酶促交聯(lián)谷朊蛋白及其成膜性能的研究

孫紅玉, 崔 莉, 王 平, 王 強(qiáng), 范雪榮, 李 帥

(江南大學(xué) 生態(tài)紡織教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 江蘇 無(wú)錫 214122)

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酶促交聯(lián)谷朊蛋白及其成膜性能的研究

孫紅玉, 崔 莉, 王 平, 王 強(qiáng), 范雪榮, 李 帥

(江南大學(xué) 生態(tài)紡織教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 江蘇 無(wú)錫 214122)

摘 要以谷朊蛋白(Glu)為原料，利用谷胺酰胺轉(zhuǎn)移酶(TGase)的催化交聯(lián)作用，制備谷朊蛋白膜，探討酶的用量、反應(yīng)液的pH值、溫度、時(shí)間對(duì)蛋白膜的物理機(jī)械性能的影響以及酶促反應(yīng)對(duì)蛋白膜水溶穩(wěn)定性及疏水性的影響。試驗(yàn)數(shù)據(jù)說(shuō)明，當(dāng)酶促反應(yīng)條件為酶用量20 U/g(Glu)，pH 7.0，溫度40℃，時(shí)間2 h時(shí)，所制備的谷朊蛋白膜(GF)的抗拉強(qiáng)度相對(duì)于對(duì)照膜提高了16.8 %，同時(shí)其水溶穩(wěn)定性及疏水性能均得到相應(yīng)增強(qiáng)。

關(guān)鍵詞TGase;谷朊蛋白;蛋白膜性能

The film-forming properties of transglutaminase-catalyzed gluten

SUN Hong-yu, CUI Li, WANG Ping, WANG Qiang, FAN Xue-rong, LI Shuai

( Key Laboratory of Eco-Textiles, Ministry of Education, Jiangnan University, Wuxi 214122, China )

AbstractA novel transglutaminase-catalyzed gluten reaction system was developed to prepare gluten films. The enzyme concentration, pH value of the solution, temperature and reaction time on the gluten films′ mechanical properties were discussed. Meanwhile, the effects of enzyme-catalyzed reactions on the hydrophobicity and soluble stability of the gluten films were investigated. The tensile strength of the modified gluten films was improved by 16.8 % compared with that of the control films when the system conditions were as follows: 20 U/g gluten of TGase, pH 7.0 of the solution, reaction at 40℃ for 2 h. In addition, the soluble stability and hydrophobicity of the modified gluten films were improved.

KeywordsTGase; gluten; protein

谷朊蛋白(Glu)來(lái)自于生產(chǎn)小麥淀粉加工時(shí)的副產(chǎn)品, 其來(lái)源廣泛，且蛋白質(zhì)含量較高，大概為80%。其可作為制備蛋白膜的理想原料[1]，并且所得膜具有良好的生物相容性、生物可降解性和病原體傳播低風(fēng)險(xiǎn)性，在醫(yī)藥，包裝材料，食品領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。然而一般條件下制備得到的谷朊蛋白膜機(jī)械性能較差、在水中的溶失率較高而影響其應(yīng)用效果。對(duì)蛋白膜材料進(jìn)行交聯(lián)改性的最常見(jiàn)的方法之一即改善其物理化學(xué)性能，從而擴(kuò)大其應(yīng)用領(lǐng)域。傳統(tǒng)的改性方法是利用化學(xué)交聯(lián)劑，如甲醛、戊二醛等與蛋白發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，從而提高膜的機(jī)械性能及水溶穩(wěn)定性。然而，化學(xué)試劑造成的毒副作用、環(huán)境污染、反應(yīng)條件苛刻等很大程度限制了化學(xué)交聯(lián)劑的使用。谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶(TGase) 可催化?；w和酰基受體發(fā)生?；D(zhuǎn)移反應(yīng)，使蛋白質(zhì)或多肽鏈發(fā)生共價(jià)交聯(lián)形成分子內(nèi)或分子間的交聯(lián)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[2](圖1)。交聯(lián)后的蛋白分子量增大，對(duì)酸、堿及蛋白酶的水解作用具有一定抵抗能力。從而提高蛋白的功能特性以及營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)。TGase催化交聯(lián)物質(zhì)后，使其分子量變大，從而具有更強(qiáng)的分子間相互作用及更為穩(wěn)定的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，同時(shí)對(duì)抗外力的拉伸及蛋白酶降解的能力增強(qiáng)。Glu 富含谷氨酰胺殘基的氨基酸組成特點(diǎn)為TGase酶促改性提供了條件。

本文以Glu 為原料，在谷朊蛋白的非水溶性體系中對(duì)其進(jìn)行TGase酶促交聯(lián)改性，將改性蛋白溶于甲酸后制備蛋白膜，探究了酶促體系對(duì)所制備的蛋白膜的物理機(jī)械性能、疏水性及水溶穩(wěn)定性的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 試劑谷朊蛋白(蛋白質(zhì)含量86%，無(wú)錫山紫凌云商貿(mào)有限公司)，TGase(1 500 U/g, 北京華邁科生物技術(shù)公司)，其余試劑皆為分析純。

1.1.2 儀器TG16-WS臺(tái)式離心機(jī)(湖南湘儀儀器有限公司)，UV-2808S紫外分光光度計(jì)(尤尼柯上海儀器限公司)，SPX-150C恒溫恒濕箱(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司)，BIO-RAD Mini-P TET蛋白質(zhì)電泳儀(美國(guó)伯樂(lè)有限公司)，Nano-ZS90 Zeta電位及粒徑分析儀(英國(guó)馬爾文儀器有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1TGase在非水溶體系中催化Glu交聯(lián)的反應(yīng)

將3%的Glu分散于不同pH值的水溶液中，待谷朊蛋白均勻分散后，加入一定量的TGase，在一定溫度下反應(yīng)。待結(jié)束反應(yīng)后，將混合體系于4 000 r/min離心8 min，棄去清液，將沉淀置于冷凍干燥器內(nèi)，干燥后進(jìn)行研磨制得改性的谷朊蛋白備用。以添加失活酶的反應(yīng)產(chǎn)物為對(duì)照。

1.2.2谷朊蛋白膜(GF)的制備

將改性后的谷朊蛋白溶于88%甲酸中，加入一定量的甘油，于室溫下攪拌至充分溶解，置于超聲振蕩器中超聲5 min，去除內(nèi)部氣泡。將溶液倒入光滑的聚四氟乙烯板上，室溫晾干，然后將干燥的薄膜從板上小心剝離，制得谷朊蛋白膜。

1.2.3測(cè)試方法

1)GF的物理機(jī)械性能測(cè)試[3]

將GF置于螺旋測(cè)微器下，隨機(jī)讀取6點(diǎn)厚度, 取平均值，然后將蛋白膜裁剪成 60 mm×10 mm尺寸待測(cè)量。采用萬(wàn)能強(qiáng)力試驗(yàn)機(jī)在室溫下測(cè)定改性谷朊蛋白膜的拉伸強(qiáng)度(TS)與斷裂伸長(zhǎng)率(E), TS值通過(guò)由檢體的橫截面面積除以最大負(fù)載來(lái)確定。

2)SDS-PAGE凝膠電泳

選用12%的分離膠和5%的濃縮膠作為預(yù)制膠，放入蛋白質(zhì)電泳儀后加入電極緩沖液，將樣品溶液置于含有2% (w/v)的十二烷基硫酸鈉(SDS)，5% (v/v) 的β-巰基乙醇，10% (v/v)甘油及0.125 mol/L的Tri-HCL(pH 6.8)中溶解完全，在95℃下加熱5 min。取6 μL 樣品上樣[4]，加入樣品后開始加壓，使用低壓100 V，15 min換高壓200 V跑膠35 min。取膠用0.1%的考馬斯亮藍(lán)R250進(jìn)行染色，之后洗脫色。

3)氨含量的測(cè)試[5]

實(shí)驗(yàn)中依次加入5 mL顯色液A(苯酚及亞硝基鐵氰化鈉，濃度分別為10 g/L和50 mg/L )，1 mL含氨的待測(cè)液及5 mL顯色液B (5 g/L 的氫氧化鈉、4 g/L的檸檬酸三鈉和7 mL/L的次氯酸鈉)。實(shí)驗(yàn)時(shí)要注意震蕩搖晃，于38℃下顯色30 min，測(cè)定其在640 nm處的吸光值。

4)GF的溶解穩(wěn)定性

取一定量的GF，于50℃、0.05 MPa 的真空干燥器中干燥 24 h后，將其置于浴比為200∶1的去離子水中，在一定溫度下振蕩，每隔一定的時(shí)間間隔，精密吸取一定量的溶液并迅速補(bǔ)充等量的水。根據(jù)溶液中蛋白質(zhì)的含量來(lái)評(píng)價(jià)其溶解穩(wěn)定性[6]。

5)GF的接觸角

蛋白膜樣品在25℃，相對(duì)濕度為50的恒溫恒濕條件下平衡24 h，剪齊邊后平整固定在張力測(cè)量?jī)x平臺(tái)上。在距離布面10 mm處滴下去離子水液滴，5 s后進(jìn)行拍照，記錄水滴與膜間形成的接觸角。

2 結(jié)果與討論

2.1 TGase量對(duì)GF機(jī)械性能影響

TGase作為一種生物催化劑，可以促進(jìn)谷朊蛋白本身發(fā)生自交聯(lián)。在pH 7.0的水溶液中于40℃下反應(yīng)3 h，不同用量的TGase對(duì)谷朊蛋白膜的機(jī)械性能的影響結(jié)果見(jiàn)圖2所示。

圖2 TGase量對(duì)GF機(jī)械性能的影響

在該反應(yīng)體系中，蛋白顆粒的平均粒徑為1023 nm，可較好地分散于水相中，TGase能作用于蛋白分子的表面，實(shí)現(xiàn)蛋白的交聯(lián)反應(yīng)。同時(shí)，谷朊蛋白中谷氨酰胺及賴氨酸的量分別為40 g/100 g Glu, 1 g/100 g Glu左右，可作為TGase作用的良好底物。由圖1可知，當(dāng)TGase的用量增加至20 U/g Glu時(shí)，膜的抗拉強(qiáng)度比對(duì)照膜提高了16.5%，斷裂伸長(zhǎng)率下降了20.1%。說(shuō)明在分散體系中，TGase催化谷朊蛋白中谷氨酰胺殘基和賴氨酸殘基發(fā)生了交聯(lián)反應(yīng)，分子量變大，分子間作用力增強(qiáng)，蛋白膜結(jié)構(gòu)中蛋白之間更易形成致密的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，分子間相對(duì)移動(dòng)性下降。繼續(xù)增加TGase的用量，膜的機(jī)械性能變化趨于穩(wěn)定，因此合適的酶用量為20 U/g Glu。

2.2 pH值對(duì)GF機(jī)械性能影響

反應(yīng)液的pH值對(duì)酶活影響較大，對(duì)TGase來(lái)說(shuō)，合適的pH值約為6.0～7.0，在此區(qū)間酶活較高，若小于4.0或高于9.0時(shí)，酶不穩(wěn)定而易失活[7， 8]。TGase用量為20 U/g Glu，于40℃下反應(yīng)3 h，pH值對(duì)改性后谷朊蛋白膜機(jī)械性能的影響如圖3所示。

圖3 pH值對(duì)GF機(jī)械性能影響

當(dāng)pH值為6.0～7.0時(shí)，蛋白膜的抗拉強(qiáng)度較好，分別為4.27 MPa和4.36 MPa。而pH值處于5.0或8.0時(shí)，抗拉強(qiáng)度有所下降。這是由于在pH值為6.0～7.0時(shí)，酶活較高。當(dāng)pH值偏離該范圍時(shí)，酶活下降，酶催化作用減弱，所得蛋白膜抗拉強(qiáng)度減小。同時(shí)，谷朊蛋白中的谷氨酰胺在酸性或堿性條件下容易發(fā)生脫酰胺并形成谷氨酸，影響交聯(lián)作用，從而蛋白膜的機(jī)械強(qiáng)度下降。綜合以上所述，酶促反應(yīng)宜選擇在中性條件下。

2.3 溫度對(duì)GF機(jī)械性能的作用效果

酶是一種具有較強(qiáng)生物活性的蛋白質(zhì)，對(duì)反應(yīng)溫度較敏感，已知所用TGase的最適溫度為30℃～50℃，在此范圍內(nèi)考察不同溫度對(duì)谷朊蛋白膜機(jī)械性能的影響(pH 7.0，TGase用量20 U/g谷朊蛋白，反應(yīng)時(shí)間3 h)，結(jié)果如圖4所示。

當(dāng)反應(yīng)體系溫度從20℃升至40℃時(shí)，膜的抗拉強(qiáng)度逐漸增加，增加了4.8%，斷裂伸長(zhǎng)率下降了8.3%。原因在于，隨著溫度的升高，TGase的活性不斷增加，交聯(lián)反應(yīng)的程度也隨之增加，相應(yīng)制備的蛋白膜的抗拉強(qiáng)度增加，斷裂伸長(zhǎng)率降低。當(dāng)體系溫度高過(guò)40℃時(shí)，GF的抗拉強(qiáng)度出現(xiàn)下降趨勢(shì)。說(shuō)明隨著體系溫度的增加，雖然TGase的催化速率仍在繼續(xù)變大，但溫度太高會(huì)使TGase失活而變性，導(dǎo)致谷朊蛋白分子之間的交聯(lián)程度逐漸下降。

圖4 溫度對(duì)GF機(jī)械性能的作用

2.4 時(shí)間對(duì)GF機(jī)械性能的作用效果

谷朊蛋白雖然可作為TGase作用的適宜底物，但在其非水溶體系中，作用位點(diǎn)會(huì)明顯減少，時(shí)間可對(duì)谷朊蛋白的酶促交聯(lián)作用產(chǎn)生影響。在pH 7.0，TGase用量為20 U/g Glu的反應(yīng)體系中于40℃，不同酶促反應(yīng)時(shí)間對(duì)谷朊蛋白膜物理機(jī)械性能的影響如圖5所示。

圖5 不同反應(yīng)時(shí)間條件下GF拉伸強(qiáng)度

從圖5可知，當(dāng)酶促作用2 h后，谷朊膜的抗拉強(qiáng)度以及斷裂伸長(zhǎng)率即發(fā)生顯著改變，與對(duì)照樣對(duì)比后發(fā)現(xiàn)，其抗拉強(qiáng)度上升了16.7%，斷裂伸長(zhǎng)率下降了12.3%。這可能是由于隨著反應(yīng)過(guò)程的進(jìn)行，體系中谷朊蛋白分子內(nèi)或分子間的谷氨酰胺及賴氨酸殘基逐步發(fā)生交聯(lián)作用，結(jié)合形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，使得分子間結(jié)合緊密。同時(shí)，分子間鏈段移動(dòng)減小。隨著時(shí)間的增加，谷朊膜的機(jī)械性能穩(wěn)定，這可能是因反應(yīng)的不斷進(jìn)行，酶的活性在不斷地降低，此時(shí)酶促反應(yīng)達(dá)到平衡。

2.5 非水溶體系中TGase酶促交聯(lián)谷朊蛋白的SDS-PAGE

實(shí)驗(yàn)選擇TGase催化交聯(lián)谷朊蛋白反應(yīng)的上清液及沉淀分別進(jìn)行凝膠電泳實(shí)驗(yàn)，對(duì)照樣加失活酶(其他條件均相同)。結(jié)果如圖6所示，1、2分別為加入失活酶的谷朊蛋白(對(duì)照樣)和加入TGase的谷朊蛋白。

圖6 清液及沉淀中TGase催化谷朊蛋白的電泳圖

由圖5可知，上清液及沉淀中的谷朊蛋白大都集中在10 ku至45 ku之間。在谷朊蛋白的非均相反應(yīng)體系中，酶促反應(yīng)使得高分子量區(qū)域蛋白濃度有所增加，且由于分子交聯(lián)而出現(xiàn)于凝膠泳帶上部。因上樣緩沖液中存在強(qiáng)氧化劑β-巰基乙醇，其可破壞蛋白分子內(nèi)的二硫鍵，故可確定大分子量的聚合物是通過(guò)共價(jià)鍵聚合，而不是其它非共價(jià)鍵所致。即在TGase作用下，谷朊蛋白中的谷氨酰胺殘基和賴氨酸殘基發(fā)生交聯(lián)作用，產(chǎn)生大分子聚合物，且無(wú)論是溶于水的谷朊蛋白，還是未溶解的谷朊蛋白均可發(fā)生分子內(nèi)或分子間的交聯(lián)作用。

2.6 氨含量的測(cè)定

TGase催化?；D(zhuǎn)移反應(yīng)的同時(shí)，反應(yīng)體系有NH3的釋放。故可根據(jù)氨氣的釋放量來(lái)反映酶促交聯(lián)狀態(tài)，如圖7所示。

圖 7 不同反應(yīng)時(shí)間條件下的氨態(tài)氮濃度

如圖7所示，即使沒(méi)有酶的作用，體系內(nèi)的氨態(tài)氮濃度保持在0.07 μg/mL，這是溶液中本身存在的氨的量，而酶促反應(yīng)系中，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，體系內(nèi)的氨含量不斷增加，這是由于TGase催化谷朊蛋白反應(yīng)中，谷朊蛋白分子內(nèi)或分子間的谷氨酰胺殘基和賴氨酸殘基發(fā)生交聯(lián)作用，釋放出氨氣。

2.7 GF的水溶解穩(wěn)定性

蛋白膜的耐水穩(wěn)定性是決定其應(yīng)用性能的一個(gè)重要因素，TGase的酶促交聯(lián)谷朊蛋白反應(yīng)對(duì)蛋白膜在水中的穩(wěn)定性的影響如圖8所示。

圖8 GF的水溶解穩(wěn)定性

由圖8中的結(jié)果可知，無(wú)論是空白樣還是經(jīng)TGase交聯(lián)改性后制備的蛋白膜，在30℃水中震蕩一定時(shí)間, 均有蛋白溶出。但經(jīng)TGase催化改性而成的谷朊白膜在水中溶出量要比空白樣低12.01%。這大概主要因?yàn)閮煞矫妫阂环矫妫琓Gase的催化交聯(lián)減少了谷朊蛋白中賴氨酸殘基及谷氨酰胺殘基的量，使其親水性降低；另一方面，因酶催化交聯(lián)的Glu具有更高的分子量，分子間作用力增加，其所形成的蛋白膜結(jié)構(gòu)較緊密，從而提高蛋白膜的穩(wěn)定性。

2.8 GF的接觸角

水接觸角值可作為膜材料表面疏水性的一個(gè)指標(biāo)[9， 10]。一般說(shuō)來(lái)，若蛋白膜的接觸角值較高，則表示其表面具有較強(qiáng)的疏水性及較低的潤(rùn)濕性。圖9則出示了不同谷朊膜的接觸角。

圖9 GF的接觸角

對(duì)照膜的接觸角是98.32°，經(jīng)TGase交聯(lián)改性后制備得到的谷朊蛋白膜接觸角為123.08°，這是因?yàn)門Gase的酶促交聯(lián)作用封閉了蛋白結(jié)構(gòu)中一定量的親水基團(tuán)賴氨酸殘基和谷氨酰胺殘基，且蛋白的交聯(lián)反應(yīng)增加了蛋白分子間的作用力，膜材料的結(jié)構(gòu)更為緊密，賦予蛋白膜表面更好的疏水性，從而提高其應(yīng)用性能。

3結(jié)論

在非均相反應(yīng)體系中，SDS-PAGE凝膠電泳及氨含量測(cè)試均表明谷朊蛋白在TGase作用下發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)。

探索出TGase催化Glu交聯(lián)反應(yīng)相對(duì)合適的工藝為：酶量為20 U/g谷朊蛋白、反應(yīng)體系的pH 7.0、于40℃下反應(yīng)2 h左右。相比對(duì)照膜來(lái)說(shuō)，交聯(lián)后的谷朊蛋白形成的膜材料抗拉強(qiáng)度增加了16%左右。

交聯(lián)改性后的谷朊蛋白形成的膜在熱水中的穩(wěn)定性得到了一定程度的提高，溶解率下降了12.01%, 表面疏水性提高了25.18%。

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中圖分類號(hào)TS201.2

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)2095-1736(2016)02-0044-05

作者簡(jiǎn)介：孫紅玉，碩士研究生，從事紡織生物技術(shù)的研究, E-mail:969997108@qq.com；通信作者：崔 莉，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事紡織生物技術(shù)的研究, E-mail: cuili_72@163.com。

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(51373071)

收稿日期：2015-07-14；修回日期：2015-08-04

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2016.02.044