鹽脅迫對發(fā)菜胞外多糖結(jié)構(gòu)及其理化性質(zhì)的影響

路苗，陳雪峰，趙秀霞，王寧，王貴春，孫玉姣

(陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，陜西 西安， 710021)

?

鹽脅迫對發(fā)菜胞外多糖結(jié)構(gòu)及其理化性質(zhì)的影響

路苗，陳雪峰*，趙秀霞，王寧，王貴春，孫玉姣

(陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，陜西 西安， 710021)

摘要對液體培養(yǎng)的發(fā)菜細胞進行鹽脅迫處理，研究鹽脅迫對發(fā)菜胞外多糖結(jié)構(gòu)及其部分理化性質(zhì)的影響。提取純化正常及鹽脅迫培養(yǎng)下的發(fā)菜胞外多糖(分別命名為NEPS、YEPS)，測定糖含量、單糖組成、糖苷鍵類型、保濕性、吸濕性、熱穩(wěn)定性等，分析發(fā)菜胞外多糖對鹽脅迫的響應(yīng)。結(jié)果表明：NEPS與YEPS單糖組成種類一致，但含量發(fā)生明顯變化；紅外光譜、高碘酸氧化分析可知，兩者特征吸收峰基本一致，均有β-D-吡喃葡萄糖及糖醛酸，糖苷鍵鍵型主要以1—6為主，可能存在1—2、1—4鍵；原子力顯微鏡觀察顯示NEPS與YEPS的分子微觀結(jié)構(gòu)存在明顯差異，NEPS呈尖錐狀結(jié)構(gòu)，YEPS呈棒狀結(jié)構(gòu)；YEPS的吸濕性及熱穩(wěn)定性均高于NEPS。

關(guān)鍵詞發(fā)菜；胞外多糖；鹽脅迫；化學(xué)結(jié)構(gòu)；理化性質(zhì)

發(fā)菜，學(xué)名發(fā)狀念珠藍細菌(Nostocflagelliforme)，是一種光合自養(yǎng)型陸生藍細菌。發(fā)菜胞外多糖(extracellular polysaccharide, EPS)是發(fā)狀念珠藻分泌到細胞外的長鏈多糖，包裹于細胞及藻絲體外，對細胞起保護作用，使其能抵御外部惡劣的生長環(huán)境。此外，發(fā)菜多糖還具有抗腫瘤、抗病毒、抗氧化等生物活性[1]，具有極高的藥用價值和開發(fā)潛力。

近年來，發(fā)狀念珠藍細菌對逆境脅迫的響應(yīng)備受國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注，藻細胞在逆境脅迫條件下，形態(tài)、功能及抗逆活性物質(zhì)等產(chǎn)生了相應(yīng)變化[2-4]。陳雪峰[5]等研究了發(fā)菜細胞在不同濃度鹽脅迫下胞外多糖的分泌量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)處于0.3 mol/L NaCl脅迫環(huán)境時，EPS的分泌量較正常培養(yǎng)細胞增加了50.3%。本課題重點研究了鹽脅迫對多糖的結(jié)構(gòu)和部分理化性質(zhì)的影響，系統(tǒng)分析比較了2種培養(yǎng)環(huán)境下發(fā)菜多糖的單糖組成、糖苷鍵鍵型、微觀結(jié)構(gòu)及部分物化性質(zhì)(保濕性、吸濕性和熱穩(wěn)定性能)的變化。

1材料與方法

1.1材料與試劑

發(fā)菜，寧夏銀川賀蘭山東部；乙腈，色譜純；BG-110培養(yǎng)基、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)、咔唑、濃硫酸、三氟乙酸(TFA)、單糖標準品、高碘酸鈉、碘酸鈉、二甲基亞砜、殼聚糖、甘油，均為分析純。

1.2儀器與設(shè)備

Waters1525-2487高效液相色譜系統(tǒng)，美國Waters公司；紫外-可見分光光度計，上海美譜達儀器有限公司；VERTE70傅立葉紅外光譜分析儀，德國Bruker公司；SPA400原子力顯微鏡，日本精工株式會社；STA449 F3熱重分析儀，德國Bruker公司。

1.3實驗方法

1.3.1發(fā)菜細胞鹽脅迫處理

無菌條件下離心收集指數(shù)生長末期的發(fā)菜細胞，重新接種于NaCl濃度為0.3 mol/L的BG-110培養(yǎng)液中，對照組不含NaCl，在光照強度60 μmol/(m2·s)，光暗比12∶12，溫度白天25℃，夜晚10℃，連續(xù)培養(yǎng)10 d。發(fā)菜胞外多糖的提取純化參照陳雪峰等[6]的研究方法，培養(yǎng)液離心(10 000 r/min，10 min)去除藻細胞，濃縮上清液，采用Sevage法去除蛋白后加4倍體積分數(shù)95%乙醇沉淀12 h，沉淀物加水溶解后透析48h，干燥得粗多糖。粗多糖經(jīng)DEAE-52離子交換柱層析分離得到多糖純化物，冷凍干燥后用于結(jié)構(gòu)鑒定及理化性質(zhì)測定，正常環(huán)境及鹽脅迫環(huán)境下發(fā)菜胞外多糖純化物分別命名為NEPS、YEPS。

1.3.2總糖及糖醛酸含量分析

以葡萄糖為標準，采用苯酚-硫酸法測定多糖中總糖的含量。以葡萄糖醛酸為標準，采用硫酸-咔唑法測定多糖中糖醛酸的含量[7]。

1.3.3單糖組成分析

采用柱前衍生高效液相色譜法測定發(fā)菜胞外多糖的單糖組成。色譜條件：色譜柱：Waters Symmetry C18(4.6 mm×250 mm，5.0 μm)；流動相：乙腈(A)-0.05 mol/L pH 6.9磷酸鹽緩沖液(B)；洗脫模式：梯度洗脫，時間梯度為0 min→10 min→20 min→35 min→40 min，對應(yīng)流動相體積分數(shù)梯度20%→20%→23%→25%→20%(A)；流速：1 mL/min；柱溫：30℃；檢測波長：245 nm；進樣體積：20 μL。

1.3.4紅外光譜分析

分別稱取NEPS與YEPS樣品，與充分干燥的溴化鉀混合壓片，在4 000～600 cm-1區(qū)間內(nèi)進行紅外光譜掃描。

1.3.5高碘酸氧化分析

參照孫利芹等[8]的研究方法。分別稱取4 mg NEPS與YEPS樣品，溶于4 mL 15 mmol/L的高碘酸鈉溶液中，在低溫、避光條件下進行氧化。間隔12 h取樣，測定223 nm處的吸光值。通過標準曲線計算每摩爾糖基消耗高碘酸的量。同時取樣2.5 mL反應(yīng)液，滴加2滴乙二醇終止反應(yīng)，放置20 min后以溴甲酚紫為指示劑，用0.010 15 mol/L NaOH(用鄰苯二甲酸氫鉀標定)標準液滴定甲酸生成量。

1.3.6原子力顯微鏡觀測

分別配制10 μg/mL 的NEPS、YEPS多糖溶液。大氣環(huán)境中、室溫下采用SPA400多功能掃描探針顯微鏡對發(fā)菜多糖的分子形態(tài)進行掃描觀測。圖像均在contact模式下進行，微懸臂長200 pm，探針為Si3N4，彈性系數(shù)0.2 N/m。AFM圖像的形態(tài)學(xué)特征均采用原子力顯微鏡附帶軟件進行分析。

1.3.7吸濕性測定

參照劉紅輝等[9]的研究方法。將待測樣品及對照品置于真空干燥箱內(nèi)，50℃干燥24 h，準確稱取干燥后的NEPS、YEPS、甘油和殼聚糖30 mg于稱量瓶中，控制環(huán)境溫度20℃，將200 mL飽和NaCl溶液倒入干燥器底部，保持環(huán)境密閉性。每隔10 h稱重1次，計算吸濕率(式1)。

(1)

式中：mn為放置n小時后樣品及稱量瓶總質(zhì)量，mg；mo為放置前樣品及稱量瓶總質(zhì)量，mg；m為樣品的質(zhì)量，mg。

1.3.8保濕性測定

將變色硅膠、待測樣品及對照品置于真空干燥箱內(nèi)，50℃干燥24 h，將200 g變色硅膠放入干燥器底部，控制環(huán)境溫度為20℃。準確稱取干燥后的NEPS、YEPS、甘油和殼聚糖30 mg于稱量瓶中，分別加入2滴蒸餾水充分混勻，放入干燥器中，保持環(huán)境密閉性。每隔10h取出稱重，計算保濕率(式2)：

(2)

式中：mn為放置n小時后樣品、蒸餾水及稱量瓶總質(zhì)量，mg；mo為放置前樣品、蒸餾水及稱量瓶總質(zhì)量，mg；m為樣品與蒸餾水的質(zhì)量，mg。

1.3.9熱穩(wěn)定性測定

采用綜合熱分析儀檢測發(fā)菜胞外多糖樣品的熱力學(xué)特性曲線。測定條件：樣品用量為8 mg，氮氣氛圍中測試，氣體流速20 mL/min；升溫程序為室溫～800 ℃，升溫速率10 ℃/min。

2結(jié)果與分析

2.1鹽脅迫對發(fā)菜胞外多糖化學(xué)結(jié)構(gòu)的影響

2.1.1總糖及糖醛酸含量分析

對不同環(huán)境培養(yǎng)的發(fā)菜胞外多糖理化性質(zhì)分析具體數(shù)據(jù)見表1，結(jié)果表明，NEPS與YEPS的總糖含量分別為73.43%、75.48%，糖醛酸含量分別為6.37%、7.39%。

表1　含量分析

2.1.2單糖組成分析

如圖1所示，NEPS與YEPS均由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖等單糖組成，NEPS單糖對應(yīng)摩爾比為0.71∶0.37∶0.44∶1.53∶1.03∶0.40，YEPS單糖對應(yīng)摩爾比為1.02∶0.48∶0.57∶1.47∶1.40∶0.34。2種培養(yǎng)環(huán)境下的胞外多糖單糖組成種類一致，但對應(yīng)的比例發(fā)生了明顯的變化，鹽脅迫環(huán)境下甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸以及半乳糖的含量明顯高于正常環(huán)境，而葡萄糖與木糖的含量有所降低。有其他藻類的研究證實，微生物胞外多糖的合成分泌與生長環(huán)境有著密切聯(lián)系[10-11]。

2.1.3紅外光譜分析

圖2為2種培養(yǎng)條件下發(fā)菜胞外多糖的紅外光譜圖，其分析結(jié)果示于表2。NEPS與YEPS在4 000～500 cm-1內(nèi)具有多糖性質(zhì)的一般特征吸收， 其中1 630 cm-1處的吸收峰是羧酸離子伸縮振動，可以斷定含有糖醛酸，867 cm-1處是β-D-吡喃葡萄糖的特征吸收峰，該結(jié)論與單糖組成的測定結(jié)果一致[12-14]。

圖1　混合標準單糖(A)、NEPS水解物(B)和YEPS水解物(C)HPLC色譜圖Fig.1　HPLC chromatograms of mixed standard monosaccharides and the hydrolyzate of NEPS and YEPS

圖2　NEPS(A)與YEPS(B)紅外光譜圖Fig.2　The IR spectrum of NEPS and YEPS

吸收波數(shù)/cm-1NEPSYEPS特征官能團振動方式3539/33393552/3405O—H鍵的伸縮振動2923/28462915/2864C—H鍵的伸縮振動16301621CO鍵的伸縮振動14191431C—H鍵的變角振動11451136醇羥基—OH鍵的變角振動867867β-D-吡喃葡萄糖

2.1.4高碘酸氧化反應(yīng)

高碘酸反應(yīng)是一種選擇性氧化反應(yīng)，可以選擇性地斷裂糖分子中連二羥基或三羥基處，產(chǎn)生相應(yīng)多的糖醛、甲醛或甲酸。反應(yīng)定量進行，每斷開1 mol C—C鍵消耗1 mol高碘酸，生成1 mol甲酸消耗2 mol高碘酸。根據(jù)高碘酸氧化標準曲線及樣品高碘酸氧化曲線(圖3)，計算得高碘酸氧化數(shù)據(jù)，結(jié)果列于表3。

由表3可知，低溫下避光處反應(yīng)168 h后，高碘酸氧化反應(yīng)完全， NEPS與YEPS均有甲酸生成，說明存在1-6鍵型，而兩者高碘酸消耗量均大于甲酸生成量的2倍，說明其中有C—C鍵消耗了高碘酸卻不產(chǎn)生甲酸，很有可能存在1—2，1—4鍵型[8]。

圖3　高碘酸鈉消耗量標準曲線(A)與樣品高碘酸氧化曲線(B)Fig.3　The sample curve of periodate oxidation

2.1.5原子力顯微鏡觀測結(jié)果

NEPS與YEPS原子力顯微鏡觀測結(jié)果如圖4所示。圖4-a′是NEPS的3D地形圖， 可看到分子形貌如尖錐狀結(jié)構(gòu)，高度約5～20nm，直徑約50～300 nm。圖4-a中可看到單獨游離于溶液的糖鏈結(jié)構(gòu)，直徑約20 nm，長度約2 000 nm。說明尖錐結(jié)構(gòu)是由多個糖鏈纏繞形成，這可能是由于多糖分子間的相互作用以及糖醛酸形成的鏈間氫鍵所致。YEPS分子形貌呈現(xiàn)棒狀結(jié)構(gòu)，高度約60 nm，長度約1 200～2 000 nm，以及糖鏈旋轉(zhuǎn)纏繞形成的聚集體，未見單獨的糖鏈結(jié)構(gòu)。造成發(fā)菜胞外多糖分子微觀結(jié)構(gòu)差異的原因可能是由于YEPS含有較多的糖醛酸，氫鍵及分子間作用力增大，從而形成更為緊密的聚集體[15]。

表3　高碘酸氧化結(jié)果分析

圖4　NEPS(a-a′)與YEPS(b-b′)AFM圖Fig.4　AFM images of NEPS and YEPS

2.2鹽脅迫對發(fā)菜胞外多糖理化性質(zhì)的影響

2.2.1鹽脅迫對發(fā)菜胞外多糖吸濕性的影響

以甘油和殼聚糖為對照品，考察NEPS、YEPS及對照品的吸濕性能(圖5)。由圖5可知，多糖樣品及甘油的吸濕率在10 h內(nèi)迅速增長，10 h后甘油的吸濕率繼續(xù)增強，30 h后趨于飽和，多糖樣品的吸濕率10 h后基本趨于飽和，殼聚糖吸濕率較弱，維持在5%以下。 50 h，樣品的吸濕率分別為甘油63.6%、YEPS 31.0%、NEPS 15.5%和殼聚糖3.7%。結(jié)果表明，YEPS、NEPS和殼聚糖的吸濕率均明顯小于甘油，而YEPS的吸濕率比NEPS明顯提高。吸濕率的增強與樣品所含親水性基團數(shù)量息息相關(guān)，YEPS吸濕率的增強，說明鹽脅迫處理致使單糖組成發(fā)生變化，增加了糖鏈中親水基團的數(shù)量。

圖5　NEPS、YEPS、甘油、殼聚糖吸濕性能Fig.5　Moisture absorption rate of NEPS,YEPS,glycerin and chitosan

2.2.2鹽脅迫對發(fā)菜胞外多糖保濕性的影響

以甘油和殼聚糖為對照品，考察NEPS、YEPS及對照品的保濕性能(圖6)。由圖6可知，各樣品的保濕率隨著時間的推移而減小，其保濕率大小的順序為：殼聚糖>YEPS>NEPS>甘油。造成這種結(jié)果的原因可能是甘油是小分子，在干燥環(huán)境中其小分子結(jié)構(gòu)限制了其與水結(jié)合的能力。2種發(fā)菜胞外多糖均具有良好的保濕性，保濕率均在40%以上，YEPS保濕率略高于NEPS。

圖6　NEPS、YEPS、甘油、殼聚糖保濕性能Fig.6　Moisture retention rate of NEPS,YEPS,glycerin and chitosan

2.2.3鹽脅迫對發(fā)菜胞外多糖熱穩(wěn)定性的影響

從TG/DTG曲線(圖7)得知，NEPS和YEPS熱分解曲線分為3個階段，兩者具有相似的熱力學(xué)性質(zhì)，但也存在不同之處(表4)。40～170 ℃是降解的第一階段，失重主要是失去多糖物理作用吸附的水分；200～350 ℃是降解的第二階段，樣品在高溫下分子內(nèi)部化學(xué)鍵斷裂，YEPS與NEPS分別于260 ℃、269 ℃達到降解最大速率；700～800 ℃是降解的第三階段，降解結(jié)束后NEPS失重比率明顯高于YEPS，說明鹽脅迫使發(fā)菜胞外多糖結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，具有更高的熱穩(wěn)定性。

圖7　NEPS(A)與YEPS(B)的TG/DTG曲線Fig.7　TG-DTG curves of NEPS(A) and YEPS(B)

單位：%

3結(jié)論

鹽脅迫是存在于干旱、半干旱和灌溉地的一種主要的脅迫形式。藍藻分布范圍極廣，具有很好的耐鹽性，目前已有大量關(guān)于藍藻對鹽脅迫響應(yīng)的報道，但其代謝產(chǎn)物對鹽脅迫的響應(yīng)未見深入研究。本課題以正常環(huán)境和鹽脅迫環(huán)境培養(yǎng)所得的胞外多糖為材料，通過分析發(fā)現(xiàn)兩者單糖種類、糖苷鍵類型等化學(xué)結(jié)構(gòu)基本一致，但單糖組成、微觀結(jié)構(gòu)及部分理化性質(zhì)有明顯的差異。NEPS呈規(guī)則的尖錐狀結(jié)構(gòu)，YEPS則呈棒狀結(jié)構(gòu)，體積約為前者的6～8倍 ，YEPS的吸濕性及熱穩(wěn)定性也高于NEPS。鹽脅迫下的發(fā)菜胞外多糖對環(huán)境產(chǎn)生了一定的響應(yīng)，可見次級代謝產(chǎn)物的合成受到了逆境的影響，產(chǎn)生了相應(yīng)的變化，但逆境下的合成規(guī)律仍需進一步研究，為逆境響應(yīng)機制提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

參考文獻

[1]蘇振宏，王芳，尹美珍，等. 發(fā)狀念珠藻胞外聚合物分離純化及抗肝癌活性初步研究 [J]. 時珍國醫(yī)國藥，2012(11)：2 788-2 789.

[2]郭金英，史明科，趙艷麗，等. 發(fā)狀念珠藍細菌細胞對Cu2+、Cr2+和Pb2+脅迫的響應(yīng) [J]. 微生物學(xué)報，2013，53(6)：553-560.

[3]HAN Pei-pei，SUN Ying，JIA Shi-ru，et al. Effects of light wavelengths on extracellular and capsular polysaccharide production byNostocflagelliforme[J]. Carbohydrate Polymers，2014，105：145-151.

[4]趙學(xué)敏，畢永紅，秦山，等. 發(fā)菜細胞培養(yǎng)物對鹽脅迫的響應(yīng) [J]. 西北植物學(xué)報，2005，25(11)：2 234-2 239.

[5]陳雪峰，王貴春，劉寧，等. 鹽脅迫發(fā)菜胞外多糖的抗氧化活性 [J]. 陜西科技大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2015(01)：122-125+135.

[6]陳雪峰，李一當，賈士儒. 發(fā)菜多糖的提取、純化鑒定及理化特性研究 [J]. 食品與發(fā)酵工業(yè)，2008，34(10)：174-177.

[7]方東軍，趙潤琴，張曉娟. 茯苓多糖的總糖含量及糖醛酸含量測定 [J]. 中醫(yī)藥信息，2011，28(4)：42-44.

[8]孫利芹，王凌，馬翠華，等. 紫球藻多糖化學(xué)結(jié)構(gòu)解析 [J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2012(5)：569-574.

[9]劉紅輝，李敏，汲紅麗，等. 紫球藻胞外多糖抗氧化和保濕性能的研究 [J]. 食品研究與開發(fā)，2014，35(5)：1-5.

[10]BRüLL L P，HUANG Z B，THOMAS-OATES J E，et al. Studies of polysaccharides from threeedible species of Nostoc (Cyanobacteria) with different colony morphologies:structural characterization and effect on the complement system ofpolysaccharides from Nostoc commune [J]. J Phycol，2000，36：871-881.

[11]AVINASH M，BHAVANATH J. Isolation and characterization of extracellular polymericsubstances from micro-algae Dunaliellasalina under salt stress [J]. BioresourceTechnology，2009，100(13)： 3 382-3 386.

[12]梁燕茹，李文權(quán)，劉四光. 自養(yǎng)小球藻硫酸多糖的紅外光譜分析 [J]. 海洋科學(xué)，2007，31(11)：1-4.

[13]CHEN Yin，MAO Wen-jun，YANG Yu-pin， et al. Structure and antioxidant activity of an extracellular polysaccharide fromcoral-associated fungus, Aspergillus versicolor LCJ-5-4 [J]. Carbohydrate Polymers，2012，87(1)：218-226.

[14]閆景坤. 抗氧化型冬蟲夏草胞外多糖的制備、結(jié)構(gòu)與溶液特征研究 [D]. 廣州：華南理工大學(xué)，2010：63-64.

[15]竇佩娟，張靜，呂青青，等. 堿提工藝對茶樹菇多糖形貌特征和構(gòu)象及其生物活性的影響 [J]. 生物加工過程，2013，11(4)：22-30.

Effects of salt stress on structural characteristics and functional properties of extracellular polysaccharide fromNostocflagelliforme

LU Miao, CHEN Xue-feng*, ZHAO Xiu-xia, WANG Ning,WANG Gui-chun, SUN Yu-jiao

(College of Food and Biological Engineering, Shaanxi University of Science and Technology, Xi’an 710021,China)

ABSTRACTNostoc flagelliforme cells were cultured under salt stress to explore the changes in structural characteristics and physicochemical properties of extracellular polysaccharide. Monosaccharide composition, glycoside bond, moisture absorption and moisture resistance changes were discussed to analysis the response of extracellular polysaccharide to salt stress. The results indicated that the monosaccharide composition of NEPS and YEPS changed significantly. IR, periodate oxidation analysis showed that NEPS and YEPS, which were basically the same characteristic absorption peaks, both contained β-D-glucopyranose and uronic acid. Glycoside bond type was mainly dominated 1—6, but 1—2, 1—4 may exist. Atomic force microscopy images showed that there were obvious differences of NEPS and YEPS, the former formed pyramid structure, and the latter formed rod-like structure. YEPS showed better moisture absorption and thermal stability than NEPS.

Key wordsNostoc flagelliforme；extracellular polysaccharide；salt stress；structural characteristics； physicochemical properties

收稿日期：2015-08-28，改回日期：2015-11-04

基金項目：國家青年科學(xué)基金項目(31401633)；陜西科技大學(xué)科學(xué)基金后補助項目(2014XHBZ-10)

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201603021

第一作者：碩士研究生(陳雪峰教授為通訊作者，E-mail：chenxf@sust.edu.cn)。