鹽生海蘆筍抗菌內(nèi)生細(xì)菌的篩選與鑒定

冉火苗，孔望君，蔣會芳，史雅凝，辛志宏

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科技學(xué)院，江蘇 南京，210095)

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鹽生海蘆筍抗菌內(nèi)生細(xì)菌的篩選與鑒定

冉火苗，孔望君，蔣會芳，史雅凝，辛志宏*

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科技學(xué)院，江蘇 南京，210095)

摘要以抗菌活性為指標(biāo)，從野生海蘆筍中篩選與鑒定具有抗菌活性的內(nèi)生細(xì)菌。采用平板分離與斜面純化的方法，從海蘆筍中分離到13株內(nèi)生細(xì)菌，經(jīng)過對8株病原菌抗菌活性測試，菌株HLS-7和HLS-8對大腸桿菌(Escherichia coli)、金色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、恥垢分枝桿菌(Mycobacterium smegmatis)和白假絲酵母(Candida albicans)均顯示了較強(qiáng)的抑制活性，其抑菌圈直徑均>10 mm；對枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes)、單增李斯特菌(Listeria monocytogenes)和肺炎克雷伯菌(Klebsiella penumoniae)均顯示了中等抗菌活性，表現(xiàn)出廣譜的抑菌活性。PCR擴(kuò)增這2株菌的16S rDNA區(qū)域，單克隆后測序進(jìn)行同源性分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察和生理生化實驗，將菌株HLS-7和HLS-8分別鑒定慶生芽孢桿菌(Bacillus qingshengii)和甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌(Bacillus methylotrophicus)。通過電噴霧質(zhì)譜分析這2株菌的發(fā)酵產(chǎn)物，結(jié)果顯示,菌株HLS-7可產(chǎn)生脂肽類化合物Fenycin和Iturin，菌株HLS-8可產(chǎn)生脂肽類化合物Iturin，提示這2株菌的抗菌活性可能源于脂肽化合物。

關(guān)鍵詞海蘆筍；內(nèi)生細(xì)菌；抑菌活性；篩選鑒定；脂肽化合物

植物內(nèi)生菌是天然生物活性物質(zhì)的資源寶庫，特別是食藥兩用植物。研究表明，植物內(nèi)生菌與宿主植物長期的生活過程中，形成了互惠互利的共生關(guān)系，能夠產(chǎn)生與宿主植物相似或相同的生物活性物質(zhì)，如環(huán)肽類抗生素、皂苷、生物堿等。這為發(fā)現(xiàn)新型活性物質(zhì)，保護(hù)稀有野生植物與可持續(xù)發(fā)展提供了有效途徑。MILLER等[1]從草本植物葉子和組織內(nèi)發(fā)現(xiàn)了對微莢膜新隱球酵母(Cryptococcusneoformans)和白色念珠菌(Candidaalbicans)等病原菌有較強(qiáng)抑制作用的黃綠假單胞菌(Pseudomonasviridiflava)。該菌能產(chǎn)生兩種新型的脂多肽類抗生素Ecomycins，分子質(zhì)量分別為1 153 Da和1 181 Da。何紅等[2]從辣椒體內(nèi)分離到1株能在辣椒、白菜等植物體內(nèi)定殖傳導(dǎo)并對多種植物病原真菌具有較強(qiáng)拮抗作用的枯草芽孢桿菌。該菌能夠產(chǎn)生一種環(huán)脂類抗菌肽，對多種植物病原真菌和細(xì)菌有較強(qiáng)的拮抗作用。因此，植物內(nèi)生細(xì)菌是一類亟待開發(fā)的微生物資源，在生物防控、食品、制藥、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)等領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價值。

海蘆筍(Salicornia bigelovii Torr.)又稱海蓬子、海鹿茸、海蟲草、富貴菜等，為藜科鹽角草屬的1年草本鹽生植物，在我國、韓國和歐美均有分布[3]。海蘆筍有莖無葉耐鹽能力極強(qiáng)，其內(nèi)莖的可溶性鹽分含量高達(dá)37%[4]。研究表明，海蘆筍營養(yǎng)豐富，含有多種必需氨基酸、維生素、微量元素、植物堿和植物鹽[5]。食用后其中的植物堿可與人體血液中的脂肪酸中和，能夠清除血管壁上的膽固醇，具有降血脂作用[6-8]。特別有趣的是海蘆筍不被蟲子捕食，提示其中可能含有較強(qiáng)的抗菌活性物質(zhì)。

本研究以野生鹽生海蘆筍為研究對象，從中分離內(nèi)生細(xì)菌，篩選具有抑菌活性的內(nèi)生細(xì)菌，進(jìn)一步探索海蘆筍內(nèi)生菌與宿主之間的關(guān)系并深入挖掘具有抗菌活性的物質(zhì)。

1材料與方法

1.1材料與儀器

1.1.1材料、試劑與培養(yǎng)基

野生鹽生海蘆筍，采自新疆鹽湖。

Taq酶及PCR相關(guān)試劑(包括dNTP與PCR Buffer等)，天根生化科技(北京)有限公司；Omega真菌基因組試劑盒(Fungal DNA Kit 50)及引物(16S F/16S R)，上海捷瑞生物工程有限公司；其他分析純試劑，南京壽德試劑器材有限公司。大腸桿菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、恥垢分枝桿菌(Mycobacteriumsmegmatis)、產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacteraerogenes)、單增李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、肺炎克雷伯菌(Klebsiellapenumoniae)和白假絲酵母(Candidaalbicans)，均購自于中科院微生物菌種保藏中心。

LB固體培養(yǎng)基：NaCl 10 g，酵母提取物5 g，胰蛋白胨10 g，瓊脂20 g，pH自然，蒸餾水1 000 mL。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(NA培養(yǎng)基)：牛肉浸膏3 g，蛋白胨5 g，葡萄糖2.5 g，pH (7.0±0.1)，蒸餾水1 000 mL。

1.1.2儀器與設(shè)備

Microfuge 22R臺式微量冷凍離心機(jī)，美國Beckman公司；TP600型梯度PCR儀，日本TaKaRa公司；DYCP-31DN電泳儀，北京市六一儀器廠；JS-380C全自動數(shù)碼凝膠成像分析儀，上海培清科技有限公司；Agilent 5975C型MS儀，美國安捷倫科技有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1內(nèi)生細(xì)菌的分離純化

在無菌操作下，取1根野生海蘆筍，依次經(jīng)過75%乙醇、1%次氯酸鈉和75%乙醇各浸泡1 min，然后用無菌水漂洗3次，無菌吸水紙干燥。用滅菌后的剪刀將其剪成7～9 mm小段，放在LB平板上，每板3～5根，于37 ℃恒溫培養(yǎng)至莖末端長出菌落，將細(xì)菌轉(zhuǎn)移到新的平板培養(yǎng)基上劃線分離得到單個菌落，然后轉(zhuǎn)移到LB斜面試管中，4 ℃保存，備用。

1.2.2抑菌活性測定(濾紙片法)

將分離得到的菌株活化后挑取單菌落接種于NA培養(yǎng)基中，37 ℃，120 r/min下振蕩發(fā)酵培養(yǎng)6 d。將發(fā)酵液用80%丙酮-水(v/v)溶液浸泡提取1 h，過濾后的菌絲體再用丙酮-水溶液重復(fù)提取2次后，合并提取液，減壓濃縮至不含丙酮后，用蒸餾水溶解，過濾后測試抑菌活性，平行重復(fù)3次，同時，分別以制霉素和鏈霉素作為陰性對照及陽性對照，將上述平板于37 ℃培養(yǎng)24 h 后觀察并測量抑菌圈的直徑。

1.2.3形態(tài)學(xué)觀察

從保藏菌種的斜面培養(yǎng)基中挑取菌落轉(zhuǎn)接到LB平板培養(yǎng)基中間位置，37 ℃培養(yǎng)1～3 d，觀察菌落大小、顏色、質(zhì)地等形態(tài)特征。

1.2.4菌株生理生化特性測定

參考文獻(xiàn)([9-11])測定菌株的生理生化特征。

1.2.5基因組DNA的提取

挑單菌落接種到10 mL LB培養(yǎng)基中37 ℃振蕩過夜培養(yǎng)。取2 mL培養(yǎng)液到2 mL Eppendorf管中，8 000 r/min離心2 min后倒掉上清液。加140 μL TE打散細(xì)菌，再加入60 μL 10 mg/mL的溶菌酶。37 ℃放置10 min。加入400 μL Digestion Buffer，混勻。再加入3 μL Protein K，混勻，55 ℃溫育5 min。加入260 μL乙醇，混勻，全部轉(zhuǎn)入UNIQ-10柱中。10 000 r/min離心1 min，倒去收集管內(nèi)的液體。加入500 μL 70%乙醇(Wash Solution)，10 000 r/min離心0.5 min。重復(fù)上一步驟。再10 000 r/min離心2 min徹底甩干乙醇。吸附柱轉(zhuǎn)移到一個新的1.5 mL的離心管。加入50 μL預(yù)熱(60 ℃)的洗脫緩沖液，室溫放置3 min。12 000 r/min離心2分鐘，收集DNA 濾液。提取的基因組DNA 在1%瓊脂糖凝膠中電泳檢測(120 V，30 min)，EB(溴化乙錠)染色。4 ℃保存?zhèn)溆茫蛴?20 ℃環(huán)境下長期保存。

1.2.616S rRNA基因片段的PCR擴(kuò)增

16S區(qū)域的擴(kuò)增選擇細(xì)菌16S rRNA的通用擴(kuò)增引物16S(F)(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’) /16S(R)(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)，PCR反應(yīng)條件為預(yù)變性94 ℃ 3 min，變性94 ℃ 30 s，退火45 ℃ 1 min，延伸72 ℃ 1 min 40 s，共35個循環(huán)，最后延伸72 ℃ 7 min[12]。

1.2.716S rRNA序列克隆測序

采用TaKaRA DNA提取試劑盒Ver 3.0回收PCR產(chǎn)物，純化的PCR產(chǎn)物與pMD19-T載體連接，然后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α制備的感受態(tài)細(xì)胞中。在-70 ℃保存的100 μL感受態(tài)細(xì)胞E.coli DH5α中加入10 μL連接產(chǎn)物，冰中放置30 min，取出后42 ℃熱激90 s，加入890 μL LB液體培養(yǎng)基37 ℃振蕩培養(yǎng)1 h。菌液涂布于含氨芐青霉素AMP(100 μg/mL)的LB培養(yǎng)基平板，倒置過夜培養(yǎng)，挑取白色單菌落培養(yǎng)。取0.5 μL菌液直接做PCR，引物為M13RV和M13-47，電泳檢測是否含有目的片段。PCR采用25 μL的反應(yīng)體系，包括13.75 μL ddH2O，7.5 μL PCR Buffer(10×，Mg+plus)，2 μL dNTP(2.5 mmol/L each)，0.5 μL Primer-F(20μmol/L)，0.5 μL Primer-R(20μmol/L)，0.5 μL DNA，0.25 μL Taq polymerase(5U/μL)。

1.2.8目的DNA序列的測序和系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析

PCR擴(kuò)增菌株的16S r DNA，切膠回收目的條帶與載體連接后于感受態(tài)細(xì)胞中表達(dá)，挑取陽性克隆子送上海美吉生物有限公司測序。將獲得的序列于EzTaxon[13](http://eztaxon-e.ezbiocloud.net)數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源性搜，下載同源性最高的基因序列，利用ClastalX(1.83)軟件[14]進(jìn)行多重比對分析，使用MEGA6.0軟件[15]和Neighbor-Joining(N-J)法[17]構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，自展值1 000。

1.2.9質(zhì)譜測定方法

將分離得到的菌株發(fā)酵7 d，丙酮提取發(fā)酵產(chǎn)物，過濾后直接進(jìn)樣分析。質(zhì)譜參數(shù)：電噴霧離子源(ESI)，離子源溫度500 ℃，氣簾氣25.0 psi，噴霧電壓5 500.0 V，離子源氣1: 55.0 psi，離子源氣2: 50.0 psi。

2結(jié)果與分析

2.1海蘆筍內(nèi)生菌分離及抑菌活性篩選結(jié)果

采用表面消毒方法從海蘆筍植株樣本中分離出13株內(nèi)生細(xì)菌，用濾紙片法[18]對內(nèi)生細(xì)菌次生代謝產(chǎn)物的抑菌活性進(jìn)行測試，結(jié)果如表1所示。在13株測試菌株中，菌株HLS-7和HLS-8對大腸桿菌、金色葡萄球菌、恥垢分枝桿菌和白假絲酵母表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制活性，其抑菌圈直徑均>10 mm(圖1)，提示這2株菌可能產(chǎn)生具有抗菌作用的活性物質(zhì)。

2.2菌株形態(tài)學(xué)鑒定

菌株HLS-7幼齡菌落為圓形，表面和邊緣光滑，呈白色不透明狀。30 ℃培養(yǎng)3d后，菌落呈凸?fàn)盥∑?，顏色仍為白色。菌株HLS-8幼齡菌落為圓形，表面和邊緣光滑，呈白色，不透明，37 ℃培養(yǎng)3d后，菌落形狀不規(guī)則，邊緣不整齊，表面干燥褶皺，菌落顏色略微變黃(見圖2)。

表1　海蘆筍內(nèi)生細(xì)菌抑菌試驗結(jié)果(n=3)

注: A-大腸桿菌; B- 枯草芽孢桿菌; C- 金色葡萄球菌; D-恥垢分枝桿菌; E-產(chǎn)氣腸桿菌; F-單增李斯特菌; G-肺炎克雷伯菌; H-白假絲酵母;- : 無活性; + : 抑菌圈直徑< 10 mm; + + : 抑菌圈直徑10 ～ 15 mm; + + + : 抑菌圈直徑> 15 mm。

a-大腸桿菌; b-金色葡萄球菌; c-恥垢分枝桿菌; d-白假絲酵圖1　內(nèi)生細(xì)菌的抗菌活性Fig.1　Antibacterial activity of the fermentation broth of endophytic bacteria

圖2　內(nèi)生細(xì)菌的菌落特征Fig.2　The morphological characters of the endophytic bacteria

2.3菌株生理生化特性

2.3.1碳源的利用

菌株HLS-7、HLS-8對碳源的利用情況如表2所示。從中可見菌株HLS-7能利用D-葡萄糖、蔗糖、甘露醇、D-乳糖和D-木糖，不能利用D-果糖和半乳糖。菌株HLS-8能利用D-葡萄糖、蔗糖、甘露醇、D-果糖、半乳糖和D-木糖，不能利用D-乳糖。通過與文獻(xiàn)比較，發(fā)現(xiàn)菌株HLS-7和HLS-8分別與B. qingshengii[19]和B. methylotrophicus[20—21]的碳源的利用情況基本一致。

2.3.2理化指標(biāo)

菌株HLS-7、HLS-8的生理生化實驗結(jié)果如表3所示。從中可見菌株HLS-7為革蘭氏陽性菌，無運動性，最適生長溫度為30 ℃，最適pH為7，耐鹽范圍為2%～10%；氧化酶、接觸酶、酪素水解、淀粉水解、檸檬酸利用和明膠液化反應(yīng)均為陽性；甲基紅、V-P試驗和硝酸鹽還原反應(yīng)為陰性。菌株HLS-8為革蘭氏陽性菌，有運動性，最適生長溫度為30 ℃，最適pH為7，耐鹽范圍為2%～7%；氧化酶、接觸酶、酪素水解、淀粉水解、明膠液化反應(yīng)、V-P試驗和硝酸鹽還原均為陽性，甲基紅、檸檬酸利用反應(yīng)為陰性。通過與文獻(xiàn)比較，發(fā)現(xiàn)菌株HLS-7 和HLS-8分別與B. qingshengii[19]和B. methylotrophicus[20-21]的生理生化指標(biāo)基本一致。

表2　菌株HLS-7和HLS-8與模式菌株B. qingshengii和

注“+”表示利用；“-”表示不利用；“NR”表示未見報道。

表3　菌株HLS-7和HLS-8與模式菌株B. qingshengii和

注“+”表示陽性反應(yīng)；“-”表示陰性反應(yīng)；“NR”表示未見報道。

2.4菌株 HLS-7、HLS-8 的16S rDNA 基因序列

擴(kuò)增菌株 HLS-7、HLS-8的 16S rDNA 基因序列，得到了長度約 1.5 kb 的擴(kuò)增片段，其電泳結(jié)果如圖 3 所示。目的片段經(jīng)克隆后測序，測得菌株 HLS-7的16S rDNA為1392 bp，菌株 HLS-8的16S rDNA為1583 bp，與普通細(xì)菌的16S rDNA 基因片段大小基本一致。將二者序列分別于GenBank數(shù)據(jù)庫中注冊，獲得序列號分別為KT999392和KT999393。

圖3　菌株HLS-7、HLS-8的16S rRNA基因片段擴(kuò)增圖譜Fig.3　PCR production of a fragment of 16S rRNA from HLS-7，HLS-8

2.5系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析

將菌株HLS-7的16S rRNA序列在EzTaxon數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源性搜索，下載同源性較高菌株的16S rRNA基因序列，使用ClustalX (1.83) 軟件進(jìn)行多序列分析，并通過MEGA 6.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖4)。從系統(tǒng)發(fā)育樹中可以看出，菌株HLS-7與B.qingshengiiG19T(JX293295)聚為一枝，表現(xiàn)出較近的親緣關(guān)系，相似度為100%。因此將其初步鑒定為慶生芽孢桿菌(B. qingshengii)。

圖4　基于16S rRNA 基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4　Neighbor-Joining phylogenetic tree based on partial 16S rRNA sequences

將菌株HLS-8的16S rRNA序列在EzTaxon數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源性搜尋，下載同源性較高菌株的16S rRNA基因序列，使用ClustalX (1.83) 軟件進(jìn)行多序列分析，利用MEGA 6.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖5)。從系統(tǒng)發(fā)育樹中可以看出，菌株HLS-8與B. methylotrophicus CBMB205T(EU194897)聚為一枝，表現(xiàn)出較近的親緣關(guān)系，相似度為100%。因此將其初步鑒定為甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌(B. methylotrophicus)。

綜合形態(tài)學(xué)鑒定、生理生化特征和16S rDNA序列分析結(jié)果，將菌株HLS-7鑒定為細(xì)菌界Bacteria、厚壁菌門Firmicutes、細(xì)菌綱Bacilli、芽孢桿菌目Bacillales、芽孢桿菌科Bacillaceae、芽孢桿菌屬Bacillus、慶生芽孢桿菌B. qingshengii；將菌株HLS-8鑒定為細(xì)菌界Bacteria、厚壁菌門Firmicutes、細(xì)菌綱Bacilli、芽孢桿菌目Bacillales、芽孢桿菌科Bacillaceae、芽孢桿菌屬Bacillus、甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌B. methylotrophicus。

2.6抗菌產(chǎn)物成分初步分析

將株菌HLS-7和HLS-8發(fā)酵7 d后，丙酮提取發(fā)酵產(chǎn)物濃縮蒸干后，用適量蒸餾水溶解，于ESI-MS進(jìn)行分析，結(jié)果如圖6所示。從圖6A中可見，菌株HLS-7的粗提物在m/z 1 135.7、1 020.9、1 034.9、1 035.9處出現(xiàn)碎片離子峰，為Iturin類化合物的特征分子離子質(zhì)量，提示發(fā)酵產(chǎn)物中可能存在Iturin類化合物，另外，在m/z 1 480.9處出現(xiàn)碎片離子峰，可能是Fenycin的分子離子質(zhì)量，提示發(fā)酵產(chǎn)物中可能存在Fenycin類化合物。從圖6B中可見，菌株HLS-8的發(fā)酵產(chǎn)物在m/z 1 020.9、1 034.9、1 035.9 處出現(xiàn)碎片離子，為Iturin類化合物的特征分子質(zhì)量，提示發(fā)酵產(chǎn)物中可能存在Iturin類化合物。

3討 論

內(nèi)生菌能夠產(chǎn)生結(jié)構(gòu)新穎、活性多樣的生物活性物質(zhì)，這為利用微生物培養(yǎng)與發(fā)酵技術(shù)挖掘新型活性物質(zhì)提供了有效途徑。1993年STIERLE[24]首次從短葉紅豆杉(Taxusbreviflia)中分離得到1株能合成抗癌物質(zhì)紫杉醇的內(nèi)生真菌Taxomycesandreanae，從其發(fā)酵產(chǎn)物中提取到紫杉醇。這為解決紅豆杉生長緩慢且紫杉醇產(chǎn)量低的問題提供了新的途徑。WICKLOW等[24]從玉米種分離得到1株內(nèi)生真菌Acremoniumzeae，首次從該菌中分離出抗菌物質(zhì)pyrrocidines A和B。此類抗生素對黃曲霉和枯萎病菌有抗菌活性，可防止霉菌污染，有效提高玉米產(chǎn)量。張俊楠等[24]從鹽生海蘆筍中分離得到1株具有抑菌活性的內(nèi)生真菌Fusariumtricinctum，對其發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行分離提取，從中得到化合物fusartricin(1)、fusarielin B(2)和enniatin B(3)，其中fusartricin(1)是一種新型的倍半萜醚類化合物，對E.aerogenes，M.tetragenu和C.albicans有較強(qiáng)的抑制活性，fusarielin B(2)和enniatin B(3)也均顯示出廣譜抑菌活性，這為挖掘?qū)θ梭w有益的活性物質(zhì)提供了理論基礎(chǔ)。因此，從植物中分離內(nèi)生菌，挖掘活性次級代謝產(chǎn)物已經(jīng)成為農(nóng)業(yè)、生物制藥與功能食品研究領(lǐng)域的熱點。

從植物內(nèi)生菌分離出的生物活性物質(zhì)中約有51%的新型化合物，其中多種化合物具有廣譜抑菌活性，這對開發(fā)新型抗菌物質(zhì)極具研究價值[26]。芽孢桿菌作為一種常見的植物內(nèi)生細(xì)菌，也是活性化合物的重要來源。芽孢桿菌能夠?qū)?、紫外線、鹽堿環(huán)境和某些化學(xué)藥品產(chǎn)生強(qiáng)抗性的芽孢，因此能夠忍受很多不良的生長環(huán)境[27]。由于這些特殊的生物學(xué)特征，芽胞桿菌能夠產(chǎn)生多種活性物質(zhì)，如多肽、環(huán)肽、脂肽、脂肽抗生素、蛋白酶類、大環(huán)內(nèi)酯類及香豆素類等，其中，有些活性物質(zhì)已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥業(yè)及工農(nóng)業(yè)[28]。

本研究從野生海蘆筍中分離純化得到13株內(nèi)生細(xì)菌。采用濾紙片法對內(nèi)生細(xì)菌次生代謝產(chǎn)物的抑菌活性進(jìn)行評價，篩選得到2株對8種受試致病菌具有較強(qiáng)抑制活性的內(nèi)生細(xì)菌HLS-7和HLS-8，通過培養(yǎng)特征、生理生化特征觀察與分子生物學(xué)相結(jié)合的方法，對分離自海蘆筍的2株具有廣譜抑菌活性的內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行鑒定。提取菌株基因組DNA后，擴(kuò)增16S rDNA基因片段并測序，測序結(jié)果在EzBioCloud數(shù)據(jù)庫進(jìn)行有效種的序列相似性搜索，構(gòu)建16S rDNA基因序列進(jìn)化樹。根據(jù)進(jìn)化樹結(jié)果，結(jié)合培養(yǎng)特征、生理生化特征，將菌株HLS-7鑒定為慶生芽孢桿菌B.qingshengii，HLS-8鑒定為甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌B. methylotrophicus。但目前國內(nèi)外對于這兩類菌株的報道均較少。

圖5　基于16S rRNA 基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5　Neighbor-Joining phylogenetic tree based on partial 16S rRNA sequences

圖6　HLS-7 (A)和HLS-8 (B)發(fā)酵產(chǎn)物質(zhì)譜圖Fig.6　Mass spectrum diagram for HLS-7 (A) and HLS-8(B)

B.qingshengii是XI等[19]在2014年從風(fēng)化巖(凝灰?guī)r)表面分離出1株芽孢桿菌屬的新成員，該菌株為需氧菌，呈革蘭氏陽性，棒狀，形成內(nèi)生孢子，表現(xiàn)為過氧化氫酶和氧化酶陽性。目前該菌種僅在巖石表面分離得到[19]，本研究首次以鹽生海蘆筍為來源分離出該菌，發(fā)現(xiàn)其對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等多株病原菌有良好的抑菌活性，通過對其發(fā)酵產(chǎn)物的初步鑒定，推測該菌株能夠產(chǎn)生具有顯著抗菌活性的脂肽類化合物Fenycin和Iturin，提示B.qingshengii的抗菌活性可能源于抗菌脂肽。

B.methylotrophicus是1株極具開發(fā)前景的微生物菌株，近年來受到廣泛關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)該菌具有特殊的代謝機(jī)制，能夠產(chǎn)多種抑菌活性物質(zhì)。姜云等[29]發(fā)現(xiàn)B.methylotrophicus能夠產(chǎn)生一種具有抗紫外線、耐熱、耐酸堿和耐蛋白酶降解的抗菌蛋白，而且，該蛋白對人參銹腐病菌有較強(qiáng)拮抗作用，能夠有效防治人參銹腐病。呂倩等[30]從南海深海中分離出1株B.methylotrophicus，該菌能夠產(chǎn)生多種抗菌脂肽，具有較強(qiáng)抑制黃瓜炭疽病菌、立枯絲核菌、黃瓜枯萎病菌等植物病原真菌的作用。本研究首次從鹽生海蘆筍中分離鑒定到該菌，發(fā)現(xiàn)其對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等多株病原菌有較強(qiáng)的抑菌活性，通過對其代謝產(chǎn)物初步分析，推測該菌能夠產(chǎn)生脂肽類化合物Iturin，提示B.methylotrophicus的抗菌活性可能源于抗菌脂肽。

海蘆筍內(nèi)生細(xì)菌由于生活在高鹽環(huán)境，在長期的進(jìn)化過程中，形成了獨特的代謝機(jī)制，能夠產(chǎn)生具有特殊生物活性的酶類，催生結(jié)構(gòu)新穎、活性獨特的次級代謝產(chǎn)物。本研究以抑菌活性為指標(biāo)，對鹽生海蘆筍中的內(nèi)生細(xì)菌發(fā)酵液進(jìn)行抑菌作用研究，其目的在于篩選出能夠產(chǎn)生較強(qiáng)抑菌活性物質(zhì)的菌株HLS-7和HLS-8。今后將這2株菌的次級代謝產(chǎn)物進(jìn)行大量發(fā)酵，通過分離純化技術(shù)，進(jìn)一步研究其中的單體化合物結(jié)構(gòu)，為深入揭示內(nèi)生細(xì)菌和宿主海蘆筍之間的關(guān)系以及挖掘新型抗菌活性物質(zhì)提供理論依據(jù)。

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Isolation and identification of endophytic bacteria fromSalicorniabigeloviiTorr. and their antimicrobial activities

RAN Huo-miao, KONG Wang-jun, JIANG Hui-fang, SHI Ya-ning, XIN Zhi-hong*

(College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

ABSTRACTBased on the antimicrobial bioassay-guided screening, 13 endophytic bacteria were isolated from Salicornia bigeloviiTorr. by spread plate and slant culture methods. The antimicrobial activities of these isolates were tested against 8 strains of pathogens. Among the 13 tested isolates, the isolate HLS-7 and HLS-8 showed strong inhibitory activities against E. coli, S. aureus, M. smegmatis and C. albicans with the inhibition zone diameters more than10 mm, meanwhile showed a broad-spectrum antimicrobial activities against B. subtilis, E. aerogenes, L. monocytogenes and K. penumoniae. The 16S rDNA region of these two isolates were amplified by polymerase chain reaction (PCR) and were subjected to monoclone，sequencing and homology analysis， their phylogenetic trees were established as well. Combined with physiological and biochemical experiments, these two isolates were identified as B. qingshengii and B. methylotrophicus, respectively. The electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS) analysis of the fermentant products indicated that the isolate HLS-7 could highly produced cyclic lipopeptides Fengycin and Iturin，whereas the strain HLS-8 produced Iturin，suggesting that the antimicrobial activities of these two isolates probably derived from cyclic lipopeptides．The current study lays the foundation for further revealing of the relationship between the endophytes and its host as well as mining of active components with antimicrobial activities.

Key wordsSalicornia bigelovii Torr.; endophytic bacteria; antimicrobial activity; identification; lipopeptide

收稿日期：2015-10-21，改回日期：2015-12-03

基金項目：2015年農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估項目(GJFP2015012)

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201603014

第一作者：碩士研究生(辛志宏教授為通訊作者，E-mail：xzhfood@njau.edu.cn)。