純化功能性大豆低聚糖酵母菌的篩選及發(fā)酵特性初步應(yīng)用

陸薇幃，汪立平

(上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海，201306)

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純化功能性大豆低聚糖酵母菌的篩選及發(fā)酵特性初步應(yīng)用

陸薇幃，汪立平*

(上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海，201306)

摘要采用改良的WL培養(yǎng)基，運(yùn)用DNS和HPLC相結(jié)合的方法檢測酵母菌對大豆乳清低聚糖的利用情況，從自然界中篩選和分離出能夠選擇性降解大豆乳清中蔗糖的酵母菌。試驗(yàn)結(jié)果表明，酵母菌PL08對蔗糖具有極強(qiáng)的降解作用，發(fā)酵后所得功能性低聚糖的純度達(dá)到96.70%，是理想的目的菌種。通過18S rDNA序列對比對微生物種屬進(jìn)行鑒定酵母菌PL08為異常威克漢姆酵母(Wickerhamomyces anomalus)。同時(shí)研究了酵母菌PL08發(fā)酵大豆乳清廢水的動(dòng)態(tài)過程表明，發(fā)酵30 h時(shí)，棉籽糖和水蘇糖的保留率分別為87.90%和82.16%，蔗糖的降解率為93.46%，功能性低聚糖的純度達(dá)到94.12%，確定為最適發(fā)酵周期。

關(guān)鍵詞大豆低聚糖；序列分析；酵母菌發(fā)酵

大豆乳清是工業(yè)上生產(chǎn)大豆分離蛋白(SPL)和大豆?jié)饪s蛋白(SPC)的副產(chǎn)物，含有相當(dāng)豐富的大豆低聚糖，但由于處理費(fèi)用高昂等原因多直接排放到外界，對環(huán)境造成嚴(yán)重的污染[1]，如果能夠采取低成本處理再利用方法，將是一個(gè)變廢為寶的過程。大豆低聚糖主要由棉籽糖、水蘇糖和蔗糖組成，其中棉籽糖和水蘇糖是具有功能性的糖類，屬于功能性低聚糖，其功能特性主要表現(xiàn)在：促進(jìn)雙歧桿菌的增殖，防止腹瀉和便秘，改善血清脂質(zhì)的作用，抗腫瘤等[2]。蔗糖為非功能性低聚糖。為了除去蔗糖，提高功能性低聚糖的純度，目前常規(guī)的分離方法[3]有：色譜柱分離法、膜分離法、酶法、微波提取法和酵母發(fā)酵法。

酵母發(fā)酵法即考慮微生物對底物利用的選擇性，篩選出優(yōu)先利用蔗糖、最大限度保留功能性低聚糖的菌種[3]。酵母發(fā)酵法是一種綠色環(huán)保的制備方法，具有方便，周期短，成本低等優(yōu)點(diǎn)，有望投放于工業(yè)化大生產(chǎn)，為實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)方法的簡捷化提供基礎(chǔ)。EGOUNLETY和AWORH[4]通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過發(fā)酵處理的大豆低聚糖，其蔗糖含量降低，棉籽糖的含量則基本穩(wěn)定無變化，但水蘇糖在48 h完全降解。本文主要通過把WL培養(yǎng)基的碳源替換為蔗糖，從自然界分離出可利用蔗糖的酵母菌，進(jìn)一步采用DNS、HPLC相結(jié)合的方法篩選出能夠高強(qiáng)度降解蔗糖而基本不利用功能性低聚糖的酵母菌，并對其鑒定，確定種屬。同時(shí)采用HPLC跟蹤測糖法對不同發(fā)酵時(shí)間各組分糖濃度進(jìn)行分析，根據(jù)非功能性低聚糖最高降解率和功能性低聚糖最高保留率的原則確定最適發(fā)酵周期。

1材料與方法

1.1材料與儀器

1.1.1酵母來源

土壤(葡萄根系周圍)；水果(市售蘋果、生梨、葡萄、桂圓等)。

1.1.2培養(yǎng)基

篩選培養(yǎng)基：改良的WL分離培養(yǎng)基[5]：酵母浸膏5 g，蛋白胨5 g，蔗糖50 g，瓊脂20 g，KH2PO40.55 g，KCl 0.425 g，CaCl20.125 g，MgSO40.125 g，F(xiàn)eCl30.002 5 g，MnSO40.002 5 g，蒸餾水1 000 mL。調(diào)pH值至6.5，121 ℃高壓滅菌20 min后每1 L培養(yǎng)基分別加1 mL儲(chǔ)液A和儲(chǔ)液B。儲(chǔ)液A：0.44 g溴甲酚綠溶于10 mL水和10 mL酒精中；儲(chǔ)液B：250 mg氯霉素溶于10 mL酒精中。

種子培養(yǎng)基：酵母膏3 g，胰蛋白胨10 g，蔗糖20 g，麥芽浸膏3 g，蒸餾水1 000 mL，121 ℃高壓滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：實(shí)驗(yàn)室收集大豆?jié)饪s蛋白乳清，外觀糖濃度8 °Brix，121 ℃高壓滅菌20 min。

1.1.3主要設(shè)備及試劑

3.加快有關(guān)權(quán)證審批，縮短申貸時(shí)限。針對土地、規(guī)劃、環(huán)評等證照審批慢的問題，建議政府有關(guān)部門加快建設(shè)用地、項(xiàng)目規(guī)劃、環(huán)評批復(fù)等審批效率，并加強(qiáng)各環(huán)節(jié)相互銜接，幫助企業(yè)早日達(dá)到融資條件，獲得信貸支持。

DKY控溫調(diào)速搖床，上海杜科設(shè)備公司；Epichemi 3 凝膠成像儀，美國 UVP 公司；Waters 2695-2489 HPLC (示差折光檢測器)，日本waters公司；氨基柱(Hanbon，型號：5 μm，250×4.6 mm)。DP307酵母菌DNA提取試劑盒，天根生物技術(shù)公司；實(shí)驗(yàn)用引物，上海生工生物技術(shù)公司合成。液相用標(biāo)準(zhǔn)品：蔗糖(分析純)，棉子糖(α-A18313)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；水蘇糖(S120981)，上海晶純生化科技股份有限公司，純度均大于98%。

1.2方法

1.2.1酵母菌篩選方法

將預(yù)處理的樣品稀釋涂布于改良的WL培養(yǎng)基上，25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d，觀察菌落顏色及形態(tài)并進(jìn)行革蘭氏染色用于鏡檢，按照顏色及形態(tài)的不同分離酵母菌，記錄并標(biāo)號。將挑選所得的酵母菌于種子培養(yǎng)基中純化，以8%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，每8 h DNS跟蹤測糖，保留樣品進(jìn)行HPLC檢測各組分糖含量。

1.2.2酵母菌的鑒定

DP307試劑盒提取 DNA，采用酵母菌18S rRNA基因引物OY1 (5’-AATAACTTTTCGAATCGCAT-3’)和OY2 (5’-AAGACTTTGATTTCTCGTA-3’)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR體系為30 μL：上下引物各1 μL(50 pmol/μL)，模板DNA 3 μL，Taq mix 15 μL，無菌雙蒸水補(bǔ)齊至30 μL。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。

取3 μL的PCR產(chǎn)物于0.8%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳檢測。將PCR產(chǎn)物純化后送至上海生工生物技術(shù)有限公司測序，將測序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast檢索在線比對分析，并通過 MEGA5 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3目的酵母菌的發(fā)酵方法

種子培養(yǎng)：將目的菌種活化后，轉(zhuǎn)接入種子培養(yǎng)基中，25 ℃、150 r/min培養(yǎng)24 h。

1.2.4分析檢測方法

發(fā)酵液總糖的測定：初篩按照DNS法測定總糖含量[6]。

發(fā)酵液各組分糖的定量測定：高效液相色譜分析法[7]。V(乙腈)∶V(超純水)=70∶30；流動(dòng)相流速：1.00 mL/min；樣品進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：40 ℃；檢測器溫度：40 ℃；檢測時(shí)間20 min。按照外標(biāo)法計(jì)算發(fā)酵液中大豆低聚糖的含量。

酒精含量的測定：采用比重密度法測定。

菌體干重檢測：將發(fā)酵液離心,沉淀用蒸餾水洗滌兩次，所得菌體用2 mL蒸餾水懸浮后移至干燥皿，65 ℃下烘干至恒重，所得凈重即為細(xì)胞干重(g/L)。

2結(jié)果與分析

2.1分離的酵母菌表型特征

WL培養(yǎng)基廣泛用于酵母菌的快速鑒別中[5]。根據(jù)改良WL培養(yǎng)基菌落顏色和菌落形態(tài)，從自然界分離純化出能夠利用蔗糖的19株天然酵母。結(jié)果如表1。革蘭氏染色觀察19株菌落形態(tài)分為紡錘形和橢圓形。

表1　不同酵母菌株的菌落顏色與菌落形態(tài)

2.2DNS法測不同酵母發(fā)酵過程中總糖的變化

將大豆乳清發(fā)酵液水解后，根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算總糖含量并繪制菌體降糖曲線，見圖1，結(jié)果表明，自然界篩選的菌種對大豆乳清低聚糖的利用程度有明顯區(qū)別，有一部分能夠很好的利用大豆乳清廢水中的碳源，其中1號、8號、9號、14號4株菌種隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，總糖濃度明顯降低，具有較強(qiáng)的降糖能力，保留樣液進(jìn)行HPLC色譜分析。

圖1　菌體降糖曲線Fig.1　The curve of saccharide reducing for the yeasts

2.3HPLC法測酵母發(fā)酵過程中各組分糖的變化

根據(jù)圖1 DNS的測定結(jié)果，32 h總糖含量下降穩(wěn)定，采用HPLC外標(biāo)法測定出該時(shí)段4株酵母發(fā)酵液所含蔗糖、棉籽糖、水蘇糖的濃度，如表2。試驗(yàn)結(jié)果表明，1號、14號、9號雖然有明顯的耗糖能力，但對于功能性低聚糖的消耗能力也很強(qiáng)，不符合目的菌種的特性；而8號既可以極大程度的利用大豆乳清廢水中的非功能性成分，利用率達(dá)到96.4%，而對于功能性成分沒有明顯的消耗作用，對棉籽糖和水蘇糖的降解率分別為12%和9.7%，功能性糖的純度高達(dá)96.7%，符合目的菌種的特性，標(biāo)記為PL08。

表2　發(fā)酵32 h各組分糖的含量

2.4真菌 18S rDNA 的PCR擴(kuò)增及測序結(jié)果分析

PCR擴(kuò)增獲得約900 bp的特異性條帶，見圖2。將PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物純化后送上海生工生物技術(shù)公司測序，得到的基因片段序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast檢索，最終結(jié)果為：PL08酵母與異常威克漢姆酵母(W. anomalus)序列相似，同源性為99%。將各序列與其相似度較大的基因序列載入MEGA5中，進(jìn)行多重序列比較分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹的結(jié)果如圖3所示，PL08酵母與異常威克漢姆酵母(KP027011.1)基因相似度為100%。根據(jù)形態(tài)學(xué)及18S rDNA序列比對綜合分析，鑒定PL08為酵母與異常威克漢姆酵母，將該菌株18S rDNA序列上傳到Genbank，得到登陸號KT003715。相關(guān)文獻(xiàn)記載，該菌株是一種兼具了釀酒酵母和產(chǎn)酯酵母雙重特性的功能菌，常用于釀酒工業(yè)，安全無毒，對于以后應(yīng)用到大豆乳清制備功能性低聚糖的安全性提供了保障。

1～5-PL08的PCR產(chǎn)物；6-Marker圖2　目標(biāo)酵母菌PL08提取的18S rDNA的PCR電泳圖Fig.2　Gel electrophoresis analysis of 18S rDNA amplification

圖3　菌株P(guān)L08的 18S rDNA 系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig.3　Phylogenetic trees for 18S rDNA sequence of the strain PL08

2.5大豆乳清發(fā)酵過程分析

進(jìn)行3次平行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，根據(jù)酵母菌PL08純化功能性大豆低聚糖的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，繪制細(xì)胞干重、蔗糖含量、酒精產(chǎn)量隨時(shí)間的變化曲線，如圖4所示。

圖4　酵母菌PL08發(fā)酵大豆乳清主要指標(biāo)變化趨勢Fig.4　The metabolic curves of fermentation process

由圖4可知，6～21 h為對數(shù)生長期，隨著酵母菌PL08的生長，酒精產(chǎn)量逐漸升高，蔗糖大幅度消耗，是純化功能性大豆低聚糖的關(guān)鍵時(shí)期。21 h之后進(jìn)入穩(wěn)定期，細(xì)胞干重基本恒定，酒精產(chǎn)量快速積累，蔗糖含量消耗速率減緩，達(dá)到24 h時(shí)蔗糖含量基本保持穩(wěn)定。

2.6最適發(fā)酵周期的確定

根據(jù)HPLC測得的酵母菌PL08在發(fā)酵過程中蔗糖、棉籽糖、水蘇糖3種主要糖濃度的變化，所繪曲線如圖5所示。由圖5可知，發(fā)酵初始，6 h蔗糖的降解率僅為3.52%，隨著發(fā)酵時(shí)間延長蔗糖含量降低，30 h時(shí)蔗糖濃度低至0.93 mg/mL，降解速率逐步減緩，此時(shí)棉籽糖和水蘇糖的保留率分別為87.90%和82.16%，功能性低聚糖的純度達(dá)到94.12%，蔗糖的降解率為93.46%。 30 h之后，由于糖供應(yīng)量的不足，酵母PL08逐步開始利用功能性低聚糖，直至50 h，蔗糖被完全消耗，降解率達(dá)到100%，但棉籽糖和水蘇糖的保留率僅有9.88%和33.83%，不符合最大程度純化功能性低聚糖的目的，故確定30 h為最佳發(fā)酵周期。

圖5　發(fā)酵過程中各組分糖的變化Fig.5　The curves of the concentration of sugars in fermentation process

3結(jié)論

本研究通過采用改良WL培養(yǎng)基的方法，從自然界篩選出可純化功能性大豆低聚糖的優(yōu)良酵母菌種PL08，所得功能性低聚糖純度達(dá)到96.7%，并通過18S rDNA 序列比對綜合分析鑒定該酵母菌PL08為異常威克漢姆酵母(W.anomalus)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果得，異常威克漢姆酵母菌PL08發(fā)酵大豆乳清30 h就可達(dá)到最佳的純化目的，此時(shí)棉籽糖和水蘇糖的保留率分別為87.90%和82.16%，功能性低聚糖的純度

達(dá)到94.12%，蔗糖的降解率為93.46%。繼續(xù)發(fā)酵跟蹤測糖發(fā)現(xiàn)，酵母菌PL08開始利用功能性低聚糖，其功能性低聚糖的保留率逐漸降低，故為符合高效率純化大豆低聚糖的目的，確定30 h為最佳發(fā)酵周期。綜上，所篩酵母菌PL08異常威克漢姆酵母較目前相關(guān)報(bào)道的文獻(xiàn)，具有純化力強(qiáng)，周期短的特點(diǎn)，此外該酵母菌兼具了釀酒酵母和產(chǎn)酯酵母雙重特性，對于以后應(yīng)用到大豆乳清制備功能性低聚糖的安全性提供了保障。

參考文獻(xiàn)

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Isolation and identification of yeasts for purification of soy oligosaccharides and preliminary application of its fermentation characteristics

LU Wei-wei, WANG Li-ping*

(College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai Engineering Research Center of Aquatic-Product Processing & Preservation, Shanghai 201306, China)

ABSTRACTOne strain of yeast with high consumption ability to sucrose and high retention rate to stachyose and raffinose was isolated from nature through WL medium using DNS combined with HPLC. Rresults showed that strain PL08 had higher utilization ability for sucrose. The consumption rate for sucrose after fermentation reached 96.7%, while it almost could not utilize the raffinose and stachyose, which meet the requirements for the ideal strains. Through 18S rDNA partial gene sequence analysis, the strain PL08 was identified as Wickerhamomycesanomalus. The analysis on dynamic process of soybean whey fermented with yeast PL08 showed that fermentation time of 30h was determined as the optimum fermentation period. At this time point, the retention rate of raffinose and stachyose was 87.76% and 82.07% respectively, and that the degradation rate of sucrose was 93.46%.

Key wordssoybean oligosaccharides; 18S rRNA; yeast fermentation

收稿日期：2015-10-13，改回日期：2015-12-04

基金項(xiàng)目：上海市科委工程中心建設(shè)(11DZ2280300)

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201603029

第一作者：碩士研究生(汪立平教授為通訊作者，E-mail：lpwang@shou.edu.cn)。