4種中草藥提取物對靈芝液態(tài)發(fā)酵三萜產(chǎn)物形成的影響

趙小瑞，贠建民 ，艾對元，張紊瑋，趙風(fēng)琴，李宏珍，賈亞莉

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州，730070)

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4種中草藥提取物對靈芝液態(tài)發(fā)酵三萜產(chǎn)物形成的影響

趙小瑞，贠建民*，艾對元，張紊瑋，趙風(fēng)琴，李宏珍，賈亞莉

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州，730070)

摘要采用振蕩-靜置兩段培養(yǎng)法，研究了以當(dāng)歸、黨參、甘草、黃芪4種甘肅道地藥材提取物作為激發(fā)子對靈芝液態(tài)發(fā)酵過程中細(xì)胞生長及產(chǎn)靈芝三萜的影響。結(jié)果表明：建立的最優(yōu)兩段發(fā)酵條件為發(fā)酵液C/N為4∶1，振蕩-靜置轉(zhuǎn)換時間為第3天，裝液量為50 mL/250 mL。在該條件下，當(dāng)歸、黨參、甘草、黃芪提取物均能顯著促進(jìn)靈芝細(xì)胞生長及靈芝三萜的產(chǎn)生，但四者的有效作用濃度范圍不同，當(dāng)歸、黨參醇提物質(zhì)量濃度在20～80 g/L促進(jìn)作用良好，甘草、黃芪水提物在5～15 g/L促進(jìn)作用良好。最佳添加時間分別為當(dāng)歸第2天，黨參、甘草和黃芪均為第3天。發(fā)酵罐驗(yàn)證試驗(yàn)表明,4種中草藥提取物是有效的激發(fā)子，可促進(jìn)靈芝發(fā)酵三萜產(chǎn)量提高，尤其是當(dāng)歸添加量為60 g/L時，胞外三萜產(chǎn)量可達(dá)964.63 mg/L。

關(guān)鍵詞中草藥；提取物；兩段液態(tài)發(fā)酵；靈芝三萜

靈芝(Ganodema lucidum)為靈芝科靈芝屬藥食兩用真菌，是滋補(bǔ)強(qiáng)壯、扶正固本的珍品，已有2000多年的藥用歷史。迄今為止，已從靈芝子實(shí)體中分離到十余類化合物，其中多糖和三萜類化合物為關(guān)鍵藥效成分[1-3]?，F(xiàn)代藥理研究表明，靈芝三萜具有抗病毒、鎮(zhèn)靜止痛、抑制組織胺釋放、解毒保肝、殺傷腫瘤細(xì)胞等藥理活性[4-6]。

液體深層發(fā)酵以其機(jī)械化、自動化程度高，有利于實(shí)現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)而備受關(guān)注，已成為獲得靈芝次生代謝產(chǎn)物的主要技術(shù)，但如何進(jìn)一步促進(jìn)靈芝細(xì)胞生長和提高關(guān)鍵活性產(chǎn)物的產(chǎn)量仍是人們希望解決的問題[7]。傳統(tǒng)的提高靈芝液態(tài)發(fā)酵過程中次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的研究主要集中在優(yōu)化發(fā)酵基質(zhì)(如C/N)和發(fā)酵過程參數(shù)(如溶氧和pH)，或補(bǔ)料-分批發(fā)酵等策略方面[7-9]。近年來為了進(jìn)一步提高有效次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量，一些學(xué)者從外界活性因子激發(fā)真菌次生代謝產(chǎn)物合成的角度，研究了一些活性因子，如纖維素酶[10]、低聚麥芽糖[10]、Gu2+[11]、真菌激發(fā)子[12]、中藥固體粉末[13]、中藥材提取物[14]等對靈芝關(guān)鍵代謝產(chǎn)物合成的影響，效果良好。運(yùn)用中藥材提取物刺激真菌液態(tài)發(fā)酵技術(shù)已成為研究的熱點(diǎn)，但將中藥提取物作為激發(fā)子與兩段培養(yǎng)法結(jié)合工藝技術(shù)研究較少。

當(dāng)歸、黨參、甘草、黃芪是重要的保健食品原料或藥食同源物，價廉易得，在我國已有悠久的食、藥用史。本試驗(yàn)在優(yōu)化建立靈芝液體振蕩-靜置兩段培養(yǎng)技術(shù)體系的基礎(chǔ)上，探討4種中草藥提取液在不同添加濃度、不同添加時期下對靈芝細(xì)胞生物量(CDW)、胞內(nèi)靈芝三萜含量(IGA)和胞外靈芝三萜含量(EGA)的影響，以期為創(chuàng)新靈芝工業(yè)化發(fā)酵技術(shù)及中藥材加工增效途徑提供科學(xué)依據(jù)和參考。

1材料與方法

1.1材料與試劑

靈芝菌種：日本靈芝(Ganoderma japonicum)，由北京吉蕈園科技有限公司提供。

當(dāng)歸、黨參、甘草、黃芪：藥品級，購自蘭州市安寧區(qū)惠仁堂藥店的片劑；玉米粉、麩皮：市購。

甲醇、乙醇、三氯甲烷 、蛋白胨，葡萄糖，瓊脂粉，NaHCO3，KH2PO4，MgSO4·7H2O均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2儀器與設(shè)備

UV756CRT型紫外可見分光光度計，上海佑科儀器儀表有限公司；THZ-8臺式恒溫振蕩器，上海佑科儀器儀表有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱，北京科偉永興儀器有限公司；TD5A-WS臺式低速離心機(jī)，長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠 ；1.5 L全自動機(jī)械攪拌發(fā)酵罐，上海國強(qiáng)生化工程設(shè)備公司。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1菌種制備

菌種活化：取一小塊保存的靈芝菌苔接種于PDA斜面培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)7 d。待菌絲長滿斜面，備用。

搖瓶培養(yǎng)基：玉米粉30 g，麩皮20 g，蛋白胨5 g，葡萄糖20 g，KH2PO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，VB10.5 g，水1 000 mL,pH自然。

第一階段菌種培養(yǎng)：在斜面菌種中切取5個瓊脂塊(d=5 mm)，接種到50 mL/250 mL液體培養(yǎng)基中，30 ℃，150 r/min條件下培養(yǎng)5 d；第二階段菌種培養(yǎng)：吸取5 mL第一階段種子液，接種到50 mL/250 mL液體培養(yǎng)基中，30 ℃，150 r/min條件下培養(yǎng)5 d。

1.3.2中草藥提取物制備

參照趙艷等[15-16]方法并略做修改。

甘草、黃芪水提物制備：稱取供試草藥100 g，加10倍量水煎制4 h，8層紗布過濾，藥渣再煎1次，合并藥汁，藥汁減壓濃縮得1 g/mL浸膏，備用。

當(dāng)歸、黨參醇提物制備：將供試草藥烘干、粉碎，稱取100 g，加10倍量70%乙醇回流提取6 h，過濾，濾液減壓濃縮得1 g/mL浸膏，備用。

1.3.3發(fā)酵培養(yǎng)

1.3.3.1兩段式培養(yǎng)基本條件

搖瓶發(fā)酵：在250 mL錐形瓶中，裝入適量發(fā)酵培養(yǎng)基，每個錐形瓶中按10 mL/100 mL比例接入液體菌種，30 ℃，150 r/min條件下振蕩培養(yǎng)3 d。

靜態(tài)培養(yǎng)：將搖瓶培養(yǎng)3d后的發(fā)酵基質(zhì)轉(zhuǎn)為靜態(tài)培養(yǎng)，30 ℃條件下靜置培養(yǎng)16 d。

1.3.3.2液體發(fā)酵罐驗(yàn)證試驗(yàn)

在1.5 L發(fā)酵罐中進(jìn)行。以第二階段培養(yǎng)的菌絲球?yàn)榉N子液，接種水平保持在10%(v/v)，培養(yǎng)溫度保持在30 ℃，攪拌速率300 r/min，通氣量控制在0.67 v/v/m，攪動發(fā)酵3 d后，靜置發(fā)酵16 d，通氣量控制在0.3 v/v/m。并分別在培養(yǎng)第2天加入當(dāng)歸醇提物，使其終質(zhì)量濃度為60 g/L，第3天加入黨參醇提物、甘草水提物、黃芪水提物，使其終質(zhì)量濃度分別為60、10和10 g/L。

1.3.3.3兩段培養(yǎng)條件優(yōu)化

在上述1.3.3.1兩段培養(yǎng)基本條件下，以靈芝三萜產(chǎn)量為主要指標(biāo)，綜合靈芝細(xì)胞生物量，來確定最優(yōu)C/N、轉(zhuǎn)換時間點(diǎn)、裝液量。

碳氮比的確定：最適碳氮比是在玉米粉、麩皮比例一定，60 mL /250 mL裝液量情況下，以葡萄糖為碳源、蛋白胨為氮源，分別設(shè)定碳氮比為2∶1、4∶1、6∶1、8∶1、10∶1(g∶g)，30 ℃，150 r/min條件下分別培養(yǎng)5d，轉(zhuǎn)為靜態(tài)培養(yǎng)，30 ℃條件下靜置培養(yǎng)16 d。

轉(zhuǎn)換時間的確定：在60 mL/250 mL裝液量情況下，按10 mL/100 mL比例接入液體菌種，30 ℃，150 r/min條件下分別培養(yǎng)1、2、3、4、5、6 d，轉(zhuǎn)為靜態(tài)培養(yǎng)，30 ℃條件下靜置培養(yǎng)16 d。

裝液量的確定：250 mL錐形瓶中，分別裝入10、20、30、40、50、60 mL發(fā)酵培養(yǎng)基。其他條件同1.3.3.1。

1.3.3.4中藥添加可行性研究

在50 mL/250 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，各加入4種中藥提取物，使其終質(zhì)量濃度為20 g/L，其他條件同1.3.3.1下，進(jìn)行兩段培養(yǎng)。通過測定發(fā)酵終了時靈芝三萜產(chǎn)量及靈芝細(xì)胞生物量，來判斷靈芝發(fā)酵中添加中藥對三萜產(chǎn)物的影響。

1.3.3.5當(dāng)歸、黨參最佳添加量的篩選

在50 mL/250 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，各加入當(dāng)歸、黨參提取物，使其終質(zhì)量濃度分別為20、40、60、80、100 g/L，按1.3.3.1條件進(jìn)行兩段培養(yǎng)，篩選最其佳添加量。

1.3.3.6甘草、黃芪最佳添加量的篩選

在50 mL/250 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，各加入甘草、黃芪提取物，使其終質(zhì)量濃度分別為5、10、15、20、25 g/L，按1.3.3.1條件進(jìn)行兩段培養(yǎng)，篩選最佳其添加量。

1.3.3.7中藥提取物添加時間點(diǎn)的確定

根據(jù)上述得出的各中藥提取物最佳濃度，分別于靈芝搖瓶培養(yǎng)第1、第2、第3和第4天加入滅菌中藥提取物，兩段培養(yǎng)結(jié)束后，測定靈芝細(xì)胞生物量和三萜類物質(zhì)產(chǎn)量。

1.3.4細(xì)胞生物量(CDW)的測定

參照劉媛等[13]方法并略做修改。取發(fā)酵液體積V，3 000 r/min離心10 min。沉淀用蒸餾水洗滌多次，收集菌絲體，置烘箱60 ℃烘至恒重，稱重計算生物量。

生物量(g/L)=DCW×1 000 /V

式中:DCW為細(xì)胞干重,g；V為發(fā)酵液體積，mL。

1.3.5靈芝三萜的測定

參照文獻(xiàn)[17]的方法測定。將發(fā)酵物8 000 r/min離心10 min，分別收集菌絲體和發(fā)酵液備用。IGA測定：精密稱取干菌絲100 mg，加 3 mL50%(v/v)乙醇4 ℃萃取1周，萃取2次。離心移除菌絲體，上清液在50 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥。濃縮物溶解在水中，隨后用CHCl3進(jìn)行萃取。溶解在CHCl3中的靈芝三萜用50 g/L NaHCO3溶液提取，后加入2 mol/L HCl，將NaHCO3層的pH調(diào)整到3以下。NaHCO3層的靈芝三萜最后由CHCl3萃取出來。在40 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)移除CHCl3，萃取物溶解在甲醇中作為粗靈芝三萜。用紫外分光光度儀在245 nm條件下測定靈芝三萜含量。

EGA測定：將培養(yǎng)液收集，加5倍無水乙醇，4 ℃下靜置提取7 d。提取液離心除去雜質(zhì)后，上清液在50 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中進(jìn)行干燥。后續(xù)操作同上。以不加中藥提取物的發(fā)酵液為對照，所有試驗(yàn)做3個平行。

1.4數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，試驗(yàn)重復(fù)次數(shù) n=3，用SPSS19.0統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行方差分析，采用origin8.0繪圖。

2結(jié)果與分析

2.1最佳兩段培養(yǎng)條件的建立

2.1.1碳氮比(C/N)

表1　C/N對靈芝細(xì)胞生長和靈芝三萜產(chǎn)量的影響

注：1)同列相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，同列不同字母表示差異顯著(P<0.05)；下同。2)文中所有圖例、表格中CDW代表細(xì)胞生物量、IGA代表胞內(nèi)靈芝三萜含量、EGA代表胞外靈芝三萜含量。

最適碳氮比是在玉米粉、麩皮比例一定，250 mL三角瓶裝液量為60 mL的情況下，以葡萄糖為輔助碳源、蛋白胨為輔助氮源進(jìn)行研究的。由表1可以觀察到,當(dāng)C/N為10∶1時，EGA產(chǎn)量最低，僅為215.64 mg/L，表明氮源不足會降低靈芝三萜的產(chǎn)量。另一方面，將C/N從10∶1降到2∶1后EGA產(chǎn)量和CDW提高，在4∶1時達(dá)到最大，分別為285.15 mg/L和11.16 g/L，顯著優(yōu)于C/N為10∶1時的效果。這些結(jié)果表明氮源增加有益于細(xì)胞生長和靈芝三萜的產(chǎn)生。這一結(jié)果與PAPINUTTI[18]得出的結(jié)果一致，增加氮源可以提高靈芝細(xì)胞生物量，其中 C/N為4∶1時最佳。

2.1.2轉(zhuǎn)換時間

在兩階段培養(yǎng)過程中，第一階段主要在搖瓶中積累細(xì)胞生物量，第二階段在限制供氧量的情況下積累靈芝三萜，第一階段與第二階段之間的轉(zhuǎn)換點(diǎn)是影響靈芝三萜產(chǎn)生的重要因素[10]。

由圖1可以看出，轉(zhuǎn)換時間影響靈芝細(xì)胞生長和靈芝三萜的產(chǎn)量。第3天時CDW和EGA產(chǎn)量均達(dá)到最大，分別為11.03 g/L和327.52 mg/L，IGA在第4天時達(dá)到最大(10.75 mg/g)，但與第3天產(chǎn)量差別不大。平衡三者的關(guān)系，將第3天定為最佳轉(zhuǎn)換時間點(diǎn)。

圖1　轉(zhuǎn)換時間對靈芝細(xì)胞生長和靈芝三萜產(chǎn)量的影響Fig.1　Influence of the shift time in tne two-stage cultivation on mycelial growth of Ganoderma japonicum and production of ganoderic triterpenoid

2.1.3裝液量

兩階段培養(yǎng)過程中，添加少量的培養(yǎng)基可以產(chǎn)生較大的比表面積，從而使大量的菌絲體生長在液體表面，在靜態(tài)培養(yǎng)過程中長成菌絲墊，產(chǎn)生更多的靈芝三萜。隨著發(fā)酵液添加量的增加，EGA含量有所下降，IGA含量及CDW輕微增加(圖2)。當(dāng)液體培養(yǎng)基添加量為50 mL時，IGA產(chǎn)量(10.64 mg/g)和CDW(11.32 g/L)均達(dá)到最大，當(dāng)培養(yǎng)基添加量為20 mL時EGA含量達(dá)到348.04 mg/L。

在試驗(yàn)中，添加20 mL液體培養(yǎng)基，經(jīng)過16天的靜置培養(yǎng)，幾乎看不到液體。得到一層厚厚的菌絲墊，大量的菌絲表面可以產(chǎn)生靈芝孢子。報道顯示[19]，菌絲墊上孢子中的靈芝三萜含量比液體培養(yǎng)的菌絲球中的含量多。盡管添加少量液體培養(yǎng)基可以增加EGA含量，但是對CDW的產(chǎn)生造成了消極的影響，進(jìn)而降低了IGA產(chǎn)量。平衡細(xì)胞生物量和靈芝三萜產(chǎn)量，250 mL三角瓶中50 mL液體培養(yǎng)基被認(rèn)為是最佳添加量。

圖2　裝液量對靈芝細(xì)胞生長和靈芝三萜產(chǎn)量的影響Fig.2　Influence of liquid loadings on mycelial growth of Ganoderma japonicum and production of ganoderic triterpenoid in tne two-stage cultivation

2.2添加中藥對靈芝細(xì)胞生長和靈芝三萜產(chǎn)量的影響

2.2.1中藥提取物添加的可行性研究

本試驗(yàn)研究了甘肅四大道地藥材當(dāng)歸、黨參、甘草、黃芪提取物對靈芝細(xì)胞生長及靈芝三萜產(chǎn)生的影響。首先在各中藥添加終濃度均為20 g/L時研究了4種中藥提取物對靈芝細(xì)胞生長及靈芝三萜生產(chǎn)的可行性?？梢钥闯?，4種中藥提取物終質(zhì)量濃度為20 g/L時，添加當(dāng)歸和黨參提取物對靈芝細(xì)胞生長和靈芝三萜的產(chǎn)生有一定的促進(jìn)作用，甘草和黃芪則表現(xiàn)出一定程度的抑制作用(表2)。

表2　不同植物藥提取物(20 g/L)對靈芝細(xì)胞

為考察各中草藥提取物有效作用劑量范圍，進(jìn)一步考察了當(dāng)歸、黨參醇提取物終質(zhì)量濃度在20、40、60、80、100 g/L及甘草、黃芪水提取物終質(zhì)量濃度在5、10、15、20、25 g/L條件下對靈芝細(xì)胞生長及靈芝三萜產(chǎn)量的影響。

2.2.2當(dāng)歸提取物對靈芝細(xì)胞生長及產(chǎn)靈芝三萜的影響

由圖3可以看出，隨著當(dāng)歸添加量的增加，IGA、EGA產(chǎn)量顯著提高，CDW也呈一定的上升趨勢。當(dāng)歸添加量為80 g/L時EGA產(chǎn)量(595.63 mg/L)及IGA含量(14.47 mg/g)均達(dá)到最大，分別比對照增加89.52%、38.47%，CDW也顯著提高，從11.17 g/L上升到13.52 g/L。由此可見，添加一定質(zhì)量濃度的當(dāng)歸提取物有利于靈芝細(xì)胞生長及靈芝三萜的生成。

圖3　當(dāng)歸提取物不同添加質(zhì)量濃度對靈芝細(xì)胞生長和靈芝三萜產(chǎn)量的影響Fig.3　Effect of different concentrations of Angelica sinensis alcohol extracts on mycelial growth of Ganoderma japonicum and production of ganoderic triterpenoid

2.2.3黨參提取物對靈芝細(xì)胞生長及產(chǎn)靈芝三萜的影響

圖4　黨參提取物不同添加質(zhì)量濃度對靈芝細(xì)胞生長和靈芝三萜產(chǎn)量的影響Fig.4　Effect of different concentrations of Codonopsis pilosula alcohol extracts on mycelial growth of Ganoderma japonicum and production of ganoderic triterpenoid

由圖4可以看出，隨著黨參添加濃度的增加，靈芝三萜產(chǎn)量及靈芝細(xì)胞生物量呈一定的上升趨勢。黨參添加濃度為80 g/L時EGA及IGA含量均達(dá)到最大，分別比對照增加33.49%、33.27%。CDW也顯著提高，比對照增加了22.20%，說明黨參添加量在一定范圍內(nèi)有利于靈芝的生長及靈芝三萜的生成。

2.2.4甘草提取物對靈芝細(xì)胞生長及產(chǎn)靈芝三萜的影響

由圖5可以看出甘草添加量對靈芝生長有一定影響。靈芝細(xì)胞生物量隨甘草添加量的增加呈先上升后下降趨勢，在添加量為15 g/L時達(dá)到最大(12.31 g/L)。EGA、IGA含量均在15 g/L時達(dá)到最大，分別為354.00 mg/L、11.30 mg/g。由此可見甘草提取物在5～15 g/L的添加范圍內(nèi)有利于靈芝的生長及靈芝三萜的生成。

圖5　甘草提取物不同添加質(zhì)量濃度對靈芝細(xì)胞生長和靈芝三萜產(chǎn)量的影響Fig.5Effect of different concentrations of Glycyrrhiza uralensis Fisch water extracts on mycelial growth of Ganoderma japonicum and production of ganoderic triterpenoid

2.2.5黃芪提取物對靈芝細(xì)胞生長及產(chǎn)靈芝三萜的影響

黃芪添加濃度對靈芝液態(tài)發(fā)酵的影響如圖6所示。

圖6　黃芪提取物不同添加濃度對靈芝細(xì)胞生長和靈芝三萜產(chǎn)量的影響Fig.6　Effect of different concentrations of Radix astragali water extracts on mycelial growth of Ganoderma japonicum and production of ganoderic triterpenoid

黃芪提取物添加質(zhì)量濃度在5～15 g/L范圍內(nèi)時，IGA含量及CDW均呈緩慢的上升趨勢，EGA呈先上升后下降趨勢，變化顯著；但超過15 g/L時，靈芝三萜含量及細(xì)胞生物量均明顯下降。CDW及EGA、IGA含量均在添加量為10 g/L時達(dá)到最大，分別為11.52 g/L、10.94 mg/g、344.73 mg/L。由此可見，黃芪在5～15 g/L添加范圍內(nèi)對靈芝液態(tài)發(fā)酵有一定的促進(jìn)作用，但超過15 g/L時則呈現(xiàn)明顯的抑制作用。

2.2.6中藥提取物添加時期的確定

為了考察4種中藥提取物加入時間對靈芝生物量和靈芝三萜積累的影響，分別將60 g/L當(dāng)歸、黨參和10 g/L甘草、黃芪各設(shè)置4個加入時間分別加入靈芝發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。結(jié)果表明(圖7)，加入時間不同，各中藥提取物對靈芝細(xì)胞生長和靈芝三萜積累產(chǎn)生了不同的影響。當(dāng)歸在第2天加入時，對EGA和CDW促進(jìn)作用明顯，黨參在第3天加入時對IGA、EGA和CDW促進(jìn)作用最明顯。甘草、黃芪均在第3天加入時促進(jìn)效果良好，尤其是對EGA的促進(jìn)作用較大。

2.2.7發(fā)酵罐驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

在1.5 L發(fā)酵罐驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果如表3所示?？梢钥闯?，添加適量的4種中草藥提取物可以有效促進(jìn)靈芝液態(tài)發(fā)酵過程中細(xì)胞生物量和靈芝三萜的積累。當(dāng)歸、黨參添加量為60 g/L時，EGA從315.68 mg/L分別增加到964.15 mg/L和874.19 mg/L；甘草、黃芪添加量為10 g/L時，EGA分別為585.26 mg/L和546.22 mg/L。顯然當(dāng)歸醇提取物是一種非常有效的可增加靈芝三萜產(chǎn)量的激發(fā)子。這比TANG[9]等在5.5 L帶攪拌器的發(fā)酵罐中運(yùn)用pH-轉(zhuǎn)換和通氣量轉(zhuǎn)換結(jié)合的連續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)過程中生產(chǎn)出了754.6 mg/L的靈芝三萜的效果更好。

表3　發(fā)酵罐驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

3結(jié)論

本試驗(yàn)優(yōu)選的靈芝液體振蕩-靜置兩段搖瓶培養(yǎng)的最優(yōu)條件為：C/N為4∶1，轉(zhuǎn)換時間為第3天，裝液量為50 mL/250 mL。在兩段液體培養(yǎng)條件下，添加4種甘肅道地藥材的提取物可以促進(jìn)靈芝生長和靈芝三萜產(chǎn)量，但4者的有效作用質(zhì)量濃度不同，其中當(dāng)歸和黨參提取物在20～80 g/L范圍內(nèi)可有效促進(jìn)靈芝細(xì)胞生長和產(chǎn)靈芝三萜能力，甘草和黃芪有效作用質(zhì)量濃度為5～15 g/L。4種中藥提取物最佳添加時間：當(dāng)歸為第2天，黨參、甘草和黃芪均為第3天。發(fā)酵罐驗(yàn)證試驗(yàn)證明4種供試中草藥提取物是有效的激發(fā)子，可促進(jìn)靈芝三萜產(chǎn)量提高，同時證明其工業(yè)化生產(chǎn)具有一定的可行性。

圖7　中草藥提取物添加時間對靈芝細(xì)胞生長和靈芝三萜產(chǎn)量的影響Fig.7　Effect of different addition times of four kinds herds extracts on mycelial growth of Ganoderma japonicum and production of ganoderic triterpenoid

參考文獻(xiàn)

[1]林志彬.靈芝的現(xiàn)代研究(第三版)[M].北京：北京大學(xué)醫(yī)學(xué)出版社, 2007:1-359.

[2]XU J W,ZHAO W,ZHONG J J.Biotechnological production and application of ganoderic acids[J].Applied Microbiololgy and Biotechnolgy,2010,87(2):457-466.

[3]BOH B,BEROVIC M,ZHANG JS,et al. Ganoderma lucidum and its pharmaceutically active compounds[J].Biotechnology Annual Review,2007,13(7):265-301.

[4]GAO J J,MIN B S,AHN E M,et al. New triterpene aldehydes,lucialdehydes A-C,from Ganoderma lucidum and their cytotoxicity against murine and human tumor cells[J].Chemical and Pharmaceutical Bulletin,2002,50(6):837-840.

[5]KIMURA Y,TANIGUCHI M,BABA K.Antitumor and antimetastatic effects on liver of triterpenoid fractions of Ganoderma lucidum:mechanism of action and isolation of an active substance[J].Anticancer Research,2002,22(6A):3 309-3 318.

[6]劉高強(qiáng),丁重陽,王曉玲.靈芝三萜類化合物的抗癌作用機(jī)制研究進(jìn)展[J].菌物學(xué)報,2007,26(3):470-476.

[7]FANG Q H,ZHONG J J.Two-stage culture process for improved production of ganoderic acid by liquid fermentation of higher fungus Ganoderma lucidum[J].Biotechnology Progress,2002,18(1):51-54.

[8]CHANG M Y,TSAI G J,HOUNG J Y.Optimization of the medium composition for the submerged culture of Ganoderma lucidum by Taguchi array design and steepest ascent method[J].Enzyme and Microbial Technology,2006,38(3):407-414.

[9]TANG Y J,ZHANG W,ZHONG J J.Performance analyses of a pH-shift and DOT-shift integrated fed-batch fermentation process for the production of ganoderic acid and Ganoderma polysaccharides by medicinal mushroom Ganoderma lucidum[J].Bioresource Technology,2009,100(5):1 852-1 859.

[10]ZHANG J M,ZHONG J J,GENG A L.Improvement of ganoderic acid production by fermentation of Ganoderma lucidum with cellulase as an elicitor[J].Process Biochemistry,2014,49(10):1 580-1 586.

[11]ZHU L W,ZHONG J J,TANG Y J.Multi-fed batch culture integrated with three-stage light irradiation and multiple additions of copper ions for the hyperproduction of ganoderic acid and Ganoderma polysaccharides by the medicinal mushroom Ganoderma lucidum[J].Process Biochemistry,2010,45(12):1 904-1 911.

[12]高興喜,姚強(qiáng),王磊等.真菌激發(fā)子對靈芝液體發(fā)酵生產(chǎn)多糖和三萜類物質(zhì)的影響[J].食品科學(xué),2009,30(23):309-311.

[13]劉媛,丁重陽,章克昌,等.10種中藥對靈芝液體發(fā)酵的影響[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報,2008,27(2):123-126.

[14]余志堅,陳傳紅,高凌飛,等.5種中草藥水提取液對靈芝三萜含量的影響[J].時珍國醫(yī)國藥,2006,17(9):1 645-1 646.

[15]趙艷,劉高強(qiáng),朱朝陽，等.不同植物藥提取物對靈芝細(xì)胞生長和胞內(nèi)三萜產(chǎn)物形成的影響[J].菌物學(xué)報,2011,30(2):249-254.

[16]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:2010年版一部[S].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010:264.

[17]TANG Y J,ZHONG J J.Fed-batch fermentation of Ganoderma lucidum for hyperproduction of polysaccharide and ganoderic acid[J].Enzyme Microbial Technology,2002,31(1):20-28.

[18]PAPINUTTI L.Effects of nutrients,pH and water potential on exopolysaccharides production by a fungal strain belonging to Ganoderma lucidum complex[J].Bioresource Technology,2010,101(6):1 941-1 946.

[19]ZHANG W X,ZHONG J J.Effect of oxygen concentration in gas phase on sporulation and individual ganoderic acids accumulation in liquid static culture of Ganoderma lucidum[J].Journal of Bioscience and Bioengineering,2010,109(1):37-40.

Effects of four kinds of Chinese herbs extracts on ganoderma triterpenoids production ofGanodermajaponicumin submerged fermentation

ZHAO Xiao-rui, YUN Jian-min*, AI Dui-yuan, ZHANG Wen-wei, ZHAO Feng-qin, LI Hong-zhen, JIA Ya-li

(College of Food Science and Engineering, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China)

ABSTRACTIn this work, a two-stage culture process by combining shake culture with static culture was proposed to study the effects of four kinds of Chinese herbs (Angelica sinensis, Codonopsis pilosula, Glycyrrhiza uralensis and Radix astragali) on production of ganoderma triterpenoids and mycelium growth. The results showed that the optimum two-stage cultivation conditions were as follows: fermentation broth C / N was 4∶1, two-stage shift time was the 3rd day, and culture volume was 50 mL/250 mL. Under these conditions, four kinds of extracts could all significantly enhance cell growth biomass and the production of ganoderma triterpenoids, but their effective concentration ranges were different. The alcohol extracts of Angelica sinensis and Codonopsis pilosula were effective within 20～80 g/L, however, the water extracts of Glycyrrhiza uralensis and Radix astragali could enhance ganoderic triterpenoids production within 5～15 g/L. The best adding time for Angelica sinensis extract was on the 2nd day, and the others were on the 3(rd) day. Verification test in 1.5 L fermentor showed that four herbs extracts were effective elicitors, which could promote the production of ganoderic triterpenoids. Especially when addition of Angelica sinensis alcohol extracts in fermentation broth was 60 g/L, the yield of extracellular triterpenoids reached 964.63 mg/L.

Key wordsChinese herbs; extracts; two-stage fermentation; ganoderma triterpenoids

收稿日期：2015-10-30，改回日期：2015-12-17

基金項(xiàng)目：甘肅省科技支撐計劃(1304FKCN063)；甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)青年導(dǎo)師基金(GAU-QNDS-201205)

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201603017

第一作者：碩士研究生(贠建民教授為通訊作者，E-mail：yunjianmin@gsau.edu.cn)。