正交試驗法優(yōu)選定痛寧顆粒的乙醇提取工藝

張雷 丁安偉

摘要：目的 優(yōu)選定痛寧顆粒的乙醇提取工藝。方法 以浸膏率和丹參酮ⅡA含量等綜合加權(quán)評分為指標(biāo)，采用L18（37）正交設(shè)計試驗，并以乙醇體積分?jǐn)?shù)、加醇量、浸泡時間、提取時間及提取次數(shù)作為考察因素，優(yōu)選定痛寧顆粒的乙醇回流提取工藝。結(jié)果 最佳醇提工藝為藥材浸泡0 h，加6倍量80%乙醇回流提取2次，提取時間3 h。結(jié)論 本研究優(yōu)選的提取工藝穩(wěn)定可行，為定痛寧顆粒的工業(yè)生產(chǎn)提供了依據(jù)。

關(guān)鍵詞：定痛寧顆粒；醇提工藝；丹參酮ⅡA；正交試驗

中圖分類號：R284.1 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：1005-5304（2016）05-0083-04

Optimization of Ethanol Extraction Technology for Dingtongning Granule by Orthogonal Design ZHANG Lei1，2， DING An-wei2 （1. Kunshan Affiliated Hospital of Nanjing University of Chinese Medicine， Kunshan 215300， China； 2. Nanjing University of Chinese Medicine， Nanjing 210023， China）

Abstract： Objective To optimize ethanol extraction technology Dingtongning Granule. Methods With yield of extract and content of tanshinone ⅡA as comprehensive evaluation indexes， the concentration of ethanol， the amount of ethanol， soaking time， extraction time and extraction times were selected as observing factors. Orthogonal design test L18（37） was used to optimize ethanol extraction technology of Dingtongning Granule. Results Optimum extraction conditions were as follows： soaking medicine for 0 hour； 2 times with 6 times of the amount of 80% ethanolre； flux extracted 3 hours each time. Conclusion This optimal extraction technology is stable and reliable， which can provide basis for industrial production of Dingtongning Granule.

Key words： Dingtongning Granule； ethanol extraction technology； tanshinone ⅡA； orthogonal design

定痛寧顆粒為南京中醫(yī)藥大學(xué)昆山附屬醫(yī)院的院內(nèi)制劑，由丹參、白芷、蔓荊子、制川烏、制草烏、川芎、細辛等10味藥組成，具有活血化瘀、祛風(fēng)止痛功效，主要用于治療血瘀氣滯等引起的偏正頭痛，多年臨床實踐顯示其具有良好療效。但目前定痛寧顆粒制備工藝只是進行簡單的水提、濃縮，難以做到最大限度提取有效成分，可能影響藥物療效。因此，結(jié)合藥材性質(zhì)和臨床功效需要，本研究對方中川芎、細辛進行揮發(fā)油提取，赤芍、紅花、牛膝采用水提。而方中丹參、白芷、蔓荊子、制川烏、制草烏主要有效成分分別為丹參酮ⅡA、隱丹參酮、異歐前胡素、歐前胡素、環(huán)烯醚萜類及木脂素類化合物、烏頭類生物堿，易溶于乙醇和乙醚等有機溶劑，轉(zhuǎn)移率較高。本試驗主要針對丹參、白芷、蔓荊子、制川烏、制草烏中的脂溶性成分，以浸膏中丹參酮ⅡA含量和干浸膏率為評分指標(biāo)，采用正交試驗法優(yōu)選定痛寧顆粒的乙醇提取工藝。

1 儀器與試藥

Agilent 1100型高效液相色譜儀（美國安捷倫公司），F(xiàn)A2004N型1/萬電子分析天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司），BS21S型1/10萬電子分析天平（德國賽多利斯公司），HHS型恒溫水浴鍋（上海博迅實業(yè)有限公司），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海申勝生物技術(shù)有限公司），SHB-ⅢS型循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）。

丹參、白芷等藥材均購于昆山市國醫(yī)堂中草藥房，經(jīng)昆山市中醫(yī)醫(yī)院藥劑科主任李青松副主任中藥師鑒定，符合2010年版《中華人民共和國藥典》標(biāo)準(zhǔn)；丹參酮ⅡA（純度>98%，中國食品藥品檢定研究院，批號110766-200619），甲醇（色譜純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司），水為自制重蒸水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 浸膏得率的測定

按處方比例稱取丹參12 g、白芷6 g、蔓荊子6 g、制川烏6 g、制草烏6 g，按正交試驗安排進行試驗，藥材回流提取，過濾，濾液回收乙醇濃縮至適量，置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，于105 ℃干燥3 h，置干燥器中冷卻30 min，迅速精密稱定質(zhì)量，計算浸膏得率[1]。

2.2 丹參酮ⅡA含量測定

2.2.1 色譜條件 Diamonsil C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為甲醇-水（80∶20），檢測波長270 nm，流速l.0 mL/min，柱溫25 ℃，進樣量10 μL。理論塔板數(shù)以丹參酮ⅡA峰計算不低于2000。

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取干燥至恒重的丹參酮ⅡA對照品5.1 mg，置50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得0.102 g/L的對照品貯備液。

2.2.3 供試品溶液的制備 取“2.1”項下干浸膏約0.5 g，精密稱定，置平底燒瓶中，精密加入氯仿25 mL，回流加熱1 h，過濾，濾液回收溶劑至干，殘渣加甲醇使溶解并轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜濾過，即得。

2.2.4 陰性對照試驗 按處方比例稱取藥材，按“2.1”項下方法制備成不含丹參的浸膏，再按“2.2.3”項下方法制成缺丹參的陰性對照溶液。分別吸取對照品、供試品和陰性對照溶液，按“2.2.1”項下色譜條件測定，結(jié)果陰性無干擾，見圖1。

2.2.5 線性關(guān)系考察 精密量取“2.2.2”項下丹參酮ⅡA對照品溶液各1、2、3、4、5、6 mL，分別置于25 mL棕色容量瓶中，加甲醇定容，得一系列對照品溶液。精密吸取各對照品溶液10 μL，按“2.2.1”項下色譜條件測定峰面積。以對照品進樣濃度（mg/L）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得回歸方程為Y=54 480X+9015.6（r2=0.999 7），表明丹參酮ⅡA的進樣量在0.040 8～0.244 8 μg與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.2.6 精密度考察 以質(zhì)量濃度為0.016 32 g/L對照品溶液為考察對象，在“2.2.1”項色譜條件下連續(xù)進樣測定6次，測定峰面積，其RSD=1.16%，表明精密度良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液2號，在“2.2.1”項色譜條件下分別于0、2、4、8、12、24 h進樣測定，測定峰面積，其RSD=1.02%。結(jié)果表明，供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.8 重復(fù)性試驗 取正交試驗中的13號浸膏6份，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.2.1”項色譜條件下分別進樣測定。結(jié)果丹參酮ⅡA的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.152 7 mg/g，RSD=0.49%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.2.9 加樣回收率試驗 取已知含量的同一份浸膏（15號樣品，丹參酮ⅡA含量為0.249 7 mg/g）6份，每份0.5 g，精密稱定，精密加入丹參酮ⅡA對照品溶液（含量為0.102 g/L）1 mL，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.2.1”項色譜條件下進樣分析，計算回收率。結(jié)果丹參酮ⅡA的加樣回收率為96.99%，RSD=1.15%，見表1。

2.3 正交試驗

在預(yù)試驗基礎(chǔ)上，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)、乙醇用量、浸泡時間、提取時間、提取次數(shù)為考察因素，各因素3個水平，選用L18（37）正交表（見表2），取18份正交工藝制備的供試品浸膏約0.5 g，按照上述含量測定條件測定，計算浸膏得率和每組浸膏中丹參酮ⅡA含量。采用綜合加權(quán)評分法，根據(jù)試驗?zāi)康暮椭笜?biāo)成分的考量，丹參酮ⅡA的權(quán)重系數(shù)取0.8，浸膏得率權(quán)重系數(shù)取0.2，其分值為各自的數(shù)值除以18組的平均值，按公式Y(jié)=0.8Y1/Y1均+0.2Y2/Y2均（Y1為丹參酮ⅡA含量，Y2為浸

由表3中極差R值大小分析可知，各因素對醇提工藝的影響程度依次為A>D>B>C>E，提取工藝的最佳組合方案為A3B3C1D2E2。由表4的方差分析可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)對綜合評分具有顯著影響，其他因素則均無明顯影響，雖然B3>B1>B2，但B3與B1相差不大，結(jié)合生產(chǎn)實際和成本角度考慮，乙醇選擇6倍用量。據(jù)此確定最佳提取工藝為A3B1C1D2E2，即浸泡0 h，加6倍量80%乙醇回流提取2次，提取時間為3 h。

2.4 驗證試驗

按處方比例稱取丹參12 g、白芷6 g、蔓荊子6 g、制川烏6 g、制草烏6 g，共3份，每份36 g，按優(yōu)選的最佳提取工藝條件進行驗證試驗，結(jié)果見表5。

3 討論

定痛寧顆粒有效成分種類較多，且化學(xué)性質(zhì)不一，若使用單一方法提取，會造成提取效率低、提取不完全。因此，本研究針對本方活血化瘀的臨床功效和有效成分理化性質(zhì)，丹參所含非醌類衍生物丹參酮ⅡA是本處方主要有效成分，表現(xiàn)出多種藥理作用，如擴血管、降低血液黏度、抗血小板聚集、改善微循環(huán)和拮抗血管緊張素Ⅱ[2]，故確定為醇提指標(biāo)物質(zhì)。將方中丹參有效成分丹參酮ⅡA作為本品制備工藝的考察指標(biāo)，與本品的功能具有較好的相關(guān)性。

選擇乙醇為提取溶媒，可以提高丹參酮ⅡA的溶出度，但如何減少其降解損失是考慮的關(guān)鍵，在濕熱狀態(tài)下乙醇濃度越高其降解越慢[3-4]。同時，在預(yù)試驗中發(fā)現(xiàn)，隨著乙醇濃度的提高，丹參酮ⅡA的含量也隨之增加，并且提取液的顏色由淡黃色（40%～50%乙醇）逐漸變?yōu)槌燃t色（70%～90%乙醇）甚至更深，與文獻[5]一致；但考察80%和90%乙醇回流提取3 h后發(fā)現(xiàn)，丹參酮ⅡA的含量變化不大，考慮在確保充分提取的基礎(chǔ)上節(jié)約溶劑，故選擇60%～80%乙醇為提取溶劑的濃度范圍。正交試驗結(jié)果也表明，最佳工藝水平是合理、可行的[6]；而采用L18（37）正交表，可以同時評估多種因素對提取效果的影響程度，更全面反映中藥提取的需要。

對于供試品溶液的制備，以丹參酮ⅡA為指標(biāo)，分別對提取方法（超聲、回流）、提取溶劑（甲醇、三氯甲烷、乙酸乙酯）和提取時間（15、30、60 min）3個因素進行了考察。結(jié)果表明，甲醇超聲得到的成分比較復(fù)雜，分離度差，不利于分析；乙酸乙酯提取的成分含量較低；而采用三氯甲烷回流60 min的提取效率較高，峰形良好，能與其他成分達到基線分離。說明回流提取雖然比較繁瑣，但提取比較完全，能有效體現(xiàn)藥物的作用[7-9]，故采用回流提取。

本研究對流動相的選擇曾參考2010年版《中華人民共和國藥典》中“丹參”項下含量測定方法采用甲醇-水（75∶25）作為流動相，但發(fā)現(xiàn)干擾因素較多，主峰出現(xiàn)拖尾，通過條件摸索，將流動相中兩者的比例調(diào)整為甲醇∶水=80∶20，峰形得到明顯改善，優(yōu)化出符合本制劑提取工藝的色譜條件。

中藥復(fù)方成分多樣，以單一成分作為評價指標(biāo)存在局限性，故從藥效學(xué)角度考慮，本試驗選用丹參酮ⅡA為指標(biāo)成分，再結(jié)合浸膏得率綜合評價，根據(jù)對療效產(chǎn)生影響的程度賦予合適的權(quán)重系數(shù)，保證了數(shù)據(jù)指標(biāo)的全面性，使分析結(jié)果更客觀準(zhǔn)確，更全面體現(xiàn)中藥復(fù)方藥效物質(zhì)的作用；同時，由于本方處方量大，在確保指標(biāo)性成分浸出率較高的前提下，應(yīng)使得膏率維持在較小水平，以相應(yīng)減少成品的日服用劑量，便于臨床使用。

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