β-谷甾醇對(duì)人肺癌A549細(xì)胞增殖及凋亡的影響*

周玲玉，徐 彩，王樂琴，魏思宇，盧 蕾，練雪梅

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生與管理學(xué)院,營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)教研室,重慶 400016；

2.重慶醫(yī)科大學(xué)脂質(zhì)研究中心,重慶 400016)

·論 著·

β-谷甾醇對(duì)人肺癌A549細(xì)胞增殖及凋亡的影響*

周玲玉1,2，徐 彩1,2，王樂琴1,2，魏思宇1，2，盧 蕾1，2，練雪梅△

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生與管理學(xué)院,營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)教研室,重慶 400016；

2.重慶醫(yī)科大學(xué)脂質(zhì)研究中心,重慶 400016)

目的 研究β-谷甾醇對(duì)A549細(xì)胞是否具有潛在的抗增殖和誘導(dǎo)凋亡作用。方法 不同濃度β-谷甾醇處理人肺癌A549細(xì)胞24h后，采用CCK-8法檢測細(xì)胞的增殖抑制作用；流式細(xì)胞術(shù)檢測A549 細(xì)胞周期分布及凋亡率的變化。結(jié)果 β-谷甾醇以劑量依賴性方式明顯抑制A549細(xì)胞的生長；流式結(jié)果表明β-谷甾醇使A549 細(xì)胞阻滯在G2/M 期，同時(shí)促使A549細(xì)胞凋亡率的增加。結(jié)論 β-谷甾醇可誘導(dǎo)人肺腺癌A549細(xì)胞G2/M期細(xì)胞周期阻滯，并引起細(xì)胞凋亡性死亡。

β-谷甾醇； 肺癌； A549； 細(xì)胞周期； 細(xì)胞凋亡

肺癌是嚴(yán)重威脅人類生命健康的疾病，最新統(tǒng)計(jì)資料顯示，肺癌是引起全球癌癥死亡的首要原因[1-2]，其中非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)，包括腺癌、鱗狀細(xì)胞癌和大細(xì)胞癌，占所有肺癌的80%[3]。肺癌已成為我國增幅最快、最常見的惡性腫瘤，中國癌癥控制計(jì)劃已將肺癌的防治列為重點(diǎn)。盡管目前治療方法較多，但肺癌的治療效果卻始終令人不滿意，其5年生存率仍然較低[4]。更多的治療方法正在被探索之中，以便提高肺癌5年生存率和治療效果。目前通過蔬菜、水果、香料、茶葉、草本植物和藥用植物中的植物化學(xué)物來控制癌癥的發(fā)生發(fā)展已經(jīng)成為最可行的方法。植物化學(xué)物是植物次生代謝物，由于它對(duì)慢性疾病包括癌癥有潛在的預(yù)防作用而受到廣泛關(guān)注。植物甾醇是一種與膽固醇結(jié)構(gòu)相似的植物化學(xué)物，能夠取代腸道低密度脂蛋白(LDL)膽固醇。堅(jiān)果、花生、芝麻、大豆、未精煉的植物油和谷物都是植物甾醇的豐富來源[5]。常見的膳食植物甾醇有β-谷甾醇、菜油甾醇、豆甾醇，分別占50%～65%、10%～40% 和0%～35%。

研究顯示，β-谷甾醇攝入量的多少與許多人類慢性病的發(fā)生率有關(guān)。目前研究證明，β-谷甾醇在降低血液膽甾醇含量、抑制腫瘤、防治前列腺肥大、抑制乳腺增生和調(diào)節(jié)免疫方面都有重要作用[6]。大量研究表明，β-谷甾醇作為潛在的天然藥物，能有效預(yù)防多種腫瘤的發(fā)生和生長，以往的研究主要集中于β-谷甾醇抗乳腺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌等方面，但對(duì)肺癌作用的報(bào)道很少，故本研究以人肺癌A549細(xì)胞為研究對(duì)象，對(duì)β-谷甾醇抗肺癌作用進(jìn)行了初步探討。

1 資料與方法

1.1 一般資料 人肺腺癌細(xì)胞株A549購于ATCC。

1.2 儀器與試劑 酶標(biāo)儀(HIMFD，Gene Company Limited)；超凈工作臺(tái)(SW-CJ-2F，蘇州工業(yè)園三興凈化技術(shù)有限公司)；CO2恒溫培養(yǎng)箱(Eppendorf，CO170S-230-0000)；倒置熒光顯微鏡(leica，DMI-4000B)；生物安全柜(CMC，1384)。β-谷甾醇(Sigma，S9889-10 mg)；RPMI 1640(Hyclone，SH3080001B)；PBS磷酸鹽緩沖液(Hyclone，SH3025601B)；青鏈霉素混合液(Hyclone，CC0113)；二甲基亞砜DMSO(sigma,D2650)；小牛血清(GIBCO，16010-159)；0.25%胰蛋白酶(Hyclone，SH30042.01)；Cell Counting Kit-8(日本同仁化學(xué)，CK04)；RT-PCR引物序列(華大科技)。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) A549細(xì)胞系培養(yǎng)于含10%小牛血清、1%雙抗(青霉素100 U/mL，鏈霉素100 μg/mL)的RPMI 1640 培養(yǎng)基中，在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞呈貼壁生長，3～4d傳代，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 細(xì)胞毒性檢測 細(xì)胞毒性效應(yīng)用CCK-8試劑盒檢測。取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，加細(xì)胞懸液(1×105cell/mL)100 μL每孔至96孔板(邊緣用滅菌PBS填充)，每組設(shè)置6個(gè)副孔。培養(yǎng)過夜，更換無血清培養(yǎng)基。饑餓12 h之后更換含β-谷甾醇(0、5、10、20、40 μmol/L)的培養(yǎng)基，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組，培養(yǎng)24 h。每孔加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃培養(yǎng)1～4 h，酶標(biāo)儀測定450 nm波長各孔的吸光度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。細(xì)胞活力%=(實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值)/(對(duì)照組OD值-空白組OD值)×100%。

1.3.3 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率 取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，加細(xì)胞懸液(2×105cell/mL)1 mL每孔至6孔板，每組設(shè)置3個(gè)副孔，培養(yǎng)過夜，更換無血清培養(yǎng)基。饑餓12 h之后，用不同濃度β-谷甾醇(0、2.5、10、40 μM)處理24 h。細(xì)胞用不含EDTA的胰酶消化后，用PBS洗滌2遍，1 000 r/min離心5 min，加1 mL PBS重懸送流式細(xì)胞室進(jìn)行細(xì)胞凋亡率檢測。

1.3.4 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期 取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，加細(xì)胞懸液(2×105cell/mL)1 mL每孔至6孔板，每組設(shè)置3個(gè)副孔，培養(yǎng)過夜，更換無血清培養(yǎng)基。饑餓12 h之后，用不同濃度β-谷甾醇(0、2.5、10、40 μM)處理24 h。細(xì)胞用胰蛋白酶消化之后，再用預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞兩次，加1 mL -20 ℃ 70%的乙醇溶液重懸，4 ℃固定過夜。后送流式細(xì)胞室進(jìn)行細(xì)胞周期檢測。

2 結(jié) 果

2.1 β-谷甾醇對(duì)A549細(xì)胞毒性的影響 CCK-8試劑盒檢測A549細(xì)胞活性。β-谷甾醇處理A549細(xì)胞24 h后，顯著抑制細(xì)胞增殖，且隨著藥物濃度的增加，其抑制作用逐步增強(qiáng)，呈明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。與對(duì)照組相比，β-谷甾醇在5、10、20、40 μM劑量作用下的細(xì)胞活力分別為(67.82±5.43)%、(53.87±8.46)%、(50.03±3.26)%和(36.96±6.53)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖1。

*：P<0.05，**：P<0.01，與對(duì)照組比較。

圖1 β-谷甾醇對(duì)A549細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用

2.2 β-谷甾醇對(duì)A549細(xì)胞周期的影響 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，2.5、10、40 μM β-谷甾醇實(shí)驗(yàn)組處理A549細(xì)胞24 h后，G2/M期細(xì)胞比例由對(duì)照組的(4.41±1.21)%增加至(5.58±2.30)%、(5.58±2.09)%、(9.60±1.74)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)果說明β-谷甾醇誘導(dǎo)G2/M期細(xì)胞周期的阻滯，見圖2。

2.3 β-谷甾醇對(duì)A549細(xì)胞凋亡的影響 流式Annexin-V/PI雙染檢測細(xì)胞凋亡率，結(jié)果如圖3所示，0、2.5、10、40 μM β-谷甾醇實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率分別為(13.61±2.29)%、(16.15±3.02)%、(26.04±2.18)%、(49.72±1.83)%，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。因此，β-谷甾醇可誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡且呈濃度依賴性。

圖2 β-谷甾醇對(duì)A549細(xì)胞周期的作用

圖3 β-谷甾醇對(duì)A549細(xì)胞凋亡的作用

3 討 論

β-谷甾醇抗癌作用的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，含有2%混合植物甾醇的飲食能抑制癌細(xì)胞的生長，減少腫瘤的大小，并降低結(jié)腸癌、乳腺癌、肝癌的發(fā)病率[7-10]。體外研究結(jié)果還表明，植物固醇，尤其是β-谷甾醇，對(duì)乳腺癌、結(jié)腸癌、肝癌、骨髓瘤和胰腺癌等均有抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡的作用[11-16]。細(xì)胞周期調(diào)控異常和細(xì)胞凋亡是腫瘤生長不受控制及惡性轉(zhuǎn)化的主要原因。β-谷甾醇對(duì)肺癌細(xì)胞的作用目前尚未見研究報(bào)道，故本文初步研究了β-谷甾醇對(duì)人肺癌細(xì)胞A549細(xì)胞增殖和凋亡的影響。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同濃度β-谷甾醇處理人肺癌A549細(xì)胞，細(xì)胞活性隨藥物濃度增加逐漸降低，從(67.82±5.43)%降至(36.96±6.53)%，表明β-谷甾醇對(duì)A549細(xì)胞具有明顯的生長抑制作用，且呈顯著的劑量依賴性。誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞周期阻滯以及引起細(xì)胞凋亡是天然藥物抗腫瘤活性的重要機(jī)制[17]。細(xì)胞周期中G1/S、G2/M、M 中后期在調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)展中發(fā)揮重要作用,其中G2/M期能防止受損或未完成復(fù)制的DNA 進(jìn)入有絲分裂，并停留在G2期來修復(fù)DNA，故G2/M 期阻滯對(duì)腫瘤細(xì)胞顯得尤為重要[18]。有研究發(fā)現(xiàn)，β-谷甾醇可誘導(dǎo)結(jié)腸癌、白血病、肝癌等腫瘤細(xì)胞發(fā)生G2/M期細(xì)胞周期的阻滯[19-21]。本研究流式細(xì)胞周期分析表明，在β-谷甾醇作用24 h后，G2/M期細(xì)胞百分比從(4.41±1.21)%增加到(9.6±1.74)%，說明A549細(xì)胞在G2/M期發(fā)生了阻滯。提示β-谷甾醇可通過誘導(dǎo)A549細(xì)胞周期阻滯從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。

β-谷甾醇不僅能促使腫瘤細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞周期阻滯，亦能誘導(dǎo)細(xì)胞程序性死亡，即細(xì)胞凋亡(APO)，它是多細(xì)胞生物體維持組織完整性和功能，以及消除受損或不需要細(xì)胞的一個(gè)關(guān)鍵作用機(jī)制[22]。癌細(xì)胞凋亡作為一種潛在的治療靶點(diǎn)近年來受到關(guān)注。癌細(xì)胞逃避細(xì)胞凋亡的過程中，細(xì)胞增殖率增加，最終導(dǎo)致腫瘤形成。凋亡失調(diào)與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，在調(diào)亡機(jī)制上50%的腫瘤細(xì)胞存在缺陷。細(xì)胞凋亡在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中主要起著負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用，可以阻礙腫瘤細(xì)胞的迅速生長。凋亡過程主要由2個(gè)蛋白家族介導(dǎo)，即Bcl-2家族蛋白和caspase家族蛋白，并最終導(dǎo)致結(jié)構(gòu)蛋白消化，DNA降解及細(xì)胞吞噬。細(xì)胞發(fā)生凋亡主要通過兩個(gè)途徑實(shí)現(xiàn)[23]：一是由促凋亡和抗凋亡因子介導(dǎo)的線粒體凋亡通路，二是細(xì)胞表面死亡受體通路。本實(shí)驗(yàn)通過流式凋亡率的檢測，表明β-谷甾醇在0～40 μM范圍內(nèi)，以劑量依賴方式促進(jìn)A549細(xì)胞凋亡，β-谷甾醇濃度越高，A549細(xì)胞凋亡率越大，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

綜上所述，本研究初步證實(shí)，一定濃度的β-谷甾醇可通過阻滯肺癌A549細(xì)胞周期于G2/M 期來抑制細(xì)胞增殖，同時(shí)促進(jìn)細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抗腫瘤作用。

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Effect of β-sitosterol on proliferation and apoptosis of lung cancer cell line A549*

ZhouLingyu，XuCai，WangLeqin，LianXuemei△

(ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China)

Objective To investigate whether β-sitosterol possesses anti-proliferation and apoptosis inductive effect in A549 cells.Methods A549 cells were treated with various concentrations of β-sitosterol for 24 h.The cell proliferation inhibiting effect was measured by using the CCK-8 assay.The apoptosis rate and cell cycle distribution of A549 cells were detected by the flow cytometry method( FCM) after the treatment of β-sitosterol.Results β-sitosterol inhibited the growth of A549 cells in dose dependent manner.The FCM analysis results showed thatβ-sitosterol arrested A549 cells at the stage G2/M of cell cycle,meanwhile promoted the increase of A549 cells apoptosis rate.Conclusion β-sitosterol can induce the apoptotic cell death and G2/M arrest of human lung cancer A549 cells.

β-sitosterol; lung cancer; A549; cell cycle; cell apoptosis

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81071907)；重慶自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2011BB5128)；教育部新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計(jì)劃(10-0997)。

周玲玉，女，碩士，主要從事肺癌與脂代謝研究。

△，E-mail：793585732@qq.com。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.07.001 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1673-4130(2016)07-0865-03

2015-12-18)