人乳與牛乳天然小分子蛋白肽的差異對比及功能分析

彭秀明，潘巖，葉清，楊梅，武俊瑞，劉彪，岳喜慶*

1(沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，遼寧 沈陽，110866)　2(內(nèi)蒙古伊利實(shí)業(yè)集團(tuán)股份有限公司，內(nèi)蒙古 呼和浩特，010050)

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人乳與牛乳天然小分子蛋白肽的差異對比及功能分析

彭秀明1，潘巖1，葉清1，楊梅1，武俊瑞1，劉彪2，岳喜慶1*

1(沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，遼寧 沈陽，110866)2(內(nèi)蒙古伊利實(shí)業(yè)集團(tuán)股份有限公司，內(nèi)蒙古 呼和浩特，010050)

摘要研究利用超濾技術(shù)和Tricine-SDS-PAGE電泳將人乳與牛乳中天然存在的小分子蛋白肽進(jìn)行分離。蛋白條帶經(jīng)質(zhì)譜鑒定發(fā)現(xiàn)，人乳小分子蛋白肽含有28種，牛乳小分子蛋白肽含有24種，二者存在18種相同蛋白肽。Gene Ontology(GO)功能注釋分析發(fā)現(xiàn)，在生物過程中，人乳小分子蛋白肽發(fā)揮的作用要高于牛乳小分子蛋白肽，尤其體現(xiàn)在免疫過程中的作用；在分子功能上，二者主要分子功能是結(jié)合作用，其中人乳小分子蛋白肽的結(jié)合作用強(qiáng)，而牛乳小分子蛋白肽參與的轉(zhuǎn)運(yùn)活性的分子功能大于人乳小分子蛋白肽；在細(xì)胞組成上，二者均參與了細(xì)胞與細(xì)胞膜的組成。通過Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)代謝通路分析可知，人乳小分子蛋白肽參與酪氨酸和抗原的加工和呈遞2個代謝通路，而牛乳小分子蛋白肽僅參與系統(tǒng)性紅斑狼瘡代謝通路。對人乳和牛乳中的小分子蛋白肽組成進(jìn)行研究，不僅為揭示人乳蛋白和牛乳蛋白的差異及其生理功能提供了理論依據(jù)，而且為嬰幼兒食品、母乳化制品達(dá)到母乳水平提供有益探索。

關(guān)鍵詞乳；小分子蛋白肽；Tricine-SDS-PAGE電泳；GO功能注釋；KEGG代謝通路

研制嬰兒乳粉和母乳化乳粉，使其他乳制品更接近甚至達(dá)到母乳水平是一種必然趨勢。想要實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)，單從量上達(dá)到母乳水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，更重要的是將其他乳制品在不同組成成分上更接近母乳營養(yǎng)的生物學(xué)效果。母乳是嬰幼兒的最佳食物來源，而乳清蛋白是營養(yǎng)和活性基礎(chǔ)。其主要組分為β-乳球蛋白(β-LG)、α-乳清蛋白(α-LA)、免疫球蛋白(IgG)、乳鐵蛋白(Lf)，還含有一些小分子蛋白質(zhì)，例如酶類、短肽、金屬結(jié)合蛋白質(zhì)等低豐度蛋白質(zhì)[1-2]。由于牛乳蛋白具有較高的營養(yǎng)價值和廣泛的來源，且母乳不能完全滿足嬰幼兒的需求，市場上多以牛乳作為替代品，尤其是以乳清蛋白中的生物學(xué)功能性蛋白為主[3]。然而，較多的研究發(fā)現(xiàn)，比較單一的乳清蛋白并不可以完全滿足嬰幼兒的營養(yǎng)需要[4]。因此，展開對人乳與牛乳乳清蛋白的差異組成的全面研究也越來越重要，特別是天然存在的小分子蛋白肽的研究[5-7]。

近年來，國內(nèi)外對牛乳酶解等處理得到的蛋白肽研究比較成熟；對牛乳中天然存在的生長因子提取研究相對成熟，如利用酸-乙醇和凝膠過濾層析等前處理從牛初乳中分離出胰島素樣生長因子(IGF-I)和采用中空纖維超濾膜從牛初乳中分離純化出牛初乳抗體。此外，乳清蛋白是牛乳重要的營養(yǎng)成分，同時乳清蛋白也是生產(chǎn)干酪或干酪素的副產(chǎn)品。一般每生產(chǎn)1 kg干酪需要消耗10 kg的鮮乳，則分離出9 kg乳清蛋白[8]，這部分資源沒有被充分利用。因此，在現(xiàn)有資源的基礎(chǔ)上綜合利用并深入研究天然存在的小分子蛋白肽，可以實(shí)現(xiàn)資源利用和提高其附加值。

采用超濾技術(shù)、Tricine-SDS-PAGE結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)分離鑒定人乳和牛乳中的小分子蛋白肽，然后通過GO功能注釋和KEGG代謝通路分析兩者在生物過程中的差異與生理功能，不僅為揭示人乳蛋白和牛乳蛋白的差異及其生理功能提供了理論依據(jù)，而且能夠增加牛乳的利用率，使其乳制品更接近或達(dá)到母乳水平，為今后嬰幼兒食品、母乳化制品的研究提供有益探索。

1材料與方法

1.1人乳樣品采集

以某醫(yī)院正常生產(chǎn)、身體健康、頭胎、年齡在24-29周歲、飲食正常的10位乳母的乳汁為研究對象，每天上午9～10點(diǎn)在哺乳前取樣。將采集樣品混合(防止個體差異)于-20℃的條件下保存。

1.2牛乳樣品采集

牛乳以輝山乳業(yè)奶牛養(yǎng)殖場的10頭健康奶牛的乳汁為原料，采集乳汁前，用酒精棉球消毒奶牛乳頭，人工擠壓法將乳汁直接擠入滅菌的試管內(nèi)，冰浴中保存立即帶回實(shí)驗(yàn)室。將采集樣品混合(防止樣品差異)于-20℃的條件下保存。

1.3主要試劑

牛血清蛋白，北京索萊寶科技有限公司；丙烯酸胺、Tris、十二烷基硫酸鈉、四甲基乙二胺、N，N-甲叉雙丙烯酞胺、三氯乙酸，美國 Sigma 公司；尿素、硫脲、二硫蘇糖醇、3-[( 3-膽固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸，美國Bio-Rad公司；過硫酸銨、PMSF、NaH2PO4、Na2HPO4、考馬斯亮藍(lán)G-250、乙腈, 北京鼎國生物技術(shù)有限公司；NH4HCO3、 三氟乙酸、冰醋酸試劑,均為分析純。

1.4主要儀器

DW-86L486型超低溫保存箱，青島海爾特種電器有限公司；CT14RD冷凍離心機(jī)，上海天美科學(xué)儀器有限公司；pHs-25c pH計(jì)，上海理達(dá)儀器廠；8400超濾杯、超濾膜，密理博公司；FD5-3P冷凍干燥機(jī)，美國西盟國際有限公司；UV-2100紫外-可見分光光度計(jì)，尤尼柯上海儀器有限公司；Bio-Rad Mini電泳系統(tǒng)，美國Bio-Rad公司；MicrOTOF-QII質(zhì)譜儀，賽默飛世爾科技。

1.5實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1乳清蛋白質(zhì)的提取[9]

將混勻的乳樣置于低溫高速離心機(jī)中，0 ℃，12 000 r /min，離心50 min。離心處理后，小心取中間的乳清部分。用醋酸-醋酸鈉緩沖液將pH值調(diào)至4.7，靜置30 min后，于0 ℃，12 000 r/min離心5 min，收集上清液即為乳清蛋白。牛乳乳清蛋白的提取同上。

1.5.2超濾分離天然小分子蛋白肽[10]

一般小分子量的酶解多肽具有生物活性，因此本試驗(yàn)選用10 kDa進(jìn)行超濾。超濾步驟：乳清蛋白→0.45 μm微濾膜過濾(去除大分子蛋白) →10 kDa超濾→1 kDa超濾(去除水、乳糖及鹽類)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)室條件，在0.25 MPa，25 ℃，30 min，pH值為7的條件下進(jìn)行超濾。得超濾液，冷凍干燥備用。

1.5.3Tricine-SDS-PAGE電泳[11]

用適合分離多肽的Tricine-SDS-PAGE電泳方法進(jìn)行分離。將提取得到的小分子蛋白肽粉末分別加入裂解液并置于冰盒上裂解，采用Bradford法進(jìn)行定量。分別取10 μL上樣，采用16%的分離膠(含尿素)進(jìn)行Tricine-SDS-PAGE電泳。3層膠的配制(略有改進(jìn))如表1。

表1　Tricine-SDS-PAGE三層膠的配制表

1.5.4LC-MS/MS鑒定及數(shù)據(jù)分析

還原烷基化蛋白質(zhì)消化后，取10μL樣品上機(jī)進(jìn)行LC-MS/MS檢測，用MicrOTOF-QII質(zhì)譜儀(brukerdaltonics)進(jìn)行質(zhì)譜分析。液相prominence nano 2D (shimazhu)，柱料C18，5μm，150A (Eprogen)，流速400nL/min，MS/MS掃描范圍50～2200 m/z，碰撞氣體氬氣，毛細(xì)管電壓1 500 V，干燥氣體溫度150 ℃。

提取質(zhì)譜數(shù)據(jù)，利用data analysis軟件標(biāo)峰后，進(jìn)行MASCOT搜索。搜索數(shù)據(jù)庫為Uniport_Bovidae_88054_20150511和uniprot_human_142183_20150114的合并庫。最后得到鑒定的結(jié)果。

1.5.5GO功能注釋及KEGG代謝通路分析

GO數(shù)據(jù)庫由生物過程(biological process)、分子功能(molecular function)和細(xì)胞組成(cellular component)3部分的功能信息組成。利用DAVID bioinformatics resources在線工具進(jìn)行數(shù)據(jù)庫查詢及檢索，得到GO功能信息及KEGG代謝通路結(jié)果。

2結(jié)果與分析

2.1樣品縮寫及蛋白質(zhì)含量

通過表2可以看出，HWPP和BWPP的蛋白含量上存在差異。2組HWPP的蛋白含量均高于BWPP的蛋白含量，可能是因?yàn)槿巳橹?，乳清蛋白占總蛋?0%～60%，而牛乳中，乳清蛋白卻不足20%。從HWPP和BWPP提取的蛋白含量上來看，均滿足Tricine-SDS- PAGE電泳的需要。

表2　樣品的蛋白定量結(jié)果

2.2Tricine-SDS-PAGE結(jié)果

圖1可以看出，各組樣品條帶分離比較清晰，不同來源蛋白肽可以進(jìn)行差異對比分析，且此法具有較好的重復(fù)性。從圖2可以看出，1泳道(BWPP)可見9條較清晰的蛋白條帶，而4泳道(HWPP)可見8條較清晰的蛋白條帶。從條帶分布來看，1泳道條帶整體分布比較集中，4泳道條帶整體分布較分散，其中第2條條帶差異較大，這說明HWPP 和BWPP具有相似性，但又存在著差異性。選取1、4號泳道的條帶進(jìn)行質(zhì)譜檢測。

圖1　Tricine-SDS-PAGE結(jié)果Fig.1　The result ofTricine-SDS-PAG

圖2　液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜檢測泳道Fig.2　LC-MS/MS inspection lane

2.3牛乳和人乳小分子蛋白肽的質(zhì)譜鑒定結(jié)果分析

由表3、表4可知，從蛋白組成上，HWPP有28種蛋白肽，BWPP有24種蛋白肽，二者存在18種相同蛋白肽，同時，二者都有差異性蛋白，HWPP含有10種差異蛋白肽，如谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶P、DRB1移植抗原、結(jié)合珠蛋白、金屬硫蛋白等，BWPP含有6種差異蛋白肽，如分泌球蛋白3A家族1、分泌球蛋白1D家族2、牛αs1-酪蛋白等。從分子質(zhì)量上，二者蛋白肽的分子質(zhì)量均超過超濾膜10 kDa， 可能由于超濾過程中壓力過大，將超過截留分子質(zhì)量的蛋白也壓入目標(biāo)濾液中。此外，大多數(shù)是高分子質(zhì)量的多肽，而小分子多肽過少，可能有3種原因，(1)是高豐度蛋白影響了低豐度蛋白的表達(dá)，(2)是因?yàn)樾》肿拥碾暮勘容^低，需要富集、純化，(3)是已知的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中，還沒有小分子肽的表達(dá)信息。因此，二者無論從蛋白組成還是分子質(zhì)量的分布來看，既有相同部分，也有各自的差異，這也說明了牛乳比較接近母乳，但又與母乳有所差異。

表3　牛乳小分子蛋白肽質(zhì)譜鑒定的結(jié)果

表4　人乳小分子蛋白肽質(zhì)譜鑒定的結(jié)果

2.4GO功能注釋分析

2.4.1牛乳與人乳乳清蛋白中小分子蛋白肽參與生物過程分析

如圖3所示，通過對蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫的檢索，選擇主要的生物過程。BWPP的生物過程主要是免疫系統(tǒng)過程(immune system process)、生物調(diào)控(biological regulation)、代謝過程(metabolic process)、細(xì)胞組成(cellular component)、蛋白折疊(protein folding)；而HWPP的生物過程主要是免疫系統(tǒng)過程、生物調(diào)控、代謝過程。通過對生物過程的分析可知，HWPP在生物過程中發(fā)揮的作用要高于BWPP，尤其體現(xiàn)在免疫系統(tǒng)過程中的作用，可能與HWPP的差異蛋白中性粒細(xì)胞防御素1和DRB1移植抗原的表達(dá)有關(guān)。

圖3　牛乳小分子蛋白肽和人乳小分子蛋白肽的生物過程Fig.3　The biological process of BWPP and HWPP

2.4.2牛乳與人乳乳清蛋白中小分子蛋白肽參與分子功能分析

如圖4所示，HWPP和BWPP參與的分子功能主要為結(jié)合(binding)、酶調(diào)節(jié)活性(enzyme regulator activity)、轉(zhuǎn)運(yùn)活性(transporter activity)、細(xì)胞因子活性(cytokine activity)。其中結(jié)合作用是二者的主要分子功能，HWPP的結(jié)合作用較高，可能與其中含有差異蛋白結(jié)合珠蛋白和酰基輔酶A結(jié)合蛋白有關(guān)。而牛乳蛋白參與的轉(zhuǎn)運(yùn)活性分子功能高于人乳的，可能與其中含有差異蛋白的分泌球蛋白3A家族1和肽酰-脯氨酰-順反式異構(gòu)酶有關(guān)。

圖4　牛乳小分子蛋白肽和人乳小分子蛋白肽的分子功能Fig.4　The molecular function of BWPP and HWPP

2.4.3牛乳與人乳乳清蛋白中小分子蛋白肽的細(xì)胞組成分析

如圖5所示，HWPP和BWPP主要參與的細(xì)胞組成為細(xì)胞外部分(extracellular region)、細(xì)胞內(nèi)部分(intracellular part)、膜(membrane)、高分子復(fù)合物(macromolecular complex)。二者均參與了細(xì)胞與細(xì)胞膜的組成，主要為β-防御素1、組蛋白H2A、免疫球蛋白重鏈、Histatherin(抗菌肽)。

圖5　牛乳小分子蛋白肽和人乳小分子蛋白肽參與的細(xì)胞組成Fig.5　The cellular component of BWPP and HWPP

2.4.4牛乳與人乳乳清蛋白小分子蛋白肽的KEGG代謝通路分析

如表5所示，BWPP參與1個代謝通路，即系統(tǒng)性紅斑狼瘡代謝，從代謝通路可知，主要是BWPP的組蛋白H2A調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)所產(chǎn)生的生物效應(yīng)，其在機(jī)體內(nèi)起著非常重要的作用；HWPP參與2個代謝通路，分別是酪氨酸代謝通路和抗原的加工和呈遞代謝，從代謝通路可知，主要是來自HWPP的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SEC24D、β-乳球蛋白和DRB1移植抗原參與代謝，3種蛋白肽是調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、能量代謝以及抗原反應(yīng)的關(guān)鍵性因子。這也從代謝角度說明了牛乳與人乳天然的小分子蛋白肽的差異。

表5　不同組成部分的KEGG代謝通路

3結(jié)論

研究通過超濾和Tricine-SDS-PAGE電泳將牛乳與人乳中天然的小分子蛋白肽組成進(jìn)行分離，經(jīng)質(zhì)譜鑒定發(fā)現(xiàn)，人乳小分子蛋白肽含有28種，牛乳小分子蛋白肽含有24種，二者存在18種相同蛋白肽。GO功能注釋及KEGG代謝通路分析表明，二者在生物學(xué)過程、分子功能、細(xì)胞組成及代謝通路上同樣存在較大的差異。對二者不同組成部分進(jìn)行探究，能夠深入的了解人乳與牛乳中的蛋白質(zhì)分布情況，以及不同組成部分蛋白質(zhì)的功能特性，有利于增加牛乳的利用率，使其乳制品達(dá)到母乳化水平。然而，通過質(zhì)譜結(jié)果可以看出牛乳與人乳中天然的小分子蛋白肽在組成上差異較大，可能有3種原因，(1)高豐度蛋白的存在，大大影響到了一些低豐度乳蛋白的表達(dá)；(2)因?yàn)樾》肿与牡暮勘容^低，需要富集、純化；(3)已知的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中還沒有小分子肽的表達(dá)信息。因此，想要更深入的了解人乳與牛乳乳清蛋白中不同部分蛋白質(zhì)在組成及含量上的差異還有待進(jìn)一步的研究。

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Comparison and functional analysis of small molecular protein peptides in breast milk and milk

PENG Xiu-ming1, PAN Yan1, YE Qing1,YANG Mei1,WU Jun-rui1, LIU Biao2, YUE Xi-qing1*

1(College of Food Science, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China)2(Inner MongoliaYili Industrial Group Company Limited by Share Ltd, Hohhot 010050, China)

ABSTRACTIn this study, ultrafiltration and Tricine-SDS-PAGE were used to separate the small molecular protein peptides from breast milk and milk, and mass spectrometry was used for identifying. It showed that there were 28 kinds of proteins in breast milk, 24 kinds of proteins in milk, and 18 kinds of the same expression proteins. It also found that the function of breast milk small molecular protein peptides in the process of biological process was higher than milk’s, especially in immune system, through the functional analysis of Gene Ontology (GO); In the molecular function, the two main functions of small molecular protein peptides were the combination, and the function of breast milk small molecular protein peptides was more stronger. The milk’s involved in the molecule function of transport activity was greater than that of breast milk; In the cell, both were involved in the composition of the cell and cell membrane. Through Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) analysis, it showed that breast milk small molecular protein peptides involved in tyrosine metabolic pathway and antigen processing and presentation pathway, and milk small molecule protein peptides involved in Systemic lupus erythematosus pathway. Studying on small molecule protein peptides provided a useful exploration for the development of functional food and medicinal value of nutrient factors, and could increase the utilization rate of milk. It made dairy more close to the level of breast milk, and provided a theoretical basis for the study of infant food and breast milk products.

Key wordsmilk; small molecular protein peptides; Tricine-SDS-PAGE; GO functional annotation; KEGG pathway

收稿日期：2015-11-19，改回日期：2016-01-18

基金項(xiàng)目：“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國家科技計(jì)劃課題(2013BAD18B03-02)

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201603007

第一作者：碩士(岳喜慶教授為通訊作者，E-mail:yxqsyau@126.com)。