雌、雄性大鼠局灶性腦缺血－再灌注早期腦損傷的研究*＊?

郭淑娟，王琮民

(1.邯鄲市中心醫(yī)院老年病科，河北邯鄲　056001; 2.河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河北邯鄲　056000)

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雌、雄性大鼠局灶性腦缺血－再灌注早期腦損傷的研究*＊?

郭淑娟1，王琮民2＊＊

(1.邯鄲市中心醫(yī)院老年病科，河北邯鄲056001; 2.河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河北邯鄲056000)

［摘要］目的:研究性別對(duì)局灶性腦缺血－再灌注大鼠早期腦損傷的影響。方法:隨機(jī)取雌、雄健康SD大鼠各12只，分別記為F組和M組，采用栓線法制作大鼠中動(dòng)脈栓塞模型，于缺血2 h再灌注24 h后斷頭取腦，采用TTC染色并測(cè)量各組大鼠腦梗死體積，采用新型熒光探針H2DCF-DA監(jiān)測(cè)大鼠腦內(nèi)活性氧自由基(ROS)陽性細(xì)胞數(shù)目并檢測(cè)平均熒光強(qiáng)度。結(jié)果:缺血2 h再灌注24 h內(nèi)，F(xiàn)組和M組大鼠的死亡率分別為8.33 %和16.77 %，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05) ; TTC染色顯示，F(xiàn)組腦梗死體積為(21.42±3.54) %，M組為(40.01± 4.92) %，F(xiàn)組小于M組(P＜0.05) ; H2DCF-DA染色顯示，F(xiàn)組和M組的腦缺血半暗帶區(qū)ROS陽性細(xì)胞數(shù)目分別為8.56±1.89和19.04±1.37，F(xiàn)組少于M組(P＜0.05)，平均熒光強(qiáng)度分別為20.58±0.89和39.25±1.41，F(xiàn)組少于M組(P＜0.05)。結(jié)論:雌鼠缺血－再灌注損傷在短期內(nèi)較輕，其機(jī)制可能與雌性大鼠腦組織抑制氧自由基能力較強(qiáng)有關(guān)。

［關(guān)鍵詞］性別因素;腦缺血;腦梗死;體積;氧自由基

＊＊通信作者E-mail: qiierrsann@163.com

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間: 2016－02－23網(wǎng)絡(luò)出版地址: http: / /www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160223.1859.018.html

缺血性腦卒中一般是指由于腦動(dòng)脈粥樣硬化引起血管腔狹窄或完全閉塞，導(dǎo)致局部腦血流中斷，腦細(xì)胞缺血缺氧軟化壞死的疾病。缺血性腦卒中的危害性大，治愈率低，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量［1］。有報(bào)道指出，絕經(jīng)前女性的腦卒中發(fā)病率低于同齡男性，而且對(duì)缺血損傷的耐受性高，但絕經(jīng)后女性的腦卒中發(fā)生率顯著增加，提示雌激素水平變化與缺血性腦病的發(fā)生發(fā)展可能有一定關(guān)系［2］。有研究發(fā)現(xiàn)雌激素可促進(jìn)卒中后的腦神經(jīng)再生，有利于神經(jīng)功能恢復(fù)［3］。以往多采用去卵巢或絕經(jīng)的雌性大鼠觀察雌激素對(duì)缺血性腦卒中的影響［4－6］，但對(duì)同等損傷程度、正常生理激素水平及性別因素是否會(huì)對(duì)缺血性腦卒中產(chǎn)生影響，特別是缺血－再灌注短期內(nèi)的影響鮮有報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)探討正常生理激素水平下性別對(duì)局灶性腦缺血－再灌注大鼠早期腦損傷的影響。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)設(shè)備及試劑

呼吸機(jī)(CWE公司，美國)、DGD-300S雙極電凝(Sigma公司，美國)、反饋式溫度調(diào)節(jié)儀(CZ公司，美國)、透射電鏡(Olympus公司，日本)、BH-2手術(shù)顯微鏡(Olympus公司，日本)、高速離心機(jī)(Beckman公司，美國) ; TTC (上海恒遠(yuǎn)公司)、H2DCFA-DA試劑盒(CWE公司，美國)，水合氯醛(10%)、磷酸二氫鈉等。

1.2試驗(yàn)動(dòng)物及模型制作

成年SD雌、雄大鼠各12只，分別記為F組和M組，體質(zhì)量250～300 g，許可證號(hào)SYXK(冀) 2014－0038，采用標(biāo)準(zhǔn)配方飼料分籠飼養(yǎng)，室溫22 ～25℃，術(shù)前禁食，自由進(jìn)水。大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉(3.5 μL/g)，取頸部正中切口，上切至頸與下頜反折處，下切至胸骨角，剪開闊筋膜，找左側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)分叉、分離左側(cè)頸外動(dòng)脈(ECA)和頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)，結(jié)扎ECA遠(yuǎn)心端，離斷，CCA和ICA用動(dòng)脈夾夾閉，在ECA上剪“V”型口并將備好的栓線沿剪口插入，輕輕結(jié)扎，然后松ICA動(dòng)脈夾，栓線調(diào)整角度順勢(shì)插入ICA，遇阻力停止，深度約為18 mm。將栓線與左側(cè)CCA結(jié)扎固定，移去CCA動(dòng)脈夾，腦缺血模型制備成功。2 h后，將栓線從顱內(nèi)輕輕拔出，從球端退至ECA止，剪掉多余的線并縫合皮膚，再灌注開始，記錄再灌注時(shí)間至24 h時(shí)止［7］。

1.3測(cè)定腦梗死體積

再灌注24 h時(shí)，大鼠腹腔注射過量10%水合氯醛麻醉，迅速斷頭，取完整全腦，－24℃冷凍30 min，從額極至枕極沿冠狀位切2 mm厚度切片6片，除第5片用于H2DCF-DA染色計(jì)數(shù)ROS細(xì)胞外，其余5片均浸泡于2% TTC染色液中，37℃溫箱中孵育20 min，每隔5 min翻動(dòng)正反面，拍照，Imageplus5.0計(jì)算腦梗死體積。腦梗死體積百分比= (A－B) /A×100%，A為健側(cè)大腦半球體積= (A1+ A2+…A6)·h，B為梗死側(cè)非梗死區(qū)大腦半球體積= (B1+ B2+…B6)·h，A1為第1片切片健側(cè)腦組織面積，B1代表第1片梗死側(cè)非梗死區(qū)腦組織面積，h表示切片厚度［8］。

1.4測(cè)定活性氧自由基(ROS)陽性細(xì)胞數(shù)目

每個(gè)大鼠均取第5片腦切片用H2DCF-DA染色，按說明書操作，每張切片同等放大倍數(shù)拍照，借用NIS Element軟件，確定腦組織內(nèi)的ROS陽性細(xì)胞數(shù)和其分布密度。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，兩組死亡率比較用Fisher精確概率法，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較用單因素方差分析法，P ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1死亡率

腦缺血2 h再灌注24 h內(nèi)，F(xiàn)組死亡1例，死亡率為8.33%; M組死亡2例，死亡率為16.77%。Fisher精確概率法假設(shè)檢驗(yàn)分析，F(xiàn)組和M組大鼠的病死率無明顯差異，P =0.185。

2.2腦梗死體積

腦缺血2 h再灌注24 h時(shí)，經(jīng)TTC染色，Imageplus5.0軟件分析顯示，F(xiàn)組腦梗死體積為(21.42±3.54) %，M組為(40.01±4.92) %，單因素方差分析顯示，F(xiàn)組大鼠的腦梗死體積小于M組，P =0.0013;如圖1所示紅色區(qū)域?yàn)檎＝M織，白色區(qū)域?yàn)楣Ｋ澜M織。

圖1　兩組腦缺血－再灌注大鼠腦梗死體積Fig.1 The infarction volume of ischemia reperfusion rats in F and M group

2.3缺血半暗帶區(qū)ROS陽性細(xì)胞

缺血2 h再灌注24 h時(shí)，H2DCF-DA染色顯示，F(xiàn)、M兩組大鼠的缺血半暗帶區(qū)均出現(xiàn)H2DCFDA陽性染色細(xì)胞，高倍顯微鏡下，可見胞體顯示綠色熒光，凸起清晰; NIS Element軟件測(cè)定并經(jīng)單因素方差分析顯示，F(xiàn)組ROS陽性細(xì)胞數(shù)少于M 組(P＜0.05)，F(xiàn)組平均熒光強(qiáng)度低于M組(P＜0.05)，見表1及圖2。

表1　兩組大鼠缺血2 h再灌注24 h時(shí)ROS陽性細(xì)胞數(shù)和熒光強(qiáng)度(±s)Tab.1 ROS positive cell number and average fluorescent intensity after 2 h ischemia and 24 h reperfusion in two groups

表1　兩組大鼠缺血2 h再灌注24 h時(shí)ROS陽性細(xì)胞數(shù)和熒光強(qiáng)度(±s)Tab.1 ROS positive cell number and average fluorescent intensity after 2 h ischemia and 24 h reperfusion in two groups

組別　n ROS陽性細(xì)胞(個(gè)) 10　 8.56±1.89　 20.58±0.89 M組　10　 19.04±1.37　 39.25±1.41 P熒光強(qiáng)度F組＜0.05　?。?.05

圖2　兩組大鼠缺血2 h再灌注24 h時(shí)ROS陽性細(xì)胞(H2DCF-DA，×500)Fig.2 H2DCF-DA fluorescence staining results of F and M group after ischemia reperfusion

3　討論

腦缺血尤其是再灌注發(fā)生后，由于缺血缺氧、鈣離子釋放增加和興奮性神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，ROS生成增多，ROS清除酶如超氧化物歧化酶(SOD)及谷胱甘肽過氧化物酶會(huì)大量消耗，同時(shí)合成發(fā)生障礙。細(xì)胞抗氧化能力的下降，造成ROS的爆發(fā)性增長，引起線粒體呼吸功能喪失及細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，加速神經(jīng)元導(dǎo)致死亡。故及時(shí)移除過量的ROS可對(duì)腦缺血－再灌注損傷起到保護(hù)作用［9］。在急性腦梗死早期(一般為24 h內(nèi))，梗死中心區(qū)和正常腦區(qū)之間會(huì)有一個(gè)動(dòng)態(tài)變化的區(qū)域，若血流再通，此區(qū)域可恢復(fù)為正常區(qū)域，腦梗死體積不再擴(kuò)大，這個(gè)區(qū)域稱為缺血半暗帶區(qū)。目前，“挽救”缺血半暗帶區(qū)已成為缺血性腦卒中治療的新靶點(diǎn)［10］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，缺血2 h再灌注24 h時(shí)，雌性大鼠腦梗死體積明顯小于雄性。說明正常生理?xiàng)l件下，同等的損傷程度，雌激素對(duì)腦組織的保護(hù)能力高于雄激素。有研究發(fā)現(xiàn)，缺血－再灌注48 h時(shí)，正常雌性大鼠組的腦梗死體積明顯小于雄性大鼠組(P＜0.05)，但切除卵巢后的雌性大鼠和雄性大鼠的腦梗死體積差異不明顯(P＞0.05)［11］。Kong［12］通過建立頸動(dòng)脈缺血模型發(fā)現(xiàn)，雌性大鼠組的腦損傷明顯小于雄性。臨床統(tǒng)計(jì)資料表明，雌激素可有效提高血管平滑肌功能，可降低低密度脂蛋白和提高高密度脂蛋白濃度。Schierbeck研究發(fā)現(xiàn)，男性的頸總動(dòng)脈血管內(nèi)膜厚度明顯低于同齡絕經(jīng)前的女性，說明絕經(jīng)前女性的血管富有彈性，血流狀態(tài)較好［13］。

H2DCF-DA是一種新型的熒光探針，其進(jìn)入細(xì)胞后可被細(xì)胞內(nèi)的ROS氧化而發(fā)綠色熒光，熒光強(qiáng)度與腦組織ROS生成量線性相關(guān)，其位置與ROS的生成位置一致，平均熒光強(qiáng)度值反映了ROS在腦組織中的分布密度。本實(shí)驗(yàn)采用H2DCF-DA熒光技術(shù)測(cè)定大鼠ROS陽性細(xì)胞，結(jié)果表明，雌性組大鼠缺血半暗帶區(qū)ROS陽性細(xì)胞數(shù)目、平均熒光強(qiáng)度明顯小于雄性，說明生理水平條件下，雌激素抑制ROS生成的能力要高于雄激素，推測(cè)其可能與下列因素有關(guān): (1)雌激素可以上調(diào)缺血－再灌注后的bcl-2表達(dá)［13］，缺血再灌注發(fā)生時(shí)，bcl-2可以抑制鈣離子釋放，降低興奮性氨基酸毒性釋放，從而減少ROS的生成［14］; (2)增加缺血區(qū)域的腦血流量，芩如萍等［15］通過建立局灶性腦缺血模型，證明雌激素可以改善灌注區(qū)的腦血流量，而血流量的增加有利于抗氧化物質(zhì)的生成，從而對(duì)腦組織起到保護(hù)作用。

綜上，正常生理?xiàng)l件下，雌激素可以對(duì)腦缺血－再灌注損傷起到一定的保護(hù)作用，此保護(hù)作用與雌激素抑制ROS的生成有關(guān)。

4　參考文獻(xiàn)

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(2015－06－24收稿，2015－09－25修回)

中文編輯:周凌;英文編輯:劉華

The Influence of Gender on Early Cerebral Damage of Rats after Focal Ischemia Reperfusion

GUO Shujuan1，WANG Congmin2
(1.Department of Geriatrics，Handan Central Hospital，handan 056001，Hebei，China; 2.Department of Neurology，the Affiliated Hospital of Hebei Engineering University，Handan 056001，Hebei，China)

［Abstract］Objective: To investigate the influence of gender on early cerebral damage of rats after focal ischemia reperfusion.Methods: Twenty-four healthy SD rats were randomly divided into F and M groups，including 12 females and 12 males.The rats were subjected to MCAO for 2 h and killed after reperfusion 24 h.The cerebral infarction volume was determined by TTC staining，the intracerebral ROS positive cell number and average fluorescent intensity was monitored and detected by new fluorescent probe H2DCF-DA.Results: After 2 h ischemia and 24 h reperfusion，the rats mortality rates of F and M group were 8.33% and 16.77% respectively，the differences were not statistically significant (P＞0.05).TTC staining showed that the cerebral infarction volume in F group was (21.42±3.54) % while that in M group was (40.01±4.92) %，and the cerebral infarction volume in F group was significantly less than that in M group(P＜0.05).H2DCF-DA staining showed that cerebral ischemia half dark area of oxygen free radical positive cells number of F group 8.56±1.89 was significantly less than that of M group 19.04±1.37(P＜0.05).The average fluorescence intensity of ROS positive cell in F group 20.58±0.89 was significantly less than that of M group 39.25±1.41 (P＜0.05).Conclusion: The reperfusion injury in female rats is less serious in the short term，whose mechanism maybook=167,ebook=48be related to estrogen in brain of female rats inhibiting oxygen free radical.

［Key words］gender; cerebral ischemia; cerebral infarction; volume; oxygen free radical

*［基金項(xiàng)目］國家自然科學(xué)基金(81400934)

［中圖分類號(hào)］R741.02

［文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼］A

［文章編號(hào)］1000-2707(2016) 02-0166-04