橫山水庫春季浮游生物RAPD-DNA指紋與物種組成關(guān)系分析

張清科， 楊亮杰， 盛 樟， 劉 濤, 范春波， 竺俊全

(1. 寧波大學 教育部應(yīng)用海洋生物技術(shù)重點實驗室， 寧波 315211；

2. 寧波市原水集團有限公司橫山水庫分公司， 寧波 315511)

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橫山水庫春季浮游生物RAPD-DNA指紋與物種組成關(guān)系分析

張清科1， 楊亮杰1， 盛 樟1， 劉 濤2, 范春波2， 竺俊全1

(1. 寧波大學 教育部應(yīng)用海洋生物技術(shù)重點實驗室， 寧波 315211；

2. 寧波市原水集團有限公司橫山水庫分公司， 寧波 315511)

摘 要2013年4月，對浙江橫山水庫4個站位12個采樣點的浮游生物群落進行了DNA多態(tài)性的RAPD指紋分析和種類組成鑒定，并通過聚類分析探討了DNA指紋拓撲結(jié)構(gòu)與物種組成對應(yīng)關(guān)系。結(jié)果表明：篩選出的12條隨機引物共獲得87條長度在120～1 700 bp的譜帶，多態(tài)率為87.4%；各站位平均有56.2條譜帶，其中1號站位下層最多為63條，4號站位中層最少為50條；共觀察到64種浮游生物，其中4號站位的上層采樣點種類最多為27種，3號站位上層最少為16種，其它各采樣點在17～25種不等，12個采樣點均出現(xiàn)的種類有曲殼藻、卷曲纖維藻、小球藻、細膠鞘藻和簡殼蟲?；谖锓N組成與RAPD的系統(tǒng)聚類分析，可以將12個采樣點的浮游生物群落劃分為兩大類。表明橫山水庫春季浮游生物群落DNA指紋結(jié)構(gòu)與物種組成密切相關(guān)。

關(guān)鍵詞橫山水庫；RAPD；DNA指紋結(jié)構(gòu)；浮游生物；物種組成

Analysis of relationship between DNA fingerprinting by RAPD and species of spring plankton in Hengshan reservoir

ZHANG Qing-ke1, YANG Liang-jie1, SHENG Zhang1,LIU Tao2, FAN Chun-bo2, ZHU Jun-quan1

(1. Key Laboratory of Applied Marine Biotechnology, Ministry of Education, Ningbo University, Ningbo 315211;2. Ningbo Raw Water Group Co., Ltd. Hengshan Reservoir Branch, Ningbo 315511, China)

Abstract The RAPD fingerprinting based on the DNA polymorphism of the plankton communities at 12 sampling points from 4 stations in Hengshan Reservoir, Zhejiang, was analyzed and the species were identified in April 2013. The relationship between topological structure of DNA fingerprinting and species was discussed by the cluster analysis. The results showed that 87 bands with the length ranging from 120 to 1700 bp were gained from 12 screened random primers, and the polymorphic rate was 87.4%. On average, 56.2 bands were observed from each station. A maximum number of 63 bands were observed from the lower level of station 1 and a minimum of 50 bands were observed from the middle level of station 4. Sixty-four kinds of planktons were identified from 4 stations with the maximum number of 27 in the upper level of station 4 and the minimum of 16 in the upper level of station 3. 17-25 kinds of planktons were observed from other stations.Achnanthessp.,Ankistrodesmusconvolutus,Chlorellavulgaris,PhormidiumtenueandTintinnidiumsp. were all detected from 12 sampling points. The plankton communities from 12 sampling points can be divided into two types by systematic cluster analysis based on the species and RAPD. This study reveals a close relationship between the DNA fingerprinting structure of the plankton community and species in Hengshan Reservoir.

KeywordsHengshan Reservoir; RAPD; DNA fingerprinting structure; plankton; species

浮游生物是水域生態(tài)系統(tǒng)中一類極重要的生物，其個體小、數(shù)量大、種類組成復(fù)雜，是生物多樣性的重要組成部分，在水生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)轉(zhuǎn)化、能量流動及信息傳遞等過程中起至關(guān)重要作用[1, 2]；浮游生物被認為是衡量水質(zhì)及水生態(tài)系統(tǒng)狀況的重要指標[3]。一直以來，浮游生物群落生態(tài)研究大多基于傳統(tǒng)的定性(形態(tài)學特征的種類鑒定)及定量分析方法。近年來，隨著DNA等分子標記技術(shù)應(yīng)用到浮游生物群落結(jié)構(gòu)的研究中，與傳統(tǒng)方法取得的研究結(jié)果相互印證，從而加深了對浮游生物群落多樣性的認識[4-7]。

橫山水庫位于甬江流域奉化江支流上游，總庫容1.11×109m3，是寧波市重要的飲用水水源地。近年來，為了確保水庫供水安全，加強了對庫區(qū)污染源的治理，并采取了凈水生態(tài)漁業(yè)技術(shù)措施調(diào)控庫水環(huán)境。我們已經(jīng)對該水庫的浮游生物群落結(jié)構(gòu)及水質(zhì)理化特性進行了初步研究[8, 9]。本研究利用RAPD技術(shù)分析橫山水庫春季(4月)浮游生物群落DNA多態(tài)性，探討浮游生物DNA指紋結(jié)構(gòu)與物種組成關(guān)系，為水庫水環(huán)境分子生物學評價體系的建立積累資料和提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1采樣點設(shè)置

在橫山水庫設(shè)置4個采樣站位：1)上游2(1#，29°33′11.48″N，121°20′19.63″E)；2)庫中(2#，29°34′7.32″N，121°20′8.77″E)；3)壩前(3#，29°34′28.34″N，121°21′13.98″E)；4)上游1(4#，29°33′52.32″N，121°19′37.48″E)，見圖1。每站位設(shè)上(0.5 m)、中(5 m)、下(10 m)3個采樣水層，共12個采樣點。

圖1 橫山水庫采樣站位分布

1.2浮游生物樣品采集與處理

2013年4月，各采樣點用2.5 L采水器分別采水樣2次，混合后用25號浮游生物網(wǎng)(北京普力特儀器有限公司)過濾濃縮至100 mL，置于250 mL采樣瓶中，加甲醛(5%)固定。

1.3浮游生物種類鑒定

參照《淡水浮游生物圖譜》[10]與《淡水微型生物圖譜》[11]，對樣品中的浮游生物進行顯微觀察與種類鑒定。

1.4RAPD分析

1.4.1樣品的預(yù)處理

浮游生物樣品經(jīng)充分混勻后，各取50 mL于培養(yǎng)皿中沉淀1 h，然后用鑷子除去水中雜質(zhì)，8 000 r/min離心5 min；將沉淀物移入一新的微量離心管中，用滅菌雙蒸水清洗3次，每次清洗后8 000 r/min離心3 min，以去除黏附于浮游生物表面的水溶性雜質(zhì)和細菌。

1.4.2總DNA的提取

DNA的提取參照宋曉紅等[12]的方法，生物體沉淀物中加入600 μL裂解液(4%SDS，250 mmol/L Tris-Cl，pH 8；60 mmol/L Na2EDTA和0.12 mg/mL Proteinase K)，于室溫下裂解1 h后，6 500 r/min離心10 min；將上清液轉(zhuǎn)入另一離心管中，經(jīng)等體積酚抽提后，再用酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)抽提一次。加入2/3體積的冷異丙醇沉淀3 h，13 000 r/min離心10 min、空氣中干燥5 min，然后，用70 %冷乙醇清洗沉淀2次，待干燥后懸于600 μL TE中，于-20℃貯存?zhèn)溆谩λ崛】侱NA用0.7%的瓊脂糖凝膠(含0.15 μL/mL的EB)進行電泳，評估制備效果，用BECK2MAN DU530DNA/Protein Analyzer測定DNA濃度與純度(D260 nm、D280 nm值及其比值D260 nm/D280 nm)。

1.4.3RAPD擴增

首先以1號站位上層浮游生物群落DNA為模板，經(jīng)對DNA模板量、引物濃度、Mg2+濃度及PCR循環(huán)參數(shù)優(yōu)化后，從20條隨機引物中篩選出擴增結(jié)果穩(wěn)定、譜帶清晰、多態(tài)性好的12條引物(表1)，對12個采樣點的DNA模板進行RAPD擴增。擴增體系參照顏慶云等[5, 6]的方法，擴增反應(yīng)總體積為26 μL，其中10×buffer 2.5 μL、25 mmol/L MgCl22 μL、2 mmol/L dNTP 1.5 μL、1.5 ng/μL引物1 μL、5 u/μL Taq酶0.4 μL、模板DNA 2 μL(約40 ng，12個點基本保持一致)，ddH2O 16.6 μL。充分混勻后稍離心將反應(yīng)液集中于管底，在PCR儀上進行擴增，反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性10 min; 94℃變性40 s，37℃退火40 s，72℃延伸120 s，共45個循環(huán); 最后于72℃延伸10 min。以1.4%的瓊脂糖凝膠(含0.5 μg/mL的EB)對擴增產(chǎn)物進行電泳(每個樣品取5.0 μL)，Image UVP凝膠處理系統(tǒng)檢測RAPD擴增結(jié)果并拍照。各RAPD擴增至少重復(fù)2次，穩(wěn)定、清晰的譜帶用于最終的數(shù)據(jù)分析。

1.5數(shù)據(jù)處理

根據(jù)100 bp DNA Ladder(捷瑞生物工程公司提供)指示的標準分子量，對照擴增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上的遷移率和UVP Lab Works 軟件的光密度掃描曲線，依據(jù)統(tǒng)一的標準確定各擴增片斷的大小。對擴增條帶數(shù)據(jù)和浮游生物種類數(shù)據(jù)進行處理，以1、0代表擴增位點與物種的有、無，數(shù)據(jù)輸入SPSS17.0 軟件程序，采用Ward’s方法進行系統(tǒng)聚類分析。

表1 隨機引物及RAPD擴增結(jié)果

2結(jié) 果

2.1浮游生物群落物種組成

各采樣點浮游生物群落物種組成如表2。12個采樣點共觀察到64種浮游生物，其中硅藻門8種、綠藻門21種、藍藻門2種、隱藻門3種、裸藻門1種、輪蟲8種、枝角類1種、橈足類2種、原生動物18種。4號站位上層種類數(shù)最多、為27種，3號站位上層種類數(shù)最少、為16種，其它各采樣點在17～25種不等。在12個采樣點均出現(xiàn)的種類有曲殼藻、卷曲纖維藻、小球藻、細膠鞘藻和簡殼蟲，此外分布概率高于50%的還有顆粒直鏈藻、美麗星桿藻、針桿藻、四刺頂棘藻、四尾柵藻、衣藻、卵形隱藻、嚙蝕隱藻、尖尾藍隱藻、晶囊輪蟲、針簇多肢輪蟲、無節(jié)幼體和櫛毛蟲等。

表2 浮游生物群落物種組成

“+”代表出現(xiàn)，空白表明沒有出現(xiàn)。

2.2浮游生物群落總DNA

本實驗所用方法獲得的DNAD260 nm/D280 nm值在1.55～1.79，表明該方法提取的浮游生物群落總DNA在純度上符合PCR的要求。

2.3浮游生物群落DNA指紋

RAPD-DNA電泳圖譜較為清晰(圖2)，12條隨機引物共獲得87條長度在120～1 700 bp的譜帶，其中87.4%的條帶為多態(tài)性帶，12.6%的譜帶為特有帶(僅出現(xiàn)在1個站點)，見表1。在12個采樣點均出現(xiàn)的共有帶有27條，占31.03%；各站位的平均譜帶數(shù)為56.2條，其中1號站位下層最多為63條，4號站位中層最少為50條(表3)。

表3 各采樣點RAPD擴增條帶數(shù)

圖2 OPG -18引物RAPD電泳圖譜

Fig 2 RAPD profile generated using random primer OPG-18

2.4聚類分析

基于RAPD指紋分析的系統(tǒng)聚類圖顯示(圖3A)，4號站位中層與4號站位下層首先聚為一類，再與3號站位中層和3號站位下層合成的一支在距離8附近聚為一類，再與2號站位中層和2號站位下層合成的一支在距離10附近聚為一支，然后與3號站位上層和4號站位上層合成的一支在距離16附近聚為一大支；1號站位中層與1號站位下層、1號站位上層與2號站位上層分別聚為一支后在距離13附近合成一大支；最后兩大支在距離25附近合成一大類。物種組成分析的聚類結(jié)果(圖3B)與RAPD分析的聚類結(jié)果相似，12個采樣點浮游生物群落同樣可以分成明顯的兩支，3號站位上層、3號站位中層、3號站位下層、4號站位下層、2號站位下層同在一大支，同時1號站位上層、1號站位中層和2號站位上層同在一大支，最終兩大支在距離25附近聚為一大類。

圖3 橫山水庫各采樣點浮游生物群落相似性聚類

A：基于RAPD標記Based on RAPD markers； B：基于物種組成Based on species composition。 Label：采樣點; Num：樣點序號。

3討 論

隨機擴增DNA多態(tài)性指紋技術(shù)(RAPD)具有操作簡便、實驗成本低，可在不需預(yù)知模板DNA序列信息的情況下，利用多個較短的隨機引物通過PCR擴增基因組DNA的任意部分，從而對整個群落進行描繪等優(yōu)點，而被應(yīng)用于浮游生物遺傳多樣性的研究中[13-15]。理論上講，由于各物種的遺傳背景不同，具有相似物種組成的生物群落應(yīng)該有相似的DNA指紋圖譜，反之也可以通過DNA指紋圖譜來反映群落結(jié)構(gòu)[5, 7]。當然，RAPD也存在重復(fù)性不夠好的缺點，但這可以通過條件的優(yōu)化來適當?shù)丶右钥刂芠7]。為保證重復(fù)性，我們對DNA模板量、引物濃度、Mg2+濃度及PCR循環(huán)參數(shù)等條件進行優(yōu)化組合，在篩選出穩(wěn)定性好、多態(tài)性高、譜帶清晰的引物后獲得了較為理想的指紋圖譜。

本研究通過RAPD指紋分析，共獲得的87條譜帶中有87.4%為多態(tài)性帶，12.6%為特有帶，共有條帶有27條，占31.03%。從物種組成來看，曲殼藻等5種浮游生物為12個采樣點共有種類，占總物種數(shù)的7.8%，顆粒直鏈藻等13種浮游生物在一半以上的采樣點出現(xiàn)，占20.3%。因此，從形態(tài)鑒定的結(jié)果來看，各采樣點的物種組成差別不大。從聚類分析來看，基于RAPD標記與基于種類組成標記的聚類都將4號站位下層、2號站位下層、3號站位上層、3號站位中層、3號站位下層聚為一類，將1號站位上層、1號站位中層、2號站位上層聚為一類，可以看出浮游生物群落RAPD指紋與物種組成的聚類分析關(guān)系是基本一致的。在基于RAPD標記的聚類結(jié)果中，1號站位的中層與下層、2號站位中層與下層、3號站位中層與下層、4號站位的中層與下層分別聚為一支后，2、3、4號站位的中下層再合為一大支，表明橫山水庫水體中層與下層分層不明顯，其浮游生物組成較為相似。而1號站位的上中下層聚為同一支，可能是由于1號站位其水深較淺，且其位于水庫入水口，水體上下混合更為充分。在基于物種組成的聚類中，2號站位的上層與4號站位的上層，2號站位的中層與4號站位的中層首先分別聚為一支，再與1號站位的上層與中層共同聚為一大支，這主要是由于2號站位與4號站位其樣點空間距離較近，物種組成更為相近。同時3號站位的上、中、下3層在兩種聚類結(jié)果中都歸于同一支中，這表明3號站位相比于其他站位其上、中、下的分層更不明顯，這可能是由于3號站位位于大壩口，其水體上下混合程度較高。然而1號站位下層、2號站位中層、4號站位中層、4號站位上層在兩種聚類結(jié)果中被分在了不同的類別中，并且各采樣點的物種數(shù)目與RAPD譜帶數(shù)目的相關(guān)系數(shù)為-0.53，呈現(xiàn)一定的負相關(guān)性，其可能原因是由于物種信息的缺失，基于形態(tài)鑒定的傳統(tǒng)分類方法不能充分認識和理解浮游生物群落結(jié)構(gòu)及功能，一些微小的生物如細菌和病毒等未能鑒定，同時本次物種鑒定的樣品為5%甲醛固定后的樣品，原生動物中須在活體下才可以鑒定的裸肉足蟲可能會缺失[16]。

RAPD技術(shù)在浮游生物DNA指紋結(jié)構(gòu)研究中已見較多應(yīng)用實例。余育和等[4]以武漢東湖浮游生物為研究對象，探討了RAPD-DNA指紋在群落級生命系統(tǒng)應(yīng)用的可行性；顏慶云等[6]對洞庭湖浮游生物群落DNA多態(tài)性進行了RAPD指紋分析，得出浮游生物群落DNA指紋與環(huán)境主要限制因子密切相關(guān)；宋曉紅等[12]對武漢東湖5個不同湖區(qū)浮游生物群落DNA多樣性的RAPD分析結(jié)果，與其環(huán)境理化因子密切相關(guān)；吳利等[16]利用RAPD及DGGE技術(shù)分析了湖北牛山湖浮游生物群落的DNA多態(tài)性，并定性地探討了其與物種組成的關(guān)系。這些研究表明水環(huán)境分子生物學評價方法具有一定的可行性。

總之，RAPD-DNA指紋技術(shù)具有技術(shù)路線程序化、比較分析規(guī)范化的特點，在湖泊、水庫生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)與功能研究中具有一定可行性，通過分析浮游生物群落遺傳結(jié)構(gòu)，進而研判所獲得DNA多態(tài)性與物種多樣性的對應(yīng)關(guān)系。這種基礎(chǔ)資料的積累將會為湖泊、水庫生態(tài)系統(tǒng)功能、機理的解釋或闡明提供啟示，也為水環(huán)境分子生物學評價體系的建立積累資料和提供依據(jù)[13, 17，18]。

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中圖分類號Q17;Q178.1

文獻標識碼A

文章編號2095-1736(2016)02-0034-05

作者簡介：張清科，主要從事水庫生態(tài)研究，E-mail:406536705@qq.com；通信作者：竺俊全，教授，主要從事水產(chǎn)生物學研究，E-mail: zhujunquan@nbu.edu.cn。

收稿日期：2015-05-27；修回日期：2015-06-29

資助項目：浙江省水利科技計劃項目(RC1322)；寧波原水集團有限公司技術(shù)開發(fā)項目(HK11101，HK2015000024)

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2016.02.034