乳酸菌發(fā)酵脫除大米粉中重金屬鎘的機理

傅亞平，吳衛(wèi)國*，王巨濤

1(湖南農(nóng)業(yè)大學 食品科技學院，湖南 長沙， 410128)　2(長沙好韻味實業(yè)發(fā)展有限公司，湖南 長沙， 410129)

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乳酸菌發(fā)酵脫除大米粉中重金屬鎘的機理

傅亞平1，吳衛(wèi)國1*，王巨濤2

1(湖南農(nóng)業(yè)大學 食品科技學院，湖南 長沙， 410128)2(長沙好韻味實業(yè)發(fā)展有限公司，湖南 長沙， 410129)

摘要以鎘含量為0.647 9 mg/kg的早秈精米為原料，在前期優(yōu)化得到乳酸菌發(fā)酵脫除大米粉中鎘的工藝條件的基礎上，研究了乳酸菌發(fā)酵脫除大米粉中重金屬鎘的機理。采用復配乳酸菌的不同發(fā)酵產(chǎn)物比較分析它們對大米粉中鎘脫除率的影響；在此基礎上，利用不同體積分數(shù)的乳酸和相同pH的不同酸研究乳酸對大米粉中蛋白質含量和鎘脫除率的影響，并揭示了大米粉中蛋白質含量與鎘脫除率之間的關系。乳酸菌發(fā)酵脫除大米粉中的鎘主要是乳酸的作用，而乳酸對大米粉中鎘的脫除作用不僅與酸中H+有關，還可能與乳酸的分子結構有關(乳酸分子中具有α-羥基和羧基等功能性官能團)，乳酸能促進大米粉中蛋白質的溶出，且大米粉中蛋白質含量與鎘脫除率之間呈負相關關系，當大米粉中蛋白質的含量降低時，重金屬鎘的脫除率增加。

關鍵詞鎘；乳酸菌；大米粉；機理；脫除率

大米中重金屬鎘消減方法的研究主要集中在稻米加工技術方面，如礱谷、碾米、浸泡、大米淀粉或大米蛋白的提取技術等。礱谷和碾米方法對鎘的脫除效果不明顯[1]；浸泡、淘洗處理均能在一定程度上降低大米中的鎘含量[2-3]，但鎘的脫除率都較低；后兩者的脫鎘效果較好，但制得的淀粉產(chǎn)品與原淀粉品質相差較大，且淀粉提取率較低[1]。王峰[4]發(fā)現(xiàn)，自然發(fā)酵能顯著降低大米粉中蛋白質和灰分的含量，但沒有對此機理進行探究。大米中的重金屬鎘主要以蛋白質結合態(tài)的形式存在，并且大多分布在蛋白質含量較高的部位[5-6]，而乳酸對大米中的蛋白質有一定的溶出作用[7]。筆者在前期試驗中發(fā)現(xiàn)，復配乳酸菌(植物乳桿菌和戊糖片球菌以體積比2∶1混合)發(fā)酵大米粉能有效脫除其中的重金屬鎘，并對其發(fā)酵工藝條件進行了優(yōu)化[8]。本文在此基礎上，從乳酸菌發(fā)酵的主要代謝產(chǎn)物(乳酸和酶)入手，分別考察了這些代謝產(chǎn)物對鎘脫除率的影響，并對影響大米粉中鎘脫除率的主要成分蛋白質含量進行了研究。

1材料與方法

1.1材料

早秈米(精米，鎘含量為0.647 9 mg/kg，水分質量分數(shù)13.41%)，2013年產(chǎn)于湖南省湘陰縣。

植物乳桿菌(編號：CICC21805)和戊糖片球菌(編號：CICC22737)：由湖南農(nóng)業(yè)大學食品科技學院微生物實驗室提供。

MRS肉湯(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)，胰蛋白酶(EC3.4.21.4, 121 u/mg, 國藥集團化學試劑有限公司)，1 000 μg/mL鎘標準溶液(中國計量科學研究院)，Tris-HCl緩沖液(pH7.0)，乳酸、檸檬酸、蘋果酸、酒石酸、乙酸、草酸均為食品級，磷酸二氫銨、硝酸、高氯酸為優(yōu)級純，鹽酸、氫氧化鈉、氯化鈉、硼酸、三氯乙酸、硫酸銅、硫酸鉀、甲基紅、溴甲酚綠、酚酞都為分析純；試驗用水均為去離子水。

1.2儀器

AA-7000原子吸收分光光度計，島津公司； KDN-103F自動定氮儀，上海纖檢儀器有限公司；5804R 臺式高速冷凍離心機，艾本德股份有限公司；BL92-ⅡDL 超聲波細胞粉碎機，無錫沃信儀器有限公司；SPX-250BS-Ⅱ生化培養(yǎng)箱，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司； TD5A 臺式低速離心機，湖南赫西儀器設備有限公司；DK 電砂浴鍋，北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；明澈-D 24UV 超純水機，Milipore公司。

1.3實驗方法

1.3.1乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)酶、乳酸對大米粉的脫鎘效果和蛋白質含量的影響

乳酸菌懸液的配制：本試驗在前期研究的基礎上，以植物乳桿菌和戊糖片球菌作為試驗菌，首先將乳酸菌進行活化增殖培養(yǎng)，再接種至MRS肉湯培養(yǎng)基中，于37 ℃下恒溫培養(yǎng)24～48 h，直至乳酸菌濃度達到2×109CFU/mL[9]。樣品制備：

1.3.1.1大米粉

原料大米經(jīng)初步清理除雜后，粉碎過60目篩，過篩后將其裝袋放置于15～20 ℃陰涼干燥(相對濕度為60%左右)的環(huán)境下貯藏備用。

1.3.1.2乳酸菌發(fā)酵大米粉樣品

取10 g大米粉加入到裝有40 mL去離子水的三角瓶中，制成大米漿液，再將上述菌懸液分別接種到大米漿液中，植物乳桿菌菌懸液的接種量為2 %(v/v)，戊糖片球菌菌懸液的接種量為1%(v/v)，三角瓶密封后放置在37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵24 h，待發(fā)酵完后，用去離子水洗3次，再加3倍大米粉質量的去離子水，混勻后離心脫水(3 000 r/min，5 min)，脫水后的濕渣于45 ℃熱風干燥箱中干燥至恒質量，密封后置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆肹8]。

1.3.1.3胞內(nèi)酶粗提物處理大米粉樣品

取等量復配乳酸菌懸液在4 ℃下離心(6 000 r/min，10 min)后去除上清液，用9 g/L 的NaCl溶液洗滌沉淀3次，再加入10 mL Tris-HCl緩沖液(pH 7.0)進行超聲波破碎，離心分離(6 000 r/min，10 min)，上清液為胞內(nèi)酶粗提液[10]。超聲波工作條件：電壓220 V，頻率(超聲3 s，間隔3 s)，每遍工作循環(huán)30次，工作6遍。再按1.3.1.2處理等質量的大米粉。

1.3.1.4胞外酶粗提物加乳酸處理大米粉樣品

取相同量乳酸菌懸液在4 ℃下離心(6 000 r/min，10 min)，用全部的上清液按1.3.1.2處理等質量的大米粉[10]。

1.3.1.5乳酸處理大米粉樣品

根據(jù)發(fā)酵液中的乳酸含量(φ = 5.7%)配制相同濃度的乳酸溶液，取相同量按1.3.1.2處理等質量的大米粉[10]。

1.3.1.6乳酸加胞內(nèi)酶粗提物處理大米粉樣品

取相同量乳酸菌懸液在4 ℃下離心(6 000 r/min，10 min)，按1.3.1.3方法制得胞內(nèi)酶粗提液，在其中添加等量的1.3.1.5中的乳酸，并按1.3.1.2方法處理等質量的大米粉[10]。

1.3.1.7對照樣品

取10 g大米粉于40 mL去離子水中浸泡24 h(40 ℃)，不接種，其余處理與1.3.1.2一致。

1.3.1.8空白樣品

取10 g大米粉于40 mL 3 g/L的苯甲酸鈉溶液中浸泡24 h(40 ℃)，不接種，其余處理同1.3.1.2。

1.3.2乳酸體積分數(shù)對大米粉的脫鎘效果和蛋白質含量的影響

配制不同體積分數(shù)(1%、5%、10%、20%、40%、80%)的乳酸溶液，分別取1.5 mL上述乳酸溶液按1.3.1.2方法處理等質量的大米粉，得到不同體積分數(shù)乳酸處理的大米粉樣品。并測定各大米粉中鎘的脫除率和蛋白質含量，從而確定乳酸體積分數(shù)。

1.3.3不同種類酸對大米粉的脫鎘效果和蛋白質含量的影響

在確定最佳乳酸體積分數(shù)的基礎上，測得該體積分數(shù)乳酸的pH，配制相同pH的乙酸、蘋果酸、檸檬酸、酒石酸、鹽酸和草酸溶液，分別取1.5 mL上述7種酸溶液按1.3.1.2方法處理等質量的大米粉，得到不同酸處理的大米粉樣品。觀察不同種類酸對大米粉脫鎘效果和蛋白質含量的影響。

1.3.4大米粉中蛋白質含量對大米粉脫鎘效果的影響

分別取0.2、0.4、0.8、1.6 g胰蛋白酶加入30 mL磷酸緩沖液中(pH7.5)，溶液中加入10 g大米粉，于37 ℃靜置24 h后，得到不同蛋白質含量的大米粉樣品[10]。測定樣品中重金屬鎘和蛋白質的含量，并分析蛋白質含量與鎘脫除率之間的相關性。

1.3.5實驗指標測定方法

1.3.5.1鎘含量測定

石墨爐-原子吸收光譜法[8,11]。參照國標方法并作改進，在以2 μL(20 g/L)磷酸二氫銨溶液作為基改劑的條件下，繪制吸光值與鎘濃度的標準曲線，得到一元線性回歸方程為：Abs=0.155 18Conc+0.012 840，r=0.999 7，式中：Conc表示試樣中鎘的質量濃度，ng/mL；Abs表示試樣的吸光值。

1.3.5.2蛋白質含量測定

凱氏定氮法[12]。

1.3.5.3乳酸含量測定

酸堿滴定法[13]。

所有試驗處理均重復3次，每次測定均重復3次，試驗數(shù)據(jù)用SPSS軟件進行方差分析。

2結果與分析

2.1乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)酶、乳酸對大米粉脫鎘效果和蛋白質含量的影響

不同乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)物對大米粉中重金屬鎘和蛋白質的作用效果見圖1。乳酸菌在發(fā)酵過程中的主要代謝產(chǎn)物是酶類和乳酸，而酶類可分為胞內(nèi)酶和胞外酶等[10]。由圖1可知，乳酸菌的不同代謝產(chǎn)物均能對大米粉中的重金屬鎘有不同程度的脫除效果，且當鎘的脫除率越高時，大米粉中蛋白質的殘留量越低，這說明大米粉中鎘的脫除效果與蛋白質的脫除量存在著一定的關系。一些研究報道表明，大米中的重金屬鎘主要以蛋白質結合態(tài)的形式存在，并且大多分布在蛋白質含量較高的部位[5-6]，這說明降低大米粉中蛋白質的含量可能有助于大米粉中重金屬鎘的脫除。

圖1　乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)物對大米粉中鎘和蛋白質含量的影響Fig.1　The effect of different fermented products on the content of cadmium and protein in rice powder

由統(tǒng)計分析可知，乳酸、胞內(nèi)酶粗提物、乳酸+胞內(nèi)酶粗提物和乳酸+胞外酶粗提物處理大米粉的鎘脫除率指標與對照組相比差異顯著(P<0.05)，說明乳酸菌的不同發(fā)酵產(chǎn)物對大米粉中重金屬鎘的脫除均有明顯效果，且乳酸菌發(fā)酵脫除大米粉中的鎘除了有乳酸的作用外，還有酶的作用；乳酸處理大米粉的鎘脫除率指標與乳酸+胞外酶粗提物和乳酸+胞內(nèi)酶粗提物相比差異不顯著(P>0.05)，說明胞外酶粗提物和胞內(nèi)酶粗提物對大米粉中鎘脫除的作用效果與乳酸相比不明顯；胞內(nèi)酶粗提物處理大米粉的鎘脫除率指標與乳酸+胞內(nèi)酶粗提物相比差異顯著(P<0.05)，說明乳酸對大米粉中鎘的脫除作用明顯。通過比較乳酸+胞內(nèi)酶粗提物和乳酸+胞外酶粗提物的鎘脫除率指標大小，發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)酶粗提物對大米粉的脫鎘效果稍好于胞外酶粗提物。而對照組的脫鎘率為24.65 %，顯著低于乳酸菌不同代謝產(chǎn)物的脫鎘率(P<0.05)，說明大米粉在自然發(fā)酵和去離子水的浸泡作用下，鎘的脫除效果較差；空白組的脫鎘率僅為4.36 %，明顯低于其它處理組(P<0.05)，說明去離子水對大米粉中鎘的溶出作用有限，且證明了大米粉中的鎘主要以結合態(tài)形式存在，少部分為游離態(tài)[5]。

乳酸菌發(fā)酵脫除大米粉中的重金屬鎘主要是乳酸和酶的共同作用，去離子水的浸泡作用很小，且乳酸對大米粉的脫鎘效果比酶的效果明顯，在酶的作用中，胞內(nèi)酶粗提物的脫鎘效果稍好于胞外酶粗提物，這說明乳酸菌發(fā)酵大米粉脫除其中的重金屬鎘主要是乳酸的作用，其次是胞內(nèi)酶和胞外酶的作用。

2.2乳酸體積分數(shù)對大米粉中鎘的脫除率和蛋白質含量的影響

在2.1試驗結果的基礎上，明確乳酸是乳酸菌發(fā)酵脫除大米粉中重金屬鎘的主要因素，通過比較不同體積分數(shù)的乳酸溶液對大米粉中鎘的脫除效果，觀察乳酸對大米粉中重金屬鎘的脫除作用是否與H+濃度或溶液pH有關，試驗結果如圖2所示。

圖2　乳酸體積分數(shù)對大米粉中鎘和蛋白質含量的影響Fig.2　The effect of lactic acid concentration on the content of cadmium and protein in rice powder

通過圖2可以看出，隨著乳酸體積分數(shù)的不斷增加，大米粉中鎘的脫除率呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，且當乳酸的體積分數(shù)為40%時，鎘脫除率有最大值，這說明乳酸體積分數(shù)對大米粉中鎘脫除率的影響不是越大越好，因為當乳酸溶液的體積分數(shù)過大時，過低的pH會使大米粉中的淀粉水解、可溶性物質快速溶出，增加浸泡液的黏度，反而阻礙了鎘離子的溶出，降低了鎘的脫除率[14]。從以上結果可知，6種不同體積分數(shù)的乳酸處理對大米粉中重金屬鎘的脫除都有明顯作用，當乳酸的體積分數(shù)為40%時，鎘的脫除率最大，且明顯高于其他水平(P<0.05)，在后續(xù)試驗中固定乳酸溶液的體積分數(shù)為40%。從圖2還可以看出，鎘脫除率越大時，大米粉中蛋白質的殘留量越低，但當乳酸的體積分數(shù)由1%增加至5%時，鎘脫除率由55.47%增加至76.12%，而蛋白質的下降幅度并不大，僅由6.6%降低至6.17%，這說明乳酸對大米粉中重金屬鎘的脫除作用不完全是通過水解蛋白質使鎘元素隨蛋白質一起溶出的，還可能是乳酸分子作用于鎘和蛋白質的結合位點，通過打斷鎘與蛋白質之間的結合鍵，使鎘離子單獨從大米粉中溶出[15]。因此，乳酸對大米粉中重金屬鎘的脫除作用與溶液pH有關，但不是pH越低越好，并且初步推測乳酸分子對大米粉中鎘的溶出作用可能有兩個方面的原因，一是乳酸分子通過水解作用使蛋白質分解，從而使鎘隨蛋白質分子一起從大米粉中溶出；二是在低pH環(huán)境下，乳酸分子通過打斷鎘與蛋白質的結合鍵，使鎘離子單獨從大米粉中溶出。然而，這一推測還需后續(xù)試驗進行進一步驗證和探究。

2.3不同酸對大米粉中鎘的脫除率和蛋白質含量的影響

測得體積分數(shù)為40%的乳酸溶液的pH為1.44，配制相同pH的乙酸、蘋果酸、檸檬酸、酒石酸、鹽酸和草酸溶液，比較不同酸對大米粉脫鎘效果的影響，觀察不同酸處理的大米粉蛋白質含量的變化，判斷大米粉中鎘的脫除是否與酸分子結構有關，結果見圖3。

圖3　不同酸對大米粉中鎘和蛋白質含量的影響Fig.3　The effect ofdifferent acids on the content of cadmium and protein in rice powder

由圖3分析可知，除草酸的脫鎘率為49.95 %外，其余有機酸(乳酸、蘋果酸、乙酸、檸檬酸、酒石酸)的脫鎘率均在80 %左右，且顯著高于無機酸鹽酸(P<0.05)，蛋白質含量隨著鎘脫除率的增大而降低。乳酸、醋酸、檸檬酸等對蛋白質中的二硫鍵均有一定的破壞作用[14]，乳酸處理的大米粉蛋白質含量最低、鎘脫除率最高，顯著高于其他處理組(P<0.05)，且這7種酸的pH相同，說明對大米粉中蛋白質和鎘的溶出效果不全是酸中H+的作用，可能還與酸的分子結構有關[10]。乳酸是具有α-羥基結構的羧酸，有報道[5-6,10]稱大米中的鎘元素主要以蛋白質結合態(tài)的形式存在，初步推測乳酸中的羧基與大米蛋白多肽鏈上的氫形成氫鍵以及α-羥基中的氫與多肽鏈上的氧形成氫鍵是促進蛋白質和重金屬鎘溶出的原因。因此，相對于其他6種酸，乳酸對大米粉中重金屬鎘的脫除效果更顯著，這可能與乳酸的分子結構有關，但尚需進一步驗證和探究。

2.4大米粉中蛋白質含量對大米粉脫鎘效果的影響

胰蛋白酶能水解大米中的蛋白質，用不同質量的胰蛋白酶處理相同質量的大米粉，得到蛋白質含量與鎘脫除率之間的關系如圖4所示。

圖4　大米粉中蛋白質含量對鎘脫除率的影響Fig.4　The effect of protein content on cadmium removal ratio in rice powder

由圖4可知，隨著胰蛋白酶用量的增加，大米粉中蛋白質的含量逐漸降低，而對應的大米粉中鎘的脫除率逐漸增加，蛋白質含量與鎘脫除率之間呈負相關，大米粉中蛋白質的降解或溶出有助于重金屬鎘的脫除，與2.1、2.2和2.3中的試驗結果相一致。這是因為大米中的鎘元素主要以蛋白質結合態(tài)的形式存在[5-6]，當大米粉中的蛋白質分子被胰蛋白酶或乳酸等物質水解時，大分子蛋白質會被降解成小分子多肽，甚至是氨基酸，不斷從大米粉中溶出[9]；此時與蛋白質結合的鎘離子會隨著蛋白質分子的不斷水解，逐漸變成游離態(tài)，隨之一起從大米粉中溶出。

3討論

初步推測乳酸對大米粉中鎘的溶出作用有3個方面的原因，1是乳酸分子通過水解作用使蛋白質分解，從而使鎘隨蛋白質分子一起從大米粉中溶出；2是在低pH環(huán)境下，乳酸分子通過打斷鎘與蛋白質的結合鍵，使鎘離子單獨從大米粉中溶出；3是乳酸中的羧基與大米蛋白多肽鏈上的氫形成氫鍵以及α-羥基中的氫與多肽鏈上的氧形成氫鍵以促進蛋白質和重金屬鎘的溶出。

4結論

(1)復配乳酸菌發(fā)酵大米粉脫除其中的重金屬鎘主要是發(fā)酵過程中所產(chǎn)乳酸和酶的共同作用，在酶的作用中，胞內(nèi)酶粗提物的脫鎘效果稍好于胞外酶粗提物，但對大米粉中重金屬鎘的脫除貢獻與乳酸相比不大，所以乳酸菌發(fā)酵脫除大米粉中的鎘主要還是乳酸的作用。

(2)乳酸對大米粉中鎘的脫除作用與溶液pH有關，但不是pH越低越好，適宜的酸性環(huán)境有助于鎘離子(二價陽離子)的溶出，且大米粉中蛋白質和鎘的溶出效果不全是酸中氫離子的作用，還可能與乳酸的分子結構有關。

(3)大米粉中蛋白質含量與鎘脫除率之間呈負相關關系，大米粉中蛋白質的含量降低時，其中重金屬鎘的脫除率增加。因此降低大米粉中蛋白質的含量可能有助于重金屬鎘的脫除。

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Study on mechanism of removal of cadmium in rice powder by lactic acid bacteria fermentation

FU Ya-ping1, WU Wei-guo1*，WANG Ju-tao2

1(Food Science and Technology College of Hunan Agricultural University, Changsha 410128,China)2(Changsha Haoyunwei industrial Development Co.Ltd, Changsha 410129,China)

ABSTRACTIn the previous researches, it was found that lactic acid bacteria could effectively remove cadmium in rice powder by fermentation, and the fermentation conditions were optimized. Based on this, the mechanism of removing cadmium in polished rice (cadmium content of 0.6479 mg/kg) by lactic acid bacteria fermentation was investigated herein. The effects of lactic acid bacteria and their different fermented products on the removal rate of cadmium in rice powder were compared and analyzed. The effects of lactic acid on protein content and cadmium removal rate in rice powder were studied by comparative tests of different concentration of lactic acid and different acid with same pH. The relationship between protein content and cadmium removal rate was revealed. The results showed that function of lactic acid bacteria on removing cadmium in rice powder by fermentation was related to lactic acid and enzyme (including intracellular enzyme and extracellular enzyme). However, the effect of intracellular enzyme on the removal of cadmium in rice powder was better than that of extracellular enzyme, but it’s effect was far worse than that of lactic acid. So the function of lactic acid bacteria on removing cadmium in rice powder by fermentation was still mainly related to lactic acid. And the function of lactic acid on removing cadmium in rice powder was not only related to hydrogen ions of acid, but also might related to the molecular structure of lactic acid with alpha hydroxyl and carboxyl functional groups. Lactic acid could promote protein dissolving out from rice powder. In addition, protein content in rice powder and cadmium removal rate had a significant negative correlation. The results also indicated that the increase of cadmium removal rate in rice powder was accompanied with the reduction of protein content in rice powder. This could provide a theoretical basis for further improvement of the removal rate of cadmium in rice and the large-scale industrial production of de-cadmium rice powder for feeding.

Key wordscadmium; lactic acid bacteria; rice powder; mechanism; removal rate

收稿日期：2015-10-15，改回日期：2015-11-30

基金項目：“重金屬污染耕地治理修復機理及技術模式優(yōu)化集成”項目(農(nóng)辦財函[2015]38號)；長沙市科技重大專項(K404036-21)

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201603018

第一作者：碩士研究生(吳衛(wèi)國教授為通訊作者，E-mail：1061051403@qq.com)。