離子交換配基密度對蛋白質(zhì)吸附行為的影響

楊小雁，李雯露，孔英俊，王明林，張貴鋒，蘇志國

( 1． 山東農(nóng)業(yè)大學 食品科學與工程學院， 泰安 271018;

2． 中國科學院 過程工程研究所 生化工程國家重點實驗室， 北京 100190)

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離子交換配基密度對蛋白質(zhì)吸附行為的影響

楊小雁1，李雯露1，孔英俊2，王明林1，張貴鋒2，蘇志國2

( 1． 山東農(nóng)業(yè)大學 食品科學與工程學院， 泰安 271018;

2． 中國科學院 過程工程研究所 生化工程國家重點實驗室， 北京 100190)

摘要利用雙偏振極化干涉測量儀(DPI)研究了離子交換配基密度對蛋白質(zhì)吸附行為的影響。用N，N-二乙基-3-氨基丙基三甲氧基硅烷(DAPTMS)對DPI芯片進行修飾，利用X 射線光電子能譜表征了芯片上配基密度的差異。以溶菌酶、細胞色素C、糜蛋白酶、牛血清白蛋白和免疫球蛋白為模型蛋白，利用DPI研究了5種蛋白質(zhì)在不同配基密度界面上吸附量、吸附密度和空間形態(tài)。結(jié)果表明，隨著配基密度的增加，蛋白在界面上的吸附量、吸附密度隨之增加，起始吸附速率隨之增大；蛋白的空間形態(tài)與配基密度密切相關(guān)，特別是免疫球蛋白，蛋白層厚度遠小于其分子直徑，空間形態(tài)發(fā)生變化。證明配基密度是影響界面上蛋白質(zhì)吸附量、吸附密度和空間形態(tài)等吸附行為的關(guān)鍵因素。

關(guān)鍵詞離子交換色譜；配基密度；吸附行為；雙偏振極化干涉測量儀

Effect of the ion exchange chromatography ligand density on the absorption behavior of proteins

YANG Xiao-yan1， LI Wen-lu1， KONG Ying-jun2， WANG Ming-lin1，ZHANG Gui-feng2， SU Zhi-guo2

( 1． College of Food Science and Engineering， Shandong Agriculture University， Taian 271018;2． National Key Laboratory of Biochemical Engineering， Institute of Process Engineering，Chinese Academy of Sciences， Beijing 100190， China)

Abstract The effect of ligand density on the adsorption behavior of proteins was investigated using dual polarization interferometry (DPI)．The sensor chips of DPI were modified with 3-aminopropy-l-triethoxysilane (DAPTMS). The ligand densities on the modified chips were compared using X-ray photoelectron spectroscopy．Lysozyme， myoglobin， chymotrypsin， bovine serum albumin and immunoglobulin were used as model proteins. The adsorption behaviors of five proteins, such as adsorption amount, adsorption density and spatial structure, on the modified chips were characterized using DPI. It was found that with the increase of ligand density, the adsorption amount and density of proteins at the interface increased. Meanwhile, the initial adsorption rate grew. The spatial structure of proteins, especially immunoglobulin, was closely related with ligand density. The thickness of adsorption immunoglobulin layer was much smaller than the molecular diameter. The results indicated that the ligand density on the modified chip affected the amount, density and spatial structure of proteins on the interfaces．

Keywordsion exchange chromatography; ligand density; adsorption behavior; dual polarization interferometer

離子交換層析是一種高效的分離方法，已廣泛應用于蛋白質(zhì)、多肽以及核酸等生物大分子的分離純化，是各種分離層析工藝中應用較廣的一種[1]。然而，在層析過程中蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)易發(fā)生變化以致失去活性，如一些多聚體蛋白質(zhì)經(jīng)過層析過程可能會解聚，而一些單體蛋白質(zhì)在層析中可能發(fā)生聚集等[2]。對于層析過程中蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化，目前研究主要集中在層析時pH值、緩沖液、鹽濃度等因素方面[3-5]，而對離子交換層析過程中固定相的配基密度研究相對缺乏。配基密度決定了靜電相互作用的強弱，對目標蛋白質(zhì)的靜態(tài)吸附、動態(tài)吸附和吸附動力學等都有較大的影響[6]。

配基密度對于層析分離的影響十分復雜，相關(guān)認識卻比較有限，不利于蛋白質(zhì)分離過程的優(yōu)化。John等[7]研究了蛋白質(zhì)在不同配基密度的陽離子層析中傳質(zhì)過程，以溶菌酶為模型蛋白，利用孔擴散模型研究了配基密度對動態(tài)結(jié)合容量的影響。A Franke等[8]以IgG、人血清白蛋白和肌紅蛋白為模型蛋白，研究了陽離子交換介質(zhì)的配基密度對蛋白質(zhì)提純的影響。現(xiàn)有的研究主要考察配基密度對擴散系數(shù)、吸附速率及動態(tài)結(jié)合能力等宏觀條件的影響，未能提供蛋白質(zhì)在吸附-解吸過程中空間結(jié)構(gòu)的微觀變化。

雙偏振極化干涉測量儀(DPI)[9]是基于托馬斯楊的雙縫干涉實驗，運用了光學方法測定，能夠提供蛋白質(zhì)在界面上吸附實時數(shù)據(jù)的儀器，可以達到較低的檢測限，同時提供吸附層密度、質(zhì)量和厚度的數(shù)據(jù)，可以用于研究吸附過程中蛋白質(zhì)的動態(tài)變化[10， 12]，可在亞秒尺度精確測量界面吸附蛋白質(zhì)層的厚度、密度和質(zhì)量的絕對值等，并可提供蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)信息。

本研究采用N，N-二乙基-3-氨基丙基三甲氧基硅烷(DAPTMS)對DPI芯片進行修飾，制備帶有類似于DEAE配基的硅片，作為離子交換介質(zhì)表面的簡化模型。以溶菌酶、細胞色素C、糜蛋白酶、牛血清白蛋白和免疫球蛋白為模型蛋白，利用DPI從微觀尺度上研究5種蛋白質(zhì)在不同配基密度表面上吸附量、吸附密度和空間結(jié)構(gòu)形態(tài)，從而研究界面上的配基密度對蛋白質(zhì)吸附行為的影響。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1材料與試劑

N，N-二乙基-3-氨基丙基三甲氧基硅烷(分析純，Sigma公司)，牛血清白蛋白，溶菌酶，細胞色素C，糜蛋白酶，均購自Sigma公司，免疫球蛋白(12.32%葡萄糖溶液，中檢院)DPI芯片(未修飾，英國Farfield公司)，其他試劑均為市售分析純。

1.1.2主要儀器

雙偏振極化干涉測量儀(DPI)(AnaLight?4D，英國Farfield公司)，X射線光電子能譜檢測儀(XPS)(ESCALAB 250Xi，美國Thermo公司)，原子力顯微鏡(AFM)(Bioscope catalyst，美國Veeco公司)。

1.2 方法

1.2.1 硅片處理

將DPI空白芯片浸入Piranha溶液(用98%濃硫酸與30%過氧化氫體積比7∶3配制)中，90℃水浴2 h；使用超純水清洗后用乙醇沖洗，氮吹。將芯片浸泡在DAPTMS甲苯溶液中不同時長(10 min、20 min、30 min和60 min)，取出后于烘箱100℃干燥3 h，后用甲苯?jīng)_洗，風干。

1.2.2 表面元素分析

分析條件：使用帶單色器鋁靶X射線源(1486.69 eV)，功率為225 W (工作電壓15 kV，發(fā)射電流15 mA)。污染碳(內(nèi)標)為284.8 eV，作為基準電荷位移校正；能量分析器通能為150 eV。最小能量分辨率為0.48 eV(Ag3d5/2)，使用的是Avantage數(shù)據(jù)分析軟件。

1.2.3 DPI分析

將DAPTMS修飾后芯片安裝于DPI依次用80%乙醇和超純水進行校準，用20 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.4)平衡至基線水平，然后將溶菌酶溶液(0.5 mg/mL，20 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液，pH 7.4)以30 μL/min的流速上樣1 min，再以20 μL/min的流速上樣，上樣體積為532 μL，用20 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.4)平衡，再用含有1 mol/L NaCl的磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.4，20 mmol/L)進行洗脫。再用0.1 mol/L的NaOH 的磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.4，20 mmol/L)徹底清洗。再用細胞色素C、糜蛋白酶、BSA及免疫球蛋白(0.5 mg/mL，20 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液，pH 7.4)重復上述操作。

2 結(jié)果與討論

2.1DAPTMS修飾DPI芯片的表征

實驗采用XPS分析了DAPTMS修飾前后DPI芯片表面的元素組成。如表1所示，未修飾的DPI芯片表面N元素百分比為0.98%，而修飾后的芯片表面N元素增加至2.55%，O元素的表面百分比也有明顯的變化，從50.15%變?yōu)?2.98%，表明DAPTMS修飾改變了DPI芯片的表面元素組成。在修飾后的DPI芯片表面發(fā)現(xiàn)了N1s信號峰，其結(jié)合能為399.4 eV，與-NH2中N1s結(jié)合能對應，表明芯片表面出現(xiàn)了DAPTMS含有的-NH2官能團。修飾后的DPI芯片表面上C1s信號峰出現(xiàn)在結(jié)合能284.8 eV和286.26 eV位置，分別與DAPTMS中的C-C和C-N鍵對應，表明芯片表面出現(xiàn)了DAPTMS中的C-C和C-N鍵。這些結(jié)果說明經(jīng)過DAPTMS修飾處理后，DAPTMS分子成功偶聯(lián)在DPI芯片表面。修飾后的芯片表面Si2p信號峰在98.9 eV沒有出現(xiàn)，在102.2 eV出現(xiàn)，說明在DAPTMS與芯片表面的Si-OH之間形成了Si-O鍵，結(jié)合在芯片表面。在進行XPS檢測時，每個芯片上取不同部位進行分析，得到的結(jié)果一致，說明修飾的氨基硅烷分布均勻。

表1 DAPTMS修飾前后DPI芯片表面的元素組成

2.2不同配基密度DPI芯片的制備

通過改變DAPTMS濃度和修飾時間，制備不同配基密度的DPI芯片。直接表征DPI 芯片上DEAE 配基密度存在很大難度，為此采用基于XPS 的N元素含量進行配基密度表征，結(jié)果見表2，N元素在1%～2.5%范圍內(nèi)可調(diào)。實際上采用DPI 芯片上配基的間距(nm)表征配基密度更為合理，但由于目前缺乏基于XPS 的N元素比例計算配基間距的方法，暫時使用XPS 測定結(jié)果表征密度。

表2 不同修飾條件對配基密度的影響

2.3溶菌酶在界面上的吸附行為

為研究蛋白質(zhì)在界面上的吸附行為，選擇了DPI方法檢測吸附在DPI芯片上的蛋白質(zhì)，獲得吸附蛋白質(zhì)厚度、密度和質(zhì)量的實時數(shù)據(jù)[13]。與高基底表面要求的表面等離子共振法、高表面平整度要求的橢圓偏振光法或難以用于蛋白質(zhì)動態(tài)結(jié)構(gòu)變化和定量分析的原子力顯微鏡法相比，DPI方法通過檢測雙偏振光干涉信號的變化，獲取界面上蛋白質(zhì)吸附層的平均厚度、密度和質(zhì)量的實時值，精度可達亞原子級，同時DPI 的硅片成分是SiO2，與硅膠基質(zhì)的層析介質(zhì)的表面更為接近。因此，選擇DPI方法研究蛋白質(zhì)在DAPTMS修飾后DPI芯片上的吸附行為，通過儀器獲得蛋白質(zhì)在芯片上的厚度、密度、質(zhì)量、單分子面積、吸附量等實時數(shù)據(jù)，探索離子交換配基密度對吸附行為的影響。

通過DPI方法測定溶菌酶在不同配基密度芯片表面上的吸附行為(圖1)，結(jié)果表明隨著配基密度的增加，溶菌酶的吸附量增加，初始吸附速率增大，吸附速率常數(shù)升高，配基密度對溶菌酶的吸附過程影響十分顯著。同時配基密度影響了溶菌酶在界面上的吸附形態(tài)(表3)，例如在pH 7.4條件下溶菌酶為4.5 nm×3.0 nm×3.0 nm的近橢球形分子[14]，在N%=2.29的DPI芯片上，溶菌酶的吸附量最高，可達1.63 ng/nm2，單個溶菌酶分子所占面積為1469.93?2，吸附層厚度為2.21 nm，溶菌酶較為接近自然狀態(tài)，而在N%=1.08的DPI芯片上，單個溶菌酶分子所占面積為6159.2?2，吸附層厚度為0.88 nm，溶菌酶在該芯片上吸附層厚度遠低于其分子直徑，表明溶菌酶被吸附后其結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，結(jié)構(gòu)呈“餅狀”，可能是由于溶菌酶在界面上形成了多位點吸附，分子被拉伸。

表3 溶菌酶吸附行為結(jié)果

圖1 溶菌酶DPI實時圖

Fig 1 The measured data of lysozyme by DPI

2.4細胞色素C在界面上的吸附行為

通過DPI方法測定細胞色素C在不同配基密度芯片表面上的吸附行為(圖2)，結(jié)果表明隨著配基密度的增加，細胞色素C的吸附量增加，初始吸附速率增大，吸附速率常數(shù)升高，配基密度對細胞色素C的吸附過程影響十分顯著。同時配基密度影響了細胞色素C在界面上的吸附形態(tài)(表4)，例如在pH 7.4條件下細胞色素C為4.5 nm×3.5 nm×2.5 nm的扁平梭形分子[14]，在N%=2.14的DPI芯片上，細胞色素C的吸附量最高，可達0.64 ng/nm2，單個細胞色素C分子所占面積為4072.15?2，吸附層厚度為1.48 nm，細胞色素C在該芯片上吸附層厚度小于其自然狀態(tài)的分子直徑，結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，結(jié)構(gòu)呈“餅狀”，而在N%=1.08的DPI芯片上，單個細胞色素C分子所占面積為6159.2?2，吸附層厚度為0.75 nm，細胞色素C在該芯片上吸附層厚度遠低于其分子直徑，結(jié)構(gòu)呈“餅狀”，分子形變程度更大。

圖2 細胞色素CDPI實時圖

N%單分子所占面積(?2)厚度(nm)吸附量(ng/mm2)1.086159.20.750.361.316993.731.210.602.144072.151.480.64

圖3 糜蛋白酶DPI實時圖Fig 3 The measured data of chymotrypsin by DPI

2.5糜蛋白酶在界面上的吸附行為

通過DPI方法測定糜蛋白酶在不同配基密度芯片表面上的吸附行為(圖3)，結(jié)果表明隨著配基密度的增加，糜蛋白酶的吸附量增加，初始吸附速率增大，吸附速率常數(shù)升高，配基密度對糜蛋白酶的吸附過程影響十分顯著。同時配基密度影響了糜蛋白酶在界面上的吸附形態(tài)(表5)，例如在pH 7.4條件下糜蛋白酶水力學半徑為3.387 nm[15]，在N%=2.14的DPI芯片上，糜蛋白酶的吸附量最高，可達0.98 ng/nm2，單個糜蛋白酶分子所占面積為4226.62?2，吸附層厚度為3.00 nm，糜蛋白酶在該芯片上吸附層厚度接近其自然狀態(tài)的分子半徑，說明其空間結(jié)構(gòu)變化較小，而在N%=1.37的DPI芯片上，吸附層厚度為0.14 nm，糜蛋白酶在該芯片上吸附層厚度遠低于其分子直徑，結(jié)構(gòu)呈“餅狀”，分子被多位點吸附，形變程度嚴重。

表5 糜蛋白酶吸附行為結(jié)果

2.6牛血清白蛋白在界面上的吸附行為

通過DPI方法測定牛血清白蛋白在不同配基密度芯片表面上的吸附行為(圖4)，結(jié)果表明隨著配基密度的增加，牛血清白蛋白的吸附量增加，初始吸附速率增大，吸附速率常數(shù)升高，配基密度對牛血清白蛋白的吸附過程影響十分顯著。同時配基密度影響了牛血清白蛋白在界面上的吸附形態(tài)(表6)，例如在pH 7.4條件下牛血清白蛋白為14 nm×4 nm×4 nm的橢球形分子[16]，在N%=2.14的DPI芯片上，牛血清白蛋白的吸附量最高，可達0.82 ng/nm2，單個牛血清白蛋白分子所占面積為13850.3?2，吸附層厚度為2.99 nm，牛血清白蛋白在該芯片上吸附層厚度接近其自然狀態(tài)的分子直徑，結(jié)構(gòu)近似自然狀態(tài)，而在N%=1.37的DPI芯片上，牛血清白蛋白吸附層厚度為0.87 nm，吸附層厚度遠低于其分子直徑，結(jié)構(gòu)呈“餅狀”，發(fā)生多位點吸附，分子形變程度嚴重。

圖4 牛血清白蛋白DPI實時圖

N%單分子所占面積(?2)厚度(nm)吸附量(ng/mm2)1.37NANANA1.57NA0.870.062.1413850.32.990.82

2.7免疫球蛋白在界面上的吸附行為

通過DPI方法測定免疫球蛋白在不同配基密度芯片表面上的吸附行為(圖5)，結(jié)果表明隨著配基密度的增加，免疫球蛋白的吸附量增加，初始吸附速率增大，吸附速率常數(shù)升高，配基密度對免疫球蛋白的吸附過程影響十分顯著。同時配基密度影響了免疫球蛋白在界面上的吸附形態(tài)(表7)，例如在pH 7.4條件下免疫球蛋白水力學直徑為11.02 nm[17]，在N%=2.14的DPI芯片上，免疫球蛋白的吸附量最高，可達2.90 ng/nm2，單個免疫球蛋白分子所占面積為9159.06?2，吸附層厚度為6.35 nm，免疫球蛋白在該芯片上吸附層厚度小于其自然狀態(tài)的分子直徑，結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，結(jié)構(gòu)呈“餅狀”，而在N%=1.08的DPI芯片上，單個免疫球蛋白分子所占面積為337457?2，吸附層厚度為0.64 nm，吸附層厚度遠低于其分子直徑，分子形變程度更大。

圖5 免疫球蛋白DPI實時圖

N%單分子所占面積(?2)厚度(nm)吸附量(ng/mm2)1.083374570.640.081.31NA5.120.332.149159.066.352.90

2.8配基密度對蛋白吸附行為的影響

蛋白質(zhì)在界面上的吸附行為受多種因素影響，而本研究所使用的蛋白質(zhì)濃度、溶液環(huán)境、上樣條件等均相同，因此界面配基密度是影響蛋白質(zhì)吸附的主要因素。蛋白質(zhì)通過泵導入DPI芯片進行吸附，然后用20 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.4)淋洗掉非穩(wěn)定吸附的蛋白，實現(xiàn)蛋白質(zhì)穩(wěn)定吸附在芯片上的目的。在研究過程中發(fā)現(xiàn)，5種蛋白質(zhì)的吸附過程表現(xiàn)較為統(tǒng)一，均呈現(xiàn)迅速吸附，然后趨于平穩(wěn)，最后由于緩沖液的沖洗，表面吸附不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)被洗掉，只留下吸附在芯片表面的蛋白質(zhì)。對于同一種蛋白，配基密度增大，蛋白的吸附速率變快，吸附量增加，同時，蛋白質(zhì)在芯片上吸附層的厚度也隨著配基密度發(fā)生變化，表明同種蛋白配基密度直接影響其吸附速率、吸附量及界面吸附形態(tài)。

實驗中所用的溶菌酶、細胞色素C、糜蛋白酶、牛血清蛋白和免疫球蛋白作為模型蛋白質(zhì)。糜蛋白酶是全部β-折疊的蛋白質(zhì)，結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定；溶菌酶是由部分α-螺旋和部分β-折疊的蛋白質(zhì)，結(jié)構(gòu)較糜蛋白酶穩(wěn)定；但溶菌酶、細胞色素C 和糜蛋白酶3種模型蛋白的分子量較低，為此實驗增加了分子量相對較高的牛血清蛋白和免疫球蛋白。5種蛋白質(zhì)在分子尺寸和質(zhì)量上均有差別，在同一氨基硅烷密度的芯片上，5種蛋白質(zhì)的吸附情況也各有不同。在離子交換層析過程中，生物大分子的色譜保留行為是非常復雜的過程。因為在蛋白質(zhì)和酶等生物大分子的吸附過程中，除了靜電相互作用外，大分子的形狀、氫鍵、大分子與吸附表面的疏水作用和大分子表面電荷分布等都對離子交換層析產(chǎn)生很大的影響。所以推測在同一氨基硅烷密度的芯片上造成吸附狀態(tài)不同的應該是蛋白質(zhì)本身的性質(zhì)。

同一蛋白質(zhì)在不同氨基硅烷密度的DPI 芯片上的結(jié)果顯示，氨基硅烷的密度會對同一種蛋白質(zhì)的吸附行為產(chǎn)生影響。其中，對吸附速率常數(shù)影響較大的蛋白質(zhì)是免疫球蛋白、細胞色素C 和牛血清蛋白。而對于溶菌酶和免疫球蛋白來講，氨基硅烷密度對蛋白質(zhì)的吸附量影響也頗大，這可能是由于蛋白質(zhì)分子在芯片表面的吸附狀態(tài)不同造成的?？梢姲被柰樾揎椥纬傻呐浠芏葧绊懙鞍踪|(zhì)的吸附行為，也是影響蛋白質(zhì)變性的關(guān)鍵因素。

3 結(jié)論

采用DPI研究了溶菌酶、細胞色素C、牛血清蛋白、免疫球蛋白和糜蛋白酶在不同密度DAPTMS配基DPI芯片上的吸附行為，對于新型層析介質(zhì)研發(fā)以及深入理解蛋白質(zhì)在介質(zhì)表面上的失活機理具有理論意義和實用價值。蛋白質(zhì)在實驗所用芯片界面上可能發(fā)生了多位點吸附，多位點吸附導致蛋白質(zhì)分子所占面積增加，空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。配基密度是影響蛋白質(zhì)吸附穩(wěn)定性的關(guān)鍵因素，不僅影響界面上蛋白質(zhì)吸附量，而且影響空間結(jié)構(gòu)和表面吸附行為。

參考文獻:

[1]Janson J C. Protein purification: principles， high-resolution methods， and applications [M]. Wiley-VCH, 1998.

[2]李 明， Janson J C， 蘇志國. 蛋白質(zhì)在層析過程中的失活與復性 [J]. 化工學報， 2004， 55(7)：1033-1040.

[3]Dismer F， Hubbuch J. 3D structure-based protein retention prediction for ion-exchange chromatography[J]. Journal of Chromatography A， 2010，1217(8): 1343-1353.

[4]Gospodarek A M， Hiser D E， O’Connell J P, et al. Unfolding of a model protein on ion exchange and mixed mode chromatography surfaces [J]. Journal of Chromatography A， 2014, 1355:238-252.

[5]Marquesa F S， Silva G L， Thrash M E Jr, et al. Lysozyme adsorption onto a cation-exchanger: mechanism of interaction study based on the analysis of retention chromatographic data [J]. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces， 2014， 122：801-807.

[6]盧慧麗，林東強，朱咪咪, 等. 配基密度和介質(zhì)孔徑對離子交換層析分離蛋白質(zhì)的影響 [J]. 化工進展， 2011， 30: 209-213.

[7]Langford J F Jr， Xu X， Yao Y, et al. Chromatography of proteins on charge-variant ion exchangers and implications for optimizing protein uptake rates [J]. Journal of Chromatography A, 2007, 1163(1/2):190-202.

[8]Franke A， Forrer N， Butté A, et al. Role of the ligand density in cation exchange materials for the purification of proteins [J]. Journal of Chromatography A, 2010, 1217(15):2216-2225.

[9]王 娟，楊秀榮．雙偏振干涉測量技術(shù)在生物分析方面研究應用進展 [J]．分析化學，2008，36(9) : 1293-1299.

[10]馬洪梅， 張貴鋒， 李 春等. 界面上配基種類對 BSA 吸附行為的影響 [J]. 中國生物工程雜志，2012, 32(7):53-59.

[11]Ricard-Blum S, Peel L L, Ruggiero F, et al. Dual polarization interferometry characterization of carbohydrate protein interactions [J]. Analytical Biochemistry, 2006, 352(2): 252-259.

[12]Ho J A, Kuo T Y, Yu L G. Dual polarization interferometric and capillary electrophoretic analysis of supported lipid bilayer constructed on silica-based surface: Evaluation of its anti-protein adsorption effect [J]. Analytica Chimica Acta, 2012, 714:127-133.

[13]Xu Y， Takai M， Ishihara K． Protein adsorption and cell adhesion on cationic， neutral， and anionic 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine copolymer surfaces[J]. Biomaterials, 2009, 30(28) :4930-4938.

[14]Bonincontro A，Bultrini E，Calandrini V, et al. Conformational changes of proteins in aqueous solution induced by temperature in the pre-melting region [J]. Phys Chem Chem Phys， 2001, 3(17):3811-3813.

[15]Aragon S R. Recent advances in macromolecular hydrodynamic modeling [J]. Methods， 2011, 54(1):101-114.

[16]Peters T Jr. Serum albumin [J]. Advancees in Protein Chemistry, 1985, 37:161-245.

[17]Sim S L, He T, Tscheliessnig A, et al. Protein precipitation by polyethylene glycol: A generalized model based on hydrodynamic radius [J]. Journal of Biotechnology, 2012, 157(2): 315-319.

中圖分類號TQ028; O629.73

文獻標識碼A

文章編號2095-1736(2016)02-0039-05

作者簡介:楊小雁，碩士研究生，主要從事界面表征方法研究，E-mail: inezyoung@163.com;通信作者:王明林，教授，主要從事儀器分析方法研究，E-mail: mlwang@sdau.edu.cn;張貴鋒，研究員，主要從事生物大分子分離與分析方法研究，E-mail: gfzhang@ipe.ac.cn。

基金項目:國家青年科學基金(21306205); 863項目(2014AA022109)

收稿日期：2015-06-02；修回日期：2015-06-23

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2016.02.039