羊乳中類胰島素生長因子I的特性

侯院林，張富新*，李龍柱，于玲玲，云丹，雷飛燕

1(陜西師范大學 食品工程與營養(yǎng)科學學院，陜西 西安，710062)　2(西安市碑林區(qū)食品藥品監(jiān)督管理局，陜西 西安，710000)

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羊乳中類胰島素生長因子I的特性

侯院林1，張富新1*，李龍柱2，于玲玲1，云丹1，雷飛燕1

1(陜西師范大學 食品工程與營養(yǎng)科學學院，陜西 西安，710062)2(西安市碑林區(qū)食品藥品監(jiān)督管理局，陜西 西安，710000)

摘要采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫法研究了溫度、pH、紫外線以及金屬離子等因素對羊乳中類胰島素生長因子I(insulin-like grouth factor-I,IGF-I)濃度的影響。研究表明:羊乳中IGF-I在20 ℃時濃度最高，達到(29.91±0.91) ng/mL(P<0.05)，在40 ℃時具有較高的熱穩(wěn)定性；IGF-I在pH=4時濃度最高，達到(28.53±1.11) ng/mL(P<0.05)，在pH值為6～8時穩(wěn)定性較高；紫外線照射會造成IGF-I的濃度顯著降低(P<0.05)。Na+、Ca(2+)、Al(3+)、Zn(2+)等金屬離子對IGF-I的濃度具有抑制作用，而Mg(2+)、Fe(2+)對IGF-I無明顯影響，低濃度的Fe(3+)、Cu(2+)對IGF-I的濃度具有抑制作用，而高濃度的Fe(3+)、Cu(2+)對IGF-I具有激活作用。通過研究，評估溫度、pH、紫外線以及金屬離子對羊乳中IGF-I濃度的影響，為生產(chǎn)具有更高IGF-I濃度的功能活性羊乳產(chǎn)品提供依據(jù)和指導(dǎo)。

關(guān)鍵詞羊乳；類胰島素生長因子I；特性；雙抗體夾心酶聯(lián)免疫法

羊乳不僅含有人體所需的營養(yǎng)成分，同時還含有多種對人體有益的生物活性物質(zhì)[1]。其中類胰島素生長因子(insulin-like growth factor, IGF)是羊乳中生物活性物質(zhì)的重要組成成分，具有重要的生理功能，對新生兒胃腸道的發(fā)育具有重要的生理作用[2-4]。羊乳中IGF主要以類胰島素生長因子I(insulin-like growth factor-I, IGF-I)和類胰島素生長因子II(Insulin-like growth factor-II, IGF-II)形式存在，其IGF-I濃度和生理活性遠大于IGF-II[5]。IGF-I是由70個氨基酸組成的分子質(zhì)量為7.6 kDa的單鏈多肽，pI為8.2，有3個二硫鍵，分別在6-48、47-52、18-61號位置[6-7]。IGF-I與胰島素的結(jié)構(gòu)相似，對糖尿病具有一定的輔助療效[8]?，F(xiàn)代醫(yī)學表明，IGF-I對糖尿病人降血糖具有一定的作用?！侗静菥V目》中也記載羊奶有“治消渴”(治療糖尿病)的作用。目前，有關(guān)IGF-I對哺乳動物的生理功能方面的研究報道較多[9-10]，但對IGF-I在乳品加工過程中的變化報道較少。由于IGF-I易受pH、溫度等環(huán)境變化影響,容易發(fā)生氧化、變性、聚集或沉淀反應(yīng)等,而乳品加工過程中常伴隨有均質(zhì)、殺菌、噴霧干燥等工藝環(huán)節(jié)[11-13]，會造成乳制品中的IGF-I濃度降低，嚴重削弱了乳制品的營養(yǎng)價值[14-15]。因此，本文對影響羊乳中IGF-I濃度的溫度、pH、紫外線以及金屬離子因素進行研究，評估加工過程對IGF-I濃度的影響，以便為進一步利用羊乳資源，生產(chǎn)具有更高IGF-I濃度的功能活性羊乳產(chǎn)品。

1材料與方法

1.1材料

羊乳：選用西北農(nóng)林科技大學動物科技學院畜牧場健康薩能奶山羊，人工擠奶方式取樣。為防止微生物污染，采樣前用干凈毛巾對乳房清洗，并棄去前3把乳(約30 mL)，然后用預(yù)先滅菌的取樣管采集擠奶中段的乳樣。每只羊收集50 mL乳樣，共收集20個乳樣，然后人工混勻制成混合樣，立即在-40 ℃下冷凍儲存，需要用時在4 ℃的冰水混合浴中解凍備用。

試劑盒：山羊IGF-I酶聯(lián)免疫試劑盒，購自美國R&D公司。

1.2主要設(shè)備

HDM-3000型數(shù)字控溫電熱套，江蘇榮華儀器有限公司；雷磁pHS-3C型精密pH酸度計，上海精密科學儀器有限公司；TGL-16B型臺式低溫高速離心機，上海安亭科學儀器廠；GSP-9080MBE型隔水式恒溫培養(yǎng)箱，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；Multiskan Go型全波長酶標儀，美國熱電公司；移液器(量程：0.5～10、10～100、100～1000 μL)，德國Eppendorf公司。

1.3測定方法

1.3.1樣品處理

樣品處理按LORENZO CASTIGLIEGO[16]方法并加以改進。將冷凍的乳樣在室溫下緩慢解凍后，用移液器吸取1 mL乳樣置于2 mL離心管中，在3 000 g下離心15 min脫脂,吸取400 μL的脫脂乳，加入40 μL 2 mol/L的HCl，充分混合，室溫下靜置30 min后，在4℃，10,000 g下離心30 min。吸取100 μL的上清液，添加264 μL的緩沖溶液(由11.7 mmol/L KH2PO4; 36.2 mmol/L Na2HPO4， 60 mmol/L Tris-base， 體積分數(shù)為0.07%的Tween 20， 250 ng/mL IGF-II組成)，充分混合后，再在4℃，10,000 g下離心10 min，取上清液，用于試劑盒檢測IGF-I濃度。

1.3.2IGF-I的檢測

IGF-I濃度采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫(ELISA)試劑盒測定。將試劑盒在室溫下平衡20 min后，取出試劑盒中板條。取10 μL處理后的乳樣加入板條反應(yīng)孔中，然后加入樣品稀釋液40 μL，再加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的抗體液50 μL，用封板膜封住反應(yīng)孔后，在37℃下保溫60 min。保溫結(jié)束后棄去反應(yīng)孔中液體，將板條翻轉(zhuǎn)，在濾紙上拍干。在反應(yīng)后的反應(yīng)孔中加入350 μL洗滌液，靜置1 min后，棄去洗滌液，在濾紙上拍干，如此重復(fù)5次。在洗滌后的板條反應(yīng)孔中加入底物A、B各50 μL，37℃避光保溫15 min。最后在反應(yīng)孔中加入終止液50 μL，15 min內(nèi)在450 nm波長處測定各孔吸光度。每個樣品重復(fù)3次。

1.3.3IGF-I濃度的計算

將山羊IGF-I酶聯(lián)免疫試劑盒中濃度為10 ng/mL的IGF-I標準品用試劑盒中的標品稀釋液依次稀釋成濃度為0、0.625、1.25、2.5、5、10 ng/mL的溶液。用1.3.2方法檢測不同濃度IGF-I標準品的吸光度，然后以濃度為橫坐標(X)，OD值為縱坐標(Y)，繪制IGF-I標準曲線，計算線性回歸方程(Y= 0.137 1X+ 0.017 2，R2= 0.991 8)，按回歸方程計算測試樣品中IGF-I濃度。

1.3.4溫度對IGF-I濃度影響的測定

將解凍后的混合乳樣分別在20、40、60、80、100、121、135℃的恒溫油浴中加熱15 s后，冷卻至室溫，測定其IGF-I的濃度。

1.3.5IGF-I熱穩(wěn)定性的測定

將解凍后的混合乳樣分別在40、60、80、100℃水浴中保溫15、30、60、120 min，或在121、135℃的恒溫油浴中保溫15、30、60、180 s后,冷卻至室溫，測定其IGF-I濃度。

1.3.6pH對IGF-I濃度影響的測定

在25℃的條件下，用1 mol/L的HCl或1 mol/L的NaOH溶液將乳樣的pH值分別調(diào)整到3、4、5、6、7、8、9、10，放置15 s后，測定其IGF-I的濃度。

1.3.7IGF-I pH穩(wěn)定性的測定

在25℃的條件下，用1 mol/L的HCl或1 mol/L的NaOH溶液將乳樣的pH值調(diào)整到3、4、5、6、7、8、9、10，然后分別放置15、30、60、120 min，測定其IGF-I的濃度。

1.3.8紫外線對羊乳IGF-I濃度的影響

將解凍后的混合乳樣置于12 cm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿中的乳樣高度為3 mm，在室溫條件下，用波長為365 nm的4 W紫外燈在距離乳樣50 cm處分別照射15、30、60、120 min，測定其IGF-I的濃度。

1.3.9金屬離子對羊乳IGF-I濃度的影響

在解凍后的混合乳樣中分別加入濃度為100 mmol/L的CaCl2、ZnCl2、NaCl、AlCl3、FeCl2、FeCl3、CuCl2、MgCl2溶液，使其在羊乳中金屬離子的濃度分別達到1 mmol/L和5 mmol/L，在25 ℃下放置30 min后，測定IGF-I的濃度。

1.4數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)用DPS統(tǒng)計軟件進行分析，并采用Duncan新復(fù)極差法進行顯著性檢驗。

2結(jié)果與分析

2.1溫度對IGF-I濃度的影響

溫度對羊乳中IGF-I濃度的影響如圖1所示。

圖1　溫度對羊乳中IGF-I質(zhì)量濃度的影響Fig.1　Effects of temperature on IGF-I concentrations in goat milk

IGF-I的濃度隨溫度升高呈下降的趨勢。當溫度為20～80 ℃時，IGF-I的濃度下降較為緩慢，而當溫度為80～135 ℃時，IGF-I濃度的下降速度較為迅速。20 ℃時，IGF-I濃度為(29.91 ±0.91) ng/mL，當溫度達到135 ℃時，IGF-I的濃度僅為(24.64±0.87) ng/mL(P<0.05)。TAKUJI HIRAYAMA等人[17-24]研究了溫度對牛乳中IGF-I活性的影響，乳中IGF-I的活性與其結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，IGF-I是一個分子質(zhì)量為7.6 kDa的活性多肽，其結(jié)構(gòu)中含有二硫鍵，熱處理會引起多肽結(jié)構(gòu)中二硫鍵的斷裂，造成羊乳中IGF-I濃度的下降。

2.2IGF-I的熱穩(wěn)定性

羊乳IGF-I的濃度在40、60、80、100 ℃和121、135 ℃的熱穩(wěn)定性分別如圖2-A、圖2-B所示。

圖2　IGF-I的熱穩(wěn)定性Fig.2　Heat stability of IGF-I in goat milk

從圖2-A中可以看出，隨著加熱時間的延長，IGF-I的濃度均呈下降的趨勢，但在不同溫度下保溫相同的時間，IGF-I的濃度下降程度有所差異，在40℃的保溫過程中，前30 min，IGF-I的濃度下降不顯著(P>0.05)，而60 min時，IGF-I的濃度顯著下降(P<0.05)；在60℃的保溫過程中，前15 min，IGF-I的濃度下降不顯著(P>0.05)；在80 ℃和100 ℃的保溫過程中，從0～120 min，IGF-I的濃度始終呈顯著下降趨勢(P<0.05)。從圖2-B中可以看出：在121℃的保溫過程中，前15 s，IGF-I的濃度下降不顯著(P>0.05)，隨后均呈顯著下降趨勢(P<0.05)。在135℃的保溫過程中，IGF-I的濃度均呈顯著下降趨勢(P<0.05)。

由此可見，在同一保溫過程中，在保溫的開始和最后階段，羊乳中IGF-I的濃度下降均較為緩慢，而在其中間階段，其濃度下降較為迅速。在不同的保溫過程中，保溫時間相同時，保持的溫度越高，IGF-I的濃度下降速度越快，其濃度越低。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因是相比較于其他活性生長因子，IGF-I的二級結(jié)構(gòu)中二硫鍵的數(shù)目較少。例如轉(zhuǎn)化生長因子β2(transforming growth factor-β2，TGF-β2)含有9個二硫鍵，而IGF-I的二級結(jié)構(gòu)中只含有3個二硫鍵，造成其對加熱不太敏感。當剛開始保溫時，IGF-I具有一定的熱穩(wěn)定性，其濃度下降較為緩慢，但在持續(xù)的保溫過程中，特別是在高溫環(huán)境中，IGF-I的熱抵抗性迅速減弱，結(jié)構(gòu)逐漸遭到破壞，致使其IGF-I濃度降低。

2.3pH對IGF-I濃度的影響

pH對羊乳中IGF-I濃度的影響如圖3所示。

圖3　pH對羊乳中IGF-I質(zhì)量濃度的影響Fig. 3 Effects of pH on IGF-I concentrations in goat milk

當羊乳的pH值小于4時，隨著pH值的升高，IGF-I的濃度逐漸增高；當羊乳的pH值為4時，IGF-I的濃度((28.53±1.11) ng/mL)最高，當羊乳的pH值高于4時，隨著pH值的升高，IGF-I的濃度逐漸降低；當羊乳的pH值為8時，IGF-I的濃度((23.85±1.53) ng/mL)最低；當羊乳的pH值高于9時，羊乳中IGF-I的濃度又開始逐漸降低。由此可知，在pH值為4時，羊乳中IGF-I的濃度最高。方差分析表明，當羊乳分別在不同的環(huán)境(酸性與堿性)中時，IGF-I的濃度差異顯著(P<0.05)，但在同一種環(huán)境(酸性或者堿性)中時，IGF-I的濃度差異不顯著(P>0.05)。當羊乳的酸性增強(pH<3)或者堿性增強(pH>9)，都會破壞羊乳中IGF-I的二級結(jié)構(gòu)，致使其濃度降低。又因為IGF-I的pI值為8.2，當羊乳從pH=4增大到pH=8的過程中，由于羊乳的pH與IGF-I的pI越來越接近，造成IGF-I的濃度不斷降低，在pH=8時，IGF-I 共價聚集在一起，致使IGF-I的濃度最低。云振宇[25]也認為羊乳在酸性環(huán)境中的濃度高于在堿性環(huán)境中的濃度，在pH值等于8時，IGF-I濃度最低，與本研究中pH對IGF-I濃度影響的研究結(jié)果一致。

2.4IGF-I的pH穩(wěn)定性

羊乳中IGF-I的pH穩(wěn)定性如圖4所示。

圖4　IGF-I的pH穩(wěn)定性Fig.4　pH stability of IGF-I in goat milk

隨著處理時間的延長，羊乳中IGF-I濃度均呈下降的趨勢，但在不同pH下處理相同時間時，IGF-I下降程度有所差異。在pH 3～5和pH 9～10的處理過程中，隨著時間的延長，IGF-I的濃度均呈顯著下降趨勢(P<0.05)。在pH值為6～8的處理過程中，前60 min內(nèi)，IGF-I的濃度呈顯著下降趨勢(P<0.05)，而在60～120 min間，IGF-I的濃度下降不顯著(P>0.05)。由于IGF-I中存在 3 個α-螺旋和2 個β-折疊結(jié)構(gòu)。而IGF-I 的二級和三級結(jié)構(gòu)是依賴于pH值的，過低或者過高的pH會使乳液的酸性或者堿性增強，很可能會破壞羊乳中IGF-I的α-螺旋或者β-折疊結(jié)構(gòu)，造成IGF-I變性或降解，致使其濃度迅速下降。

2.5紫外線對IGF-I濃度的影響

紫外線對羊乳中IGF-I濃度的影響如圖5所示。

圖5　紫外線照射時間對羊乳中IGF-I濃度的影響Fig. 5 The affections of ultraviolet radiation time on IGF-I concentrations in goat milk

隨著紫外線照射時間的延長，IGF-I的濃度呈下降趨勢。剛開始進行紫外線照射時，IGF-I的濃度降低較為緩慢，照射15 min時，IGF-I的濃度為(28.84±1.27) ng/mL(P>0.05)。但隨著照射時間的延長，IGF-I濃度呈急劇下降趨勢。不同照射時間(照射15、30、60、120 min)的羊乳樣品之間，IGF-I的濃度差異極顯著(P<0.01)，當照射120 min時，IGF-I濃度僅剩(7.26±0.57) ng/mL(P<0.01)。由此可見，紫外線會影響羊乳中IGF-I的濃度，隨著紫外照射時間的延長，IGF-I濃度會極顯著降低(P<0.01)，這與羅素菊[26]的結(jié)果基本相似。產(chǎn)生這種結(jié)果的原因可能是因為IGF-I是一個由70個氨基酸構(gòu)成的多肽，而紫外線具有較高的能量，長時間照射會破壞IGF-I的二級結(jié)構(gòu)，從而使其濃度降低。

2.6金屬離子對IGF-I濃度的影響

金屬離子對IGF-I濃度的影響如表1所示。

表1　金屬離子對羊乳中IGF-I濃度的影響　單位：ng/mL

注：表1中空白為不添加金屬離子的乳樣。

從表1中可以看出，不同金屬離子對羊乳中IGF-I濃度具有不同的影響。添加Mg2+、Fe2+時，IGF-I濃度幾乎無明顯變化；而添加Na+、Ca2+、Al3+、Zn2+時，IGF-I的濃度降低，表明Na+、Ca2+、Al3+、Zn2+對IGF-I的濃度具有抑制作用。同時添加1 mmol/L的Fe3+、Cu2+時，IGF-I濃度較低，而添加5 mmol/L的Fe3+、Cu2+時，IGF-I的濃度升高，表明低濃度的Fe3+、Cu2+對IGF-I的濃度具有抑制作用，而高濃度的Fe3+、Cu2+對IGF-I的濃度具有激活作用。金屬離子對IGF-I濃度的影響可能與金屬離子是乳中各種酶的必需組分或者輔助因子有關(guān)，不同金屬離子對酶的結(jié)構(gòu)和功能所起的作用不相同[27]。KIRCHGESSNER等[28]報道，適宜的Cu2+濃度在體外能激活胃蛋白酶，促進類胰島素生長因子結(jié)合蛋白(insulin-like growth factor binding protein I, IGFBP-I)的水解，使IGF-I的濃度增加。而Na+、Ca2+、Al3+、Zn2+在體外可能會抑制胃蛋白酶，抑制IGFBP-I的水解，使IGF-I的濃度降低。

3結(jié)論

通過對羊乳中IGF-I濃度的溫度、pH值、紫外線以及金屬離子等影響因素的研究。結(jié)果表明，IGF-I在20 ℃時濃度較高，且在40 ℃時具有較高的熱穩(wěn)定性，在溫度高于100 ℃時，乳中IGF-I濃度顯著下降；IGF-I濃度受pH影響較大，在pH 4時具有較高濃度，且在pH 6～8時穩(wěn)定性較高，在pH 3～5和pH 9～10時，IGF-I濃度迅速下降；隨著紫外照射時間的延長，IGF-I的濃度損失較大。不同金屬離子對羊乳中IGF-I的濃度具有一定的影響，Na+、Ca2+、Al3+、Zn2+對IGF-I的濃度具有抑制作用，低濃度的Fe3+、Cu2+對IGF-I的濃度具有抑制作用，而高濃度的Fe3+、Cu2+對IGF-I的濃度具有激活作用。

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Investigation on the characteristics of IGF-I in goat milk

HOU Yuan-lin1, ZHANG Fu-xin1*, LI Long-zhu2, YU Ling-ling1,YUN Dan1, LEI Fei-yan1

1(College of Food Engineering and Nutritional Science of Shaanxi Normal University, Xi’an 710062,China)2(Beilin Food and Drug Administration of Xi'an, Xi’an 710000,China)

ABSTRACTEffects of Insulin-like growth factor-I characteristic factors in goat milk were studied to lay the theoretical foundation for the further development of active functional goat products which contained higher IGF-I concentrations. Effects of temperature, pH, ultraviolet and metal ion on IGF-I concentrations in goat milk were studied by double antibody sandwich enzyme-linked immunosorbent assay. The results showed that IGF-I concentrations reached the highest level to (29.91±0.91) ng/mL at 20 ℃ in goat milk(P<0.05)and had higher thermal stability at 40 ℃. IGF-I concentrations were the highest at pH4 with 28.53±1.11 ng/mL(P<0.05), and more stable at pH6～8. IGF-I concentrations in goat milk decreased severely on the condition of ultraviolet radiation(P<0.05). IGF-I concentrations would be inhibited if added Na+，Ca(2+)，Al(3+)，Zn(2+) in goat milk while Mg(2+)，F(xiàn)e(2+) had no effect on this. IGF-I concentrations were inhibited at lower concentrations of Fe(3+) and Cu(2+) . However，it could be activated at higher concentrations of Fe(3+) and Cu(2+). The research evaluate the effect of temperature, pH ultraviolet and metal ion on IGF-I concentrations in goat milk. It provides the basis and guidance for the active functional goat products which contained higher IGF-I concentrations.

Key wordsgoat milk; insulin-like grouth factor-I(IGF-I); characteristics; double antibody sandwich enzyme-linked immunosorbent assay

收稿日期：2015-06-21，改回日期：2015-08-17

基金項目：“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國家科技計劃項目(2013BAD18B00);農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(201103038);陜西省農(nóng)業(yè)攻關(guān)項目(2014K01-17-05)

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201603006

第一作者：碩士研究生(張富新教授為通訊作者,E-mail:891685945@qq.com)。