鈣粘蛋白糖基化修飾的研究進(jìn)展

楊淑鳳， 鄧國(guó)英， 劉　欣， 孫文長(zhǎng)

(大連醫(yī)科大學(xué) 微生物學(xué)教研室， 大連 116044)

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鈣粘蛋白糖基化修飾的研究進(jìn)展

楊淑鳳， 鄧國(guó)英， 劉欣， 孫文長(zhǎng)

(大連醫(yī)科大學(xué) 微生物學(xué)教研室， 大連 116044)

摘要鈣粘蛋白超家族是一大類依賴Ca(2+)糖蛋白超家族分子，介導(dǎo)細(xì)胞連接、細(xì)胞與組織間質(zhì)連接作用。在組織和器官的形態(tài)形成過程中發(fā)揮了重要作用。鈣粘蛋白除了具有N-糖基化修飾外，還具有O-甘露糖基化修飾。就鈣粘蛋白的糖基化修飾研究包括最新的O-甘露糖基化修飾的進(jìn)展加以綜述。

關(guān)鍵詞鈣粘蛋白；蛋白糖基化過程；糖基轉(zhuǎn)移酶; O-甘露糖基化蛋白

Progress in glycosylation of cadherins

YANG Shu-feng, DENG Guo-ying, LIU Xin, SUN Wen-chang

(Department of Microbiology, Dalian Medical University, Dalian 116044, China)

AbstractCadherin superfamily is a class of glycoproteins involved in cell-cell adhesion and cell-matrix interaction. Their regulating expression during development plays a crucial role in the morphogenesis and patterning of tissues and organs. It is known that N- -glycosylation is existed in cadherins. Besides that, the modification of O-mannosyaltion was found recently in these molecules. In this review, the recent progress of N-glycosylation and O-mannosylation of cadhesins is summarized.

Keywordscadherin; protein-glycosylation; glycosyltransferases; O-mannosylation

鈣粘蛋白(cadherin) 是一組依賴鈣離子的I型跨膜糖蛋白，參與同源細(xì)胞之間的連接、細(xì)胞與組織間的粘著連接(adherens junctions, AJs)。研究發(fā)現(xiàn)糖鏈修飾是其發(fā)揮粘附作用的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)。鈣粘蛋白除了具有N-糖基化修飾外，2013年，研究者們發(fā)現(xiàn)鈣粘蛋白是哺乳動(dòng)物中存在的主要O-甘露糖基化蛋白，并且O-甘露糖聚糖鏈修飾是其發(fā)揮粘附功能的必需成分。本文將介紹其糖基化修飾尤其是最新的O-甘露糖基化修飾的研究進(jìn)展。

1概述

1.1定義和分類

鈣粘蛋白因其作用依賴Ca2+而得名。鈣粘蛋白超家族包括經(jīng)典的鈣粘蛋白、原鈣粘蛋白和鈣粘蛋白相關(guān)蛋白等。目前，在人類發(fā)現(xiàn)鈣粘蛋白超家族成員至少有110個(gè)。鈣粘蛋白超家族可以劃分為多個(gè)亞群，例如經(jīng)典的鈣粘蛋白中的經(jīng)典I型、II型；原鈣粘蛋白可分為集簇型原鈣粘蛋白、非集簇型原鈣粘蛋白等。還有其他的未歸類的亞群例如橋粒鈣粘蛋白、7D-鈣粘蛋白、截?cái)噔}粘蛋白(T-cadherinCDH13)等。而根據(jù)其組織的分布，該超家族可以劃分為表皮鈣粘蛋白(E- cadherin /CDH1)、神經(jīng)鈣粘蛋白(N- cadherin/ CDH2)、胎盤鈣粘蛋白(P- cadherin/ CDH3)、視網(wǎng)膜鈣粘蛋白(R- cadherin /CDH4) 、血管表皮鈣粘蛋白(VE-cadherin/CDH5、腎鈣粘蛋白(K-cadherin/CDH6)以及肌肉鈣粘蛋白( M- cadherin /CDH15)等。

1.2結(jié)構(gòu)

經(jīng)典的鈣粘蛋白分子由含有5 個(gè)串聯(lián)重復(fù)單位(EC1-5)的胞外區(qū)、高度疏水的跨膜區(qū)和胞質(zhì)區(qū)組成(如圖1 所示)[1]。結(jié)合有鈣離子的胞外區(qū)是細(xì)胞間嗜同種相互作用(homophilic adhesion)的部位，即某一細(xì)胞表面鈣粘蛋白與相鄰細(xì)胞的鈣粘蛋白識(shí)別并結(jié)合，因此在細(xì)胞粘附過程中既是受體也是配體分子。胞質(zhì)區(qū)能夠組織多種蛋白募集構(gòu)成AJs 并與細(xì)胞骨架共同作用。例如經(jīng)典鈣粘蛋白I 型的胞內(nèi)區(qū)就是與β-連環(huán)蛋白相連結(jié)，再通過α-連環(huán)蛋白與細(xì)胞骨架相連接。除此之外，還需要一種叫做p120 連環(huán)蛋白(又被稱為γ-連環(huán)蛋白)的新型蛋白參與。處在胞內(nèi)區(qū)近膜端的p120 的作用是防止鈣粘蛋白內(nèi)吞降解[2]。

圖1 E-鈣粘蛋白結(jié)合和甘露糖基化示意圖

除了T-鈣粘蛋白外其他的鈣粘蛋白、原鈣粘蛋白和鈣粘蛋白相關(guān)蛋白的結(jié)構(gòu)與經(jīng)典鈣粘蛋白的結(jié)構(gòu)相類似，都具有胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞質(zhì)區(qū)。但是胞外區(qū)的重復(fù)單位不盡相同，例如7D 鈣粘蛋白的胞外區(qū)具有7 個(gè)重復(fù)EC(EC1-7)；鈣粘蛋白相關(guān)蛋白可以具有34 個(gè)重復(fù)EC(EC1-34)[3]。胞內(nèi)區(qū)結(jié)合區(qū)的長(zhǎng)度和結(jié)合的蛋白也有差異。例如橋粒鈣粘蛋白的胞質(zhì)區(qū)除了與保守的β-連環(huán)蛋白復(fù)合物相結(jié)合的區(qū)域外，還有其特定的胞內(nèi)重復(fù)單位。T-鈣粘蛋白是糖基磷脂酰肌醇錨定蛋白，不具有經(jīng)典鈣粘蛋白的典型結(jié)構(gòu)因而得名。

1.3功能

鈣粘蛋白結(jié)構(gòu)的多樣性也決定其功能的多樣性。研究最為明確的是E-鈣粘蛋白。E-鈣粘蛋白主要分布在各種上皮細(xì)胞，具有抑制腫瘤發(fā)生和腫瘤轉(zhuǎn)移的作用。腫瘤細(xì)胞中E-鈣粘蛋白基因(cdh1)的丟失，可導(dǎo)致細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移潛能的增加。分布在腦和神經(jīng)組織內(nèi)的N-鈣粘蛋白，是突觸誘導(dǎo)發(fā)生過程中重要的粘附蛋白，也是連接心肌細(xì)胞的閏盤結(jié)構(gòu)中主要組成成分。在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中N-鈣粘蛋白的表達(dá)下降與腫瘤的轉(zhuǎn)移高度相關(guān)?？傊?，鈣粘蛋白超家族成員的表達(dá)水平變化都影響著腫瘤的發(fā)生。而且鈣粘蛋白的功能與其糖基化修飾關(guān)系密切。鈣粘蛋白超家族存在著磷酸化、N-糖基化和O-糖基化等多種翻譯后修飾形式。

2N-糖基化修飾

2.1N-糖基化修飾位點(diǎn)

N-糖基化修飾是鈣粘蛋白翻譯后修飾的主要形式。鈣粘蛋白發(fā)生N-糖基化的位點(diǎn)是Asn-X-Ser/Thr(X 是除了Pro 以外的任意氨基酸)模序的Asn 上，并在大多數(shù)種屬間保守。還是以研究較為廣泛的E-鈣粘蛋白為例，E-鈣粘蛋白具有4個(gè)假定的N-糖基化位點(diǎn)即554Asn、556 Asn、618 Asn 和633 Asn，胞外區(qū)EC4 和EC5 上各分布兩個(gè)[2]。并且EC4 上的1 位點(diǎn)(554 Asn)和EC5 上的3 位點(diǎn)(618 Asn)優(yōu)先發(fā)生N-糖基化[4]。例如人類和犬科動(dòng)物的E-鈣粘蛋白N-糖基化位點(diǎn)有3個(gè)(EC4 上的一個(gè)和EC5 上的兩個(gè))就是一致的，犬科動(dòng)物EC4 上另個(gè)糖基化位點(diǎn)與小鼠的一致[5]。N-鈣粘蛋白已經(jīng)證實(shí)的N-糖基化位點(diǎn)有3個(gè)，位于EC2 的207 Asn 和325 Asn 以及EC3 402 Asn[6]。

2.2N-糖基化過程的關(guān)鍵酶

鈣粘蛋白N-糖基化過程涉及多種酶的相互作用，其中N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶III(N-Acetylglucosaminyltransferase III, GnT-III), N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶V(N-Acetylglucosaminyltransferase V, GnT-V), 和a1, 6 巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)移酶(a1, 6 Fucosyltransferase, FUT8)催化了鈣粘蛋白N-糖基化過程的關(guān)鍵步驟[4]。

GnT-III 和GnT-V 是相互競(jìng)爭(zhēng)的。GnT-III 具有抗腫瘤轉(zhuǎn)移的特性，推測(cè)與其催化生成的平分型GlcNAc 有關(guān)：平分型GlcNAc 能通過EGFR 和Src 信號(hào)途徑來下調(diào)β-連環(huán)蛋白的酪氨酸磷酸化進(jìn)程，從而維持E-鈣粘蛋白胞內(nèi)區(qū)與β-連環(huán)蛋白的結(jié)合，最終提高細(xì)胞外E-鈣粘蛋白同嗜相互作用來抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移[7]。此外，GnT-III 也影響了整合素所介導(dǎo)的細(xì)胞擴(kuò)散和遷移[8]。也有研究認(rèn)為GnT III的轉(zhuǎn)錄的上調(diào)是由于具有抑制腫瘤作用的E-鈣粘蛋白表達(dá)[9]?？傮w來說，GnTIII至少通過兩種機(jī)制即上調(diào)細(xì)胞與細(xì)胞間的粘附和下調(diào)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的粘附來抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移。GnT-V 催化生成的β-1, 6GlcNAc 在E-鈣粘蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞粘附和胞內(nèi)信號(hào)路徑中具有促腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲的作用[2]。

2.3N-糖基化修飾生物學(xué)意義

鈣粘蛋白的N-糖基化修飾具有調(diào)節(jié)細(xì)胞間粘附和胞質(zhì)骨架動(dòng)態(tài)變化的作用[4]。Liwosz 等發(fā)現(xiàn)在稀疏的細(xì)胞里，E-鈣粘蛋白具有較大的分子形狀，EC4的1 位點(diǎn)連有復(fù)合型N-糖鏈，EC5 上連有高甘露糖或者雜合型的N-糖鏈；而在密集的細(xì)胞里，EC4 的1 位點(diǎn)上的復(fù)合型糖鏈結(jié)構(gòu)則消失[10]。這種依賴于細(xì)胞密度的E-鈣粘蛋白N-糖基化修飾是由于在稀疏細(xì)胞里， AJs 是不成熟的，而在密集細(xì)胞里可以形成成熟的粘著帶促使穩(wěn)定的細(xì)胞聯(lián)系[10]。因此，E-鈣粘蛋白在新生成的AJ 中是連有復(fù)合型N-糖鏈的，而在成熟狀態(tài)是低糖基化的。也表明N-糖基化過程能影響E-鈣粘蛋白的穩(wěn)定[4]。例如在口腔鱗狀細(xì)胞癌中，就是由于調(diào)控N-糖基化的基因(DPAGT1)的調(diào)控功能紊亂，導(dǎo)致了DPAG1/Wnt/E-鈣粘蛋白網(wǎng)絡(luò)受到影響，從而在翻譯后修飾的調(diào)控水平上導(dǎo)致了腫瘤的發(fā)生[11]。

此外，在N-鈣粘蛋白里發(fā)現(xiàn)，N-糖基化過程不僅影響最初鈣粘蛋白分子間的相互作用，在隨后的鈣粘蛋白作用過程也發(fā)揮作用[8]。

3O-糖基化修飾

3.1O-GlcNAc 修飾

鈣粘蛋白的O-糖基化的最早報(bào)道見于2001 年，Zhu 等將新合成的E-鈣粘蛋白分子胞質(zhì)內(nèi)區(qū)域發(fā)生O-糖基化(O-GlcNAc)后，發(fā)現(xiàn)E-鈣粘蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)細(xì)胞表面過程受阻，細(xì)胞間的粘附也降低。推測(cè)胞質(zhì)內(nèi)O-GlcNAc 的過程可能影響了E-鈣粘蛋白與p120 連動(dòng)蛋白的結(jié)合，調(diào)控了鈣粘蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)細(xì)胞表面的過程，下調(diào)了某些凋亡路徑中的粘附作用[12]。該課題組隨后又進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，E-鈣粘蛋白胞質(zhì)內(nèi)區(qū)域發(fā)生O-GlcNAc 后，并不直接影響與β-連環(huán)蛋白、α-連環(huán)蛋白以及p120 的結(jié)合，直接影響是與I 型磷脂酰肌醇磷酸激酶γ(PIPKIγ)結(jié)合，從而在凋亡過程中發(fā)揮作用[13]。但在體內(nèi)鈣粘蛋白是否存在O-GlcNAc 修飾一直未見報(bào)道。

3.2O-Man 修飾

3.2.1O-Man 修飾的發(fā)現(xiàn)

2013 年P(guān)NAS 發(fā)表了兩篇關(guān)于鈣粘蛋白具有O-甘露糖基化修飾的報(bào)道[14， 15]，首次證實(shí)鈣粘蛋白具有O-甘露糖基化修飾。并且這個(gè)超家族是哺乳動(dòng)物體內(nèi)存在的主要O-甘露糖基化蛋白，鈣粘蛋白超家族中約有37 個(gè)成員都具有O-甘露糖基化修飾。

鈣粘蛋白具有O-甘露糖基化修飾的發(fā)現(xiàn)是基于對(duì)α-抗肌萎縮蛋白(α-dystrophin, α-DG)的研究基礎(chǔ)上的。α-DG 是目前研究較多的哺乳動(dòng)物體內(nèi)的O-甘露糖化蛋白。該蛋白除了在肌肉組織分布外，在腦組織也存在。當(dāng)腦組織中的α-DG 移除后，而腦組織的O-甘露糖基化蛋白的水平并未降低。這個(gè)發(fā)現(xiàn)提示在腦組織中分布著具有O-甘露糖基化修飾的其他蛋白[16]。此外，鈣粘蛋白具有O-甘露糖基化修飾的發(fā)現(xiàn)還要?dú)w功于O-GalNAc 糖蛋白分析手段的革新。

Steentoft 等發(fā)展了一種強(qiáng)大的分析策略來確定帶有O-GalNAc 結(jié)構(gòu)的糖蛋白并且能繪制出其發(fā)生O-GalNAc 的位點(diǎn)[17, 18]。研究者們又將該方法應(yīng)用在O-甘露糖基化蛋白組分析中：先是利用“SimpleCells”和鋅指核酸酶策略簡(jiǎn)化O-甘露糖基化蛋白，使得O-甘露糖基化蛋白僅帶有一個(gè)甘露糖殘基修飾。然后結(jié)合凝集素和質(zhì)譜技術(shù)確定和分析其O-甘露糖基化位點(diǎn)。

3.2.2O-Man 修飾的位點(diǎn)

鈣粘蛋白的O-甘露糖基化位點(diǎn)多數(shù)是通過SimpleCells 方法確定出來的，到目前約有133 個(gè)位點(diǎn)得以確定[14]。例如經(jīng)典的鈣粘蛋白I 型和II 型大多數(shù)位點(diǎn)是保守的，尤其分布在胞外區(qū)EC2-5 的，但在EC1 上沒有O-甘露糖基化位點(diǎn)。原鈣粘蛋白以集簇型鈣粘蛋白亞群為主，O-甘露糖基化位點(diǎn)主要分布在集簇型鈣粘蛋白的EC2-3，在EC5-6 也有，但在EC4 上卻沒有。如圖1 所示，E-鈣粘蛋白形成反式同型二聚體涉及的EC1 和EC2 區(qū)域是沒有O-甘露糖基化修飾的，而負(fù)責(zé)呈遞EC1 和EC2 作用的EC3-5 則是帶有O-甘露糖基化修飾的[16]。

3.2.3O-Man 修飾的生物學(xué)意義

EC3-5 的O-甘露糖基化修飾和鈣離子是呈遞EC1 和EC2 形成反式同型二聚體進(jìn)而發(fā)揮粘附作用的關(guān)鍵因素。O-甘露糖基化受阻導(dǎo)致EC1 和EC2不能形成同型二聚體，細(xì)胞間的粘附受到影響從而導(dǎo)致細(xì)胞惡變幾率升高[16]。

O-甘露糖基化修飾對(duì)鈣粘蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞粘附過程非常關(guān)鍵。鈣粘蛋白O-甘露糖基化修飾缺陷會(huì)導(dǎo)致小鼠胚胎死于桑椹胚到胚泡期的植入前階段[15]。而O-甘露糖基化修飾在鈣粘蛋白中的發(fā)現(xiàn)也能解釋了一些遺傳性肌營(yíng)養(yǎng)不良(CMD)的病人例如Walker-Warburg 綜合征出現(xiàn)的腦組織和視力受損的癥狀。

3.3O-GalNAc 修飾

Vester-Christensen 等利用“SimpleCells”結(jié)合鋅指核酸酶策略確定了鈣粘蛋白具有O-甘露糖糖基化修飾，也意外地發(fā)現(xiàn)了在經(jīng)典鈣粘蛋白的EC1(63Thr)存在OGalNAc 修飾[14]。至于這個(gè)位點(diǎn)糖鏈修飾的意義尚需進(jìn)一步的研究。

4結(jié)語(yǔ)和展望

鈣粘蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞粘附在胚胎發(fā)育、組織分化和修復(fù)以及腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。相信隨著分析技術(shù)手段的革新，對(duì)于糖蛋白這種翻譯后修飾的調(diào)控作用將日漸清晰。

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中圖分類號(hào)Q51

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)2095-1736(2016)02-0100-03

作者簡(jiǎn)介：楊淑鳳，博士，講師，從事結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞壁甘露糖基化蛋白功能研究，E-mail：shufengyang78@163.com；通信作者：孫文長(zhǎng)，博士，副教授，從事病原微生物學(xué)研究，E-mail：2981264350@qq.com。

收稿日期：2015-06-02；修回日期：2015-06-08

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2016.02.100