白的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行研究，以篩選與疾病有關(guān)的特異性生物標(biāo)記物，有助于探索發(fā)病機(jī)制與治療靶點(diǎn)[1，2]。雙向凝膠電泳是最主要的蛋白質(zhì)分離方法，但是不同電泳圖譜間的差異對結(jié)果分析有很大影響。雙向熒光差異凝膠電泳(2-D DIGE)可檢測到蛋白樣品間微小表達(dá)差異，具有更高的靈敏性、重復(fù)性、準(zhǔn)確性[3～6]。目前2-D DIGE技術(shù)已廣泛應(yīng)用于國內(nèi)外醫(yī)學(xué)研究，對于鑒定與癌癥相關(guān)的分子標(biāo)記物具有重要意義[7]。口腔扁平苔蘚(OLP)是一種有癌變傾向的口腔黏膜疾病，其發(fā)病機(jī)制不明。本研究采用2-D DIGE法及質(zhì)譜技術(shù)篩選并鑒定與OLP發(fā)病有關(guān)的差異蛋白，為探討其在OLP發(fā)生、發(fā)展過程中作用機(jī)制提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2011年9月～2013年12月我院收治的OLP患者6例(觀察組)，均為女性，年齡50～60歲、平均55歲；患者均經(jīng)臨床及病理確診，均未經(jīng)系統(tǒng)治療，病變主要位于兩頰及前庭溝黏膜，以白色病變?yōu)橹?，無全身系統(tǒng)疾病。選擇同期與觀察組性別、年齡匹配的健康志愿者6例(對照組)，口腔內(nèi)無黏膜病變，無中、重度牙周炎，入組前3個(gè)月內(nèi)無用藥史。本研究通過醫(yī)院倫理委員會審查，研究對象均知情同意。

1.2 血清差異蛋白檢測及鑒定

1.2.1 標(biāo)本采集及血清蛋白提取 抽取兩組清晨空腹靜脈血3 mL，4 ℃條件下2 000 r/min離心15 min，取上清液分裝于1.5 mL離心管中，-80 ℃冰箱保存待用。選擇苯酚抽提法提取血清蛋白：將血清置于冰上融化解凍，加入水飽和苯酚沉淀蛋白，再加入緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl，pH=8.0)及甲醇去除血清中的雜質(zhì)及苯酚，得到蛋白沉淀，最后用DIGE buffer復(fù)溶蛋白。采用Bradford法[8]測定蛋白含量。

1.2.2 差異蛋白檢測 采用2-D DIGE法。將符合標(biāo)準(zhǔn)的蛋白進(jìn)行十二烷磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，檢測各樣品蛋白重復(fù)性及蛋白降解情況。將兩組樣品隨機(jī)配成6對，每個(gè)樣品取50 μg蛋白并用Cydye標(biāo)記(3對用Cy3標(biāo)記，3對用Cy5標(biāo)記，正反標(biāo)標(biāo)記可得出的同一位置重復(fù)性高的差異點(diǎn))。蛋白和熒光染料在冰上避光孵育2 h，加入1 μL Lysine(10 mmol/L)中止反應(yīng)，每個(gè)樣品再補(bǔ)充50 μg蛋白(每個(gè)樣品共上樣100 μg)。將每對樣品混合，加入2-D DIGE buffer，采用24 cm、pH值為4～7的IPG膠條進(jìn)行等電聚焦電泳(IEF)。電泳條件：水化2 h，50 V、10 h，500 V、1 h，1 000 V、1 h，8 000 V、1 h，10 000 V、10 h，至最終伏小時(shí)數(shù)≥80 000時(shí)終止電泳(此時(shí)電流應(yīng)<50 μA)。IEF結(jié)束后，IPG膠條先后在含有1% DTT和4% IAA的平衡液中各自平衡15 min，然后進(jìn)行SDS-PAGE。于50 V條件下緩慢電泳2 h，待樣品進(jìn)入分離膠后，將電壓升至100 V過夜(操作及電泳過程中應(yīng)注意避光)，至溴酚藍(lán)的前沿到達(dá)膠的下沿時(shí)結(jié)束電泳。采用Typhoon 9410掃描儀對2-D DIGE蛋白膠進(jìn)行掃描，建立彩色圖譜，Deep Purple染色。選取背景較為清晰、重復(fù)性好的蛋白膠，采用DeCyderTM6.5差異分析軟件搜索差異點(diǎn),將差異表達(dá)量>1.2倍的蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)記。生成挖點(diǎn)坐標(biāo)文件，導(dǎo)出后用Ettan spot picker挖點(diǎn)。

1.2.3 差異蛋白鑒定 采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)。對挖出的蛋白膠粒進(jìn)行脫色、清洗、凍干，加入Trypsin溶液酶解，LTQ XL質(zhì)譜儀鑒定。采用Bioworks Browser3.3.1軟件，通過ESQUEST運(yùn)算方法，在蛋白數(shù)據(jù)庫(NCBI中的human fasta數(shù)據(jù)2013.12.10)搜索差異蛋白的酶解肽段，確定被測差異蛋白的名稱。

1.2.4 差異蛋白相對表達(dá)量檢測 采用Western blotting法。選擇研究較少的差異蛋白(補(bǔ)體C3、人抗凝血酶Ⅲ及載脂蛋白AⅠ)，參照上法采用SDS-PAGE技術(shù)分別提取兩組血清蛋白樣品，常規(guī)恒流電泳，電轉(zhuǎn)于硝基纖維素膜上，將膜置于封閉液中室溫封閉90 min，加入所檢測差異蛋白一抗(1∶10 000)，4 ℃孵育過夜。次日PBST洗膜3次×10 min，加入二抗羊抗兔IgG(1∶10 000)孵育2 h，PBST洗膜4次×10 min，然后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。將化學(xué)發(fā)光試劑與膜蛋白充分接觸，1 min后在Alpha innotech上掃描，曝光0.5～1 min。采用Image J軟件檢測差異蛋白圖像灰度值，計(jì)算差異蛋白相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 差異蛋白檢測與結(jié)果鑒定 SDS-PAGE顯示各樣品條帶清晰，兩組間蛋白條帶重復(fù)性較好，無明顯蛋白丟失現(xiàn)象。2-D DIGE檢測出差異蛋白點(diǎn)(583±183)個(gè)，其中重復(fù)性好的蛋白差異點(diǎn)20個(gè)，質(zhì)譜分析蛋白序列鑒定出12種差異蛋白質(zhì)，見插頁Ⅱ圖2。12種蛋白質(zhì)中，7種(補(bǔ)體C3、激肽原、α-2-巨球蛋白、人抗凝血酶Ⅲ、分泌型IgA、補(bǔ)體C9、β-1-金屬結(jié)合球蛋白)在觀察組血清中表達(dá)降低，5種(結(jié)合珠蛋白、銅藍(lán)蛋白、載脂蛋白AⅠ、維生素D、人類因子B)表達(dá)升高，見表1。

表1 觀察組血清中12種差異蛋白質(zhì)鑒定結(jié)果

2.2 兩組血清補(bǔ)體C3、人抗凝血酶Ⅲ及載脂蛋白AⅠ蛋白相對表達(dá)量比較 觀察組血清補(bǔ)體C3和人抗凝血酶Ⅲ蛋白相對表達(dá)量均低于對照組，載脂蛋白AⅠ高于對照組(P均<0.01)，見表2。

表2 兩組血清補(bǔ)體C3、人抗凝血酶Ⅲ及載脂蛋白AⅠ蛋白相對表達(dá)量比較

注：與對照組比較，*P<0.01。

3 討論

OLP是一種多因素相互作用的慢性口腔黏膜疾病，與多基因改變的級聯(lián)反應(yīng)有關(guān)，發(fā)病原因及機(jī)制不詳[9～13]。前期研究中，我們應(yīng)用基因芯片技術(shù)篩選出與OLP相關(guān)的差異表達(dá)基因，并分析其機(jī)制可能與感染、氨基酸代謝等8條通路有關(guān)，但無法全面了解基因轉(zhuǎn)錄，以及合成蛋白質(zhì)后疾病發(fā)生、進(jìn)展的機(jī)制[14]。王文梅等[15]采用蛋白質(zhì)組學(xué)傳統(tǒng)雙向電泳-質(zhì)譜分析技術(shù)建立OLP組織與口腔正常黏膜組織的蛋白表達(dá)譜，對OLP患者在雙向電泳圖譜中具有高表達(dá)差異的10個(gè)蛋白點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜分析，發(fā)現(xiàn)了錳超氧化物歧化酶、膜聯(lián)蛋白Ⅰ等差異表達(dá)蛋白。蔣紅柳等[16]采用雙向電泳技術(shù)發(fā)現(xiàn)了OLP 患者經(jīng)羥氯喹治療前后血清中的9個(gè)差異蛋白，為研究藥物靶向治療和細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑奠定基礎(chǔ)。本研究應(yīng)用2-D DIGE法篩選出OLP患者血清中的差異蛋白，并通過質(zhì)譜分析蛋白序列鑒定出12種蛋白質(zhì)；其中血清補(bǔ)體C3、載脂蛋白AⅠ、人抗凝血酶Ⅲ在OLP中的研究較少，對其蛋白表達(dá)進(jìn)行免疫印跡法鑒定，發(fā)現(xiàn)與蛋白質(zhì)組學(xué)檢測結(jié)果一致。

補(bǔ)體系統(tǒng)廣泛參與機(jī)體防御外來病原體的入侵以及免疫調(diào)節(jié)，補(bǔ)體C3是血清中含量最高的補(bǔ)體成分。替代激活途徑是直接由C3開始的補(bǔ)體激活途徑，其激活物質(zhì)并非抗原抗體復(fù)合物，而是細(xì)菌的細(xì)胞壁成分——脂多糖，以及多糖、肽聚糖、磷壁酸等物質(zhì)。替代激活途徑在細(xì)菌性感染早期尚未產(chǎn)生特異性抗體時(shí)即可發(fā)揮重要的抗感染作用。呂邦泰等[17]、王紅權(quán)等[18]研究分別發(fā)現(xiàn)，慢性乙肝、變應(yīng)性鼻炎患者血清補(bǔ)體C3水平降低，說明補(bǔ)體C3在機(jī)體抗感染和免疫調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮了重要作用。本研究也證實(shí)血清補(bǔ)體C3是OLP患者的血清差異蛋白，患者血清補(bǔ)體C3表達(dá)下調(diào)，說明OLP的發(fā)病過程可能與感染、免疫功能降低有關(guān)。

血漿脂蛋白中的蛋白部分主要分為A、B、C、D、E五類，載脂蛋白A又可分為Ⅰ～Ⅴ五類。李曉峰等[19]研究發(fā)現(xiàn)，惡性腫瘤患者血清載脂蛋白AⅠ表達(dá)紊亂。黃雪強(qiáng)等[20]研究發(fā)現(xiàn)，膀胱癌患者尿載脂蛋白AⅠ表達(dá)明顯高于健康對照組。研究顯示，慢性乙肝患者血清載脂蛋白AⅠ表達(dá)與正常人存在差異，部分正常人接種乙肝疫苗后口腔黏膜出現(xiàn)苔蘚樣改變[21，22]。本研究結(jié)果表明，OLP患者血清載脂蛋白AⅠ表達(dá)升高，推測其發(fā)病可能與乙肝病毒的感染及載脂蛋白AⅠ的異常表達(dá)有關(guān)。

人抗凝血酶Ⅲ是活性凝血因子中最重要的阻礙因子，參與血液凝固、纖維蛋白溶解過程，在彌散性血管內(nèi)凝血、肝臟疾病、腎病綜合征患者血清中表達(dá)均降低。本研究中，OLP患者血清人抗凝血酶Ⅲ表達(dá)降低，但變化幅度小于其他差異蛋白，未來需加大樣本量進(jìn)行驗(yàn)證，以明確人抗凝血酶Ⅲ是否可作為監(jiān)測OLP病情的指標(biāo)之一。

綜上所述，OLP患者血清中存在12種差異蛋白質(zhì)，血清補(bǔ)體C3、人抗凝血酶Ⅲ表達(dá)均降低，載脂蛋白AⅠ表達(dá)升高，其發(fā)病可能與免疫、感染有關(guān)。本研究將進(jìn)一步探索OLP患者蛋白水平變化的作用機(jī)制，為該病的臨床藥物治療提供依據(jù)。

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Detections of differentially expressed serum proteins in patients with oral lichen planus and the significance

LIUJian,LIUTiejun,ANXin，LIKunshan,JIANan,XUYanzhi

(TheForthHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050011,China)

Objective To detect the differentially expressed serum proteins in patients with oral lichen planus (OLP) and explore their significance. Methods Six OLP patients (observation group) and the matched health adults (control group) were selected and we drew their venous blood. Serum proteins were extracted by phenol extraction. The protein concentration was determined by Bradford method. Serum proteins were separated by two-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis (2-D DIGE), the differential proteins were identified by mess spectrometry and the expression of the proteins was detected by Western blotting in the two groups. Results In average, the number of differential protein spots was (583±183), during which, 12 highly reproducible spots were selected for mass spectrometry identification. Of these 12 protein spots, the expression of seven proteins, including serum complement C3, kininogen, α-2-macroglobulin, human antithrombin Ⅲ, secretory IgA, complement C9and β-1-metal binding globulin (SHBG), was decreased in the observation group, the expression of five proteins including haptoglobin, ceruloplasmin, apolipoprotein A-Ⅰ, vitamin D and human factor B was increased in the observation group. Compared with the control group, the expression of serum complement C3and human antithrombin Ⅲ was lower, and the expression of apolipoprotein A-Ⅰwas higher in the observation group (allP<0.01). Conclusion There are 12 differential proteins in serum of OLP patients and the expression of serum complement C3and human antithrombin Ⅲ is lower which shows that the development of OLP may be associated with immune and infection.

oral lichen planus; two-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis; proteomics; serum complement C3; apolipoprotein AⅠ; human antithrombin Ⅲ

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81273813)。

劉健(1975-)，女，副教授，研究方向?yàn)榭谇火つげ〖把乐懿〉闹形麽t(yī)結(jié)合治療。E-mail： zjh888fff@163.com

許彥枝(1954-)，女，教授，研究方向?yàn)榭谇火つげ〖把乐懿〉闹形麽t(yī)結(jié)合治療。E-mail： xu_yanzhi@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.16.004

R781.5

A

1002-266X(2016)16-0011-04

2015-11-10)