馬尾松GGPPS基因克隆及序列分析*

陳博雯，覃子海，王鵬良，賈婕，陳虎，劉海龍

(廣西林業(yè)科學(xué)研究院，廣西優(yōu)良用材林資源培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西　南寧530002)

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馬尾松GGPPS基因克隆及序列分析*

陳博雯，覃子海，王鵬良，賈婕，陳虎，劉海龍

(廣西林業(yè)科學(xué)研究院，廣西優(yōu)良用材林資源培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧530002)

摘要：牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合成酶(GGPPS)是萜烯類物質(zhì)合成的關(guān)鍵酶之一，本研究通過同源序列檢索分析設(shè)計(jì)引物，從馬尾松幼苗針葉組織中克隆到其GGPPS基因，命名為PmaGGPPS，該基因cDNA長1 143bp，開放閱讀區(qū)編碼380個(gè)氨基酸。PmaGGPPS編碼的蛋白質(zhì)序列分析顯示具有Trans IPPS結(jié)構(gòu)域及FARM、SARM兩個(gè)富含天冬氨酸區(qū)域，序列特點(diǎn)與GGPPS蛋白的酶學(xué)功能相符。同源性分析結(jié)果顯示PmaGGPPS核酸序列與其他兩種松屬植物GGPPS基因同源性達(dá)到99%以上，PmaGGPPS編碼蛋白與挪威云杉等植物中GGPPS蛋白同源性也在69%以上。對PmaGGPPS編碼蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)的生物信息學(xué)分析，結(jié)果顯示該蛋白為一種無信號肽、無跨膜區(qū)的堿性蛋白質(zhì)，二級結(jié)構(gòu)由16段α-螺旋組成，三級結(jié)構(gòu)同源建模顯示與歐薄荷的異聚牻牛兒基焦磷酸合酶大亞基同源性最高。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示該蛋白與紅豆杉、銀杏親緣關(guān)系較近。本研究中克隆得到PmaGGPPS基因?yàn)樯钊胙芯科湓谒芍铣傻挠绊懙於嘶A(chǔ)，同時(shí)根據(jù)GGPPS基因設(shè)計(jì)熒光定量引物并優(yōu)化反應(yīng)條件，為下一步研究基因表達(dá)水平與產(chǎn)脂力關(guān)系提供了理論依據(jù)和技術(shù)參考。

關(guān)鍵詞：馬尾松;牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合成酶(GGPPS);基因克隆;熒光定量PCR

針葉樹可分泌大量有特殊氣味的樹脂，也稱之為松脂，是松樹生理代謝的次生產(chǎn)物，也是重要的工業(yè)原料，長期以來為人們所研究和開發(fā)利用[1]。全世界約有20種產(chǎn)脂力較高的松樹被用作主要采脂樹種，馬尾松(Pinusmassoniana)是中國最主要的采脂樹種，有90%以上的松脂采自馬尾松[2～3]。

松脂可加工分離為松節(jié)油和松香，其中松節(jié)油的主要成分是單萜和倍半萜化合物，約占松脂總量的1/5；松香的主要成分是樹脂酸，是一類二萜化合物的異構(gòu)體混合物，約占松脂總量的3/4[4～5]。從松脂組成成分分析，萜類物質(zhì)的合成對松脂產(chǎn)量影響極大，特別是二萜化合物的合成，對松脂的產(chǎn)量和質(zhì)量至關(guān)重要。從萜類合成途徑中的酶入手，對其編碼基因展開研究，并進(jìn)一步利用DNA重組技術(shù)和轉(zhuǎn)基因手段，定向改造萜類合成代謝途徑，促進(jìn)有用萜類合成，是松脂合成定向調(diào)控領(lǐng)域較為主流的研究思路[6]。

萜烯類的生物合成途徑有兩條，一條為甲羥戊酸途徑，另一條為甲基-D-赤蘚醇-4-磷酸途徑。兩條途徑都產(chǎn)生萜類合成的共同的前體異戊烯焦磷酸(IPP)或其異構(gòu)體二甲丙烯焦磷酸(DMAPP)。IPP和DMAPP在相應(yīng)酶的作用下，合成牻牛兒基焦磷酸(GPP)、橙花基焦磷酸(NPP)、法呢基焦磷酸(FPP)和牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸(GGPP)。以上前體再經(jīng)各種萜類合成酶催化單萜、倍半萜、二萜[6～7]。

牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合成酶(GGPPS)是萜烯類物質(zhì)合成的一個(gè)重要分支酶，催化GPP與2個(gè)IPP縮合成GGPP，GGPP是二萜合成中的關(guān)鍵前體，推測GGPPS基因很可能是松脂形成中的影響因子之一。

目前在針葉樹中已報(bào)道了70多種萜類合成酶，主要是在大冷杉(Abiesgrandis)和挪威云杉(Piceaabies)中的研究報(bào)道，火炬松(Pinustaeda)、花旗松(Pseudotsugamenziesii)中也有少量研究，馬尾松中則未見相關(guān)報(bào)道[7]。

本研究擬利用RT-PCR方法對馬尾松中克隆得到的二萜底物合成酶GGPPS進(jìn)行序列鑒定分析，同時(shí)根據(jù)目標(biāo)基因設(shè)計(jì)熒光定量引物并優(yōu)化反應(yīng)條件，為下一步研究基因表達(dá)水平與產(chǎn)脂力關(guān)系提供理論依據(jù)和技術(shù)參考。

1材料方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

供試材料為馬尾松古蓬種源0.5年生實(shí)生苗，取自廣西林業(yè)科學(xué)研究院用材林研究所苗圃。

植物總RNA提取試劑盒、DNA提取、純化及回收試劑盒購自北京天根生化科技有限公司。反轉(zhuǎn)錄試劑盒、LA Taq DNA聚合酶、載體pMD-18T購自TaKaRa公司，定量PCR試劑盒ABI SybrGreen PCR Master Mix(2X)購自上海生工；限制性內(nèi)切酶購自Promega公司，抗生素及其他生化試劑購自北京索萊寶科技有限公司。E.coliDH5α菌株為廣西優(yōu)良用材林資源培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。引物合成及測序由深圳華大基因生物技術(shù)有限公司完成。

1.2GGPPS基因的克隆

取0.5年生實(shí)生苗針葉組織，按照試劑盒說明書方法提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，保存?zhèn)溆谩?/p>

根據(jù)NCBI檢索已報(bào)道的GGPPS基因序列，用Vector NTI軟件分析保守區(qū)并設(shè)計(jì)引物：Sense primer GGPPS-F1:ATGGCTTACAGTGGTAGAC，Anti-sense primer GGPPS-R1:TCAGTTTTGTCGAATGCAA。

以cDNA作為模板，擴(kuò)增得到的目的基因cDNA片段與pMD-18T載體連接并轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α，隨機(jī)挑取陽性克隆PCR驗(yàn)證后測序。

1.3序列生物信息學(xué)分析

采用多種在線分析工具以及生物信息學(xué)分析軟件[8]對克隆到的基因序列進(jìn)行分析：首先對序列用NCBI的Blastn在線工具進(jìn)行同源性分析；利用ORF Finder搜尋閱讀框并對DNA序列翻譯；用Blastp分析蛋白序列同源性及保守區(qū)域、活性位點(diǎn)；運(yùn)用ExPaSy網(wǎng)站的ProtParam完成蛋白序列的氨基酸組成、等電點(diǎn)及親疏水性分析；應(yīng)用丹麥科技大學(xué)(DTU)提供的TMHMM和SignalP工具分析序列中的跨膜區(qū)和信號肽；利用ExPaSy中的psipred分析序列二級結(jié)構(gòu)；應(yīng)用SWISS-MODEL軟件對基因氨基酸序列進(jìn)行同源三級結(jié)構(gòu)建模并分析；應(yīng)用MEGA 5.0工具的ClustalW分析PmaGGPPS與其他物種中GGPPS基因序列，并采用Neighbor-Jioning算法構(gòu)建進(jìn)化樹。

1.4熒光定量引物設(shè)計(jì)及條件優(yōu)化

根據(jù)GGPPS基因序列信息， Vector NTI軟件設(shè)計(jì)熒光定量引物：

qRT-PCR F: AGGCACTGGAAAGGG

qRT-PCR R: AATGCACAGAACAGG

以針葉組織cDNA為模板，對模板稀釋濃度(稀釋3倍、5倍、8倍、10倍)、引物用量(0.1μM、0.5μM、1.0μM、5μM)及PCR擴(kuò)增溫度(55℃、60℃、65℃)等條件進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。反應(yīng)體系按照試劑盒說明配制，PCR循環(huán)條件：95℃ 3min，95℃15sec，60℃40sec，40個(gè)循環(huán)。檢測各優(yōu)化條件下熒光定量擴(kuò)增效果，繪制擴(kuò)增曲線和熔解曲線。

2結(jié)果與分析

2.1GGPPS基因克隆

按實(shí)驗(yàn)方法提取總RNA并電泳檢測，28S、18S條帶清晰，RNA提取濃度及完整度好(圖1)。

圖1　總RNA提取電泳圖

以cDNA為模板GGPPS基因引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，條帶清晰且無非特異性雜帶，得到1 000bp左右目的片段(圖2)。目的片段與pMD-18T載體連接獲得的陽性克隆，經(jīng)菌落PCR驗(yàn)證，擴(kuò)增如預(yù)期得到長度為1 000bp左右的片段(圖3)，說明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，命名為pT-GGPPS。

對pT-GGPPS的插入序列進(jìn)行測序，顯示克隆得到的GGPPS基因cDNA序列長度1 143bp。利用NCBI在線blast分析，結(jié)果顯示序列中包含完整CDS區(qū)，與同屬的輻射松(Pinusradiata，JQ262154.1)、火炬松(Pinustaeda，F(xiàn)J060226.2)一致性達(dá)到99%，與松科的挪威云杉(Piceaabies，EU432050.1)、白云杉(Piceaglauca，BT118582.1)北美云杉(Piceasitchensis,BT071056.1)序列一致性達(dá)到93%以上，與北美冷杉(Abiesgrandis,AF425235.2)、海南粗榧(Cephalotaxusmannii，JX971119.1)、西藏紅豆杉(Taxuswallichiana，DQ364604.1)、加拿大紫衫(Taxuscanadensis，AF081514.1)一致性也達(dá)到了82%以上，可以初步確定克隆所得片段為GGPPS基因，命名為PmaGGPPS。

圖2　目的基因cDNA片段擴(kuò)增

圖3　陽性克隆PCR驗(yàn)證

圖4　PmaGGPPS編碼氨基酸序列保守結(jié)構(gòu)域分析

應(yīng)用NCBI的ORF Finder在線工具對PmaGGPPS基因編碼區(qū)進(jìn)行翻譯，結(jié)果顯示該基因編碼380個(gè)氨基酸，用blastp比對氨基酸序列，結(jié)果顯示序列中包含有分屬異戊烯焦磷酸合成酶超家族的特征性結(jié)構(gòu)域，即Trans IPPS結(jié)構(gòu)域。將PmaGGPPS編碼序列與其他GGPPS蛋白序列比對，結(jié)果顯示在183～189位點(diǎn)和324～328位點(diǎn)具有“DDXXXXD”和“DDXXD”兩個(gè)富含天冬氨酸區(qū)域，它們分別是烯丙基底物和IPP的結(jié)合位點(diǎn)[9]。分析結(jié)果顯示，蛋白序列特點(diǎn)與GGPPS蛋白的酶學(xué)功能相符。

氨基酸序列比對表明，PmaGGPPS編碼蛋白與Genbank上注釋的挪威云杉(ACA21461.1)GGPPS蛋白序列一致性90%、北美冷杉(AAL17614.2)一致性86%，銀杏(AAQ72786.1)一致性71%、加拿大紫衫(AAD16018.1)一致性69%，進(jìn)一步證實(shí)克隆到的基因序列為GGPPS基因。

2.2PmaGGPPS編碼蛋白序列分析

2.2.1蛋白質(zhì)理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)預(yù)測

利用ExPaSy中的Protparam在線工具分析PmaGGPPS編碼蛋白序列，結(jié)果顯示該蛋白具有380個(gè)氨基酸殘基，分子式為C1825H2950N510O549S21；相對分子量為41.49kD；理論pI值為7.56，為堿性蛋白；總平均親水性為-0.039，不穩(wěn)定系數(shù)為44.64，大于40，為非穩(wěn)定性蛋白。

應(yīng)用TMHMM檢測PmaGGPPS編碼蛋白跨膜區(qū)，并未發(fā)現(xiàn)跨膜結(jié)構(gòu)，SignalP在線分析結(jié)果顯示其也不具備信號肽序列，該蛋白不具備膜蛋白或分泌蛋白的特征結(jié)構(gòu)，更可能是一種定位于細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中的游離蛋白質(zhì)，這種細(xì)胞定位也與該基因的功能相符合。

圖5　PmaGGPPS編碼蛋白三級結(jié)構(gòu)同源建模

圖6　PmaGGPPS編碼蛋白二級結(jié)構(gòu)分析

利用ExPaSy的psipred預(yù)測蛋白序列二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果與運(yùn)用SWISS-MODEL對PmaGGPPS編碼蛋白進(jìn)行的同源三級結(jié)構(gòu)建模(圖5)結(jié)果相符，該蛋白的二級結(jié)構(gòu)主要由16個(gè)α-螺旋組成，不含β-折疊結(jié)構(gòu)(圖6)。三級結(jié)構(gòu)同源建模的參考模板為歐薄荷(Menthapiperita)的異聚牻牛兒基焦磷酸合酶大亞基[10]，提交蛋白序列與模板覆蓋率為77%，構(gòu)建范圍從第86個(gè)氨基酸到第380個(gè)氨基酸，序列一致性66.67%，推測PmaGGPPS編碼蛋白可能具備與之相同的催化活性。

2.2.2系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

在GenBank蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中檢索陸生植物GGPPS蛋白質(zhì)序列，共檢索到53條序列，在其中選擇包含完整CDS的18條序列用于比對分析。應(yīng)用MEGA 5.0分析PmaGGPPS編碼蛋白與這18條GGPPS蛋白序列的同源性，并構(gòu)建進(jìn)化樹(圖7)。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示，PmaGGPPS編碼蛋白與同屬松柏綱的紅豆杉聚為一類，之后與銀杏聚為一類，其他參比序列中，單子葉植物中的小麥和山羊草聚為一類，而除麻風(fēng)樹之外的其他雙子葉植物聚為一類，PmaGGPPS編碼蛋白所在聚類則與雙子葉植物之間親緣關(guān)系更近。

圖7　PmaGGPPS系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

圖8　熒光定量擴(kuò)增曲線

2.3熒光定量引物設(shè)計(jì)及優(yōu)化

以針葉組織cDNA為模板，優(yōu)化反應(yīng)條件并對引物進(jìn)行熒光定量擴(kuò)增效果檢測，結(jié)果顯示模板稀釋8倍、引物用量為0.5μM、PCR擴(kuò)增溫度60℃條件下實(shí)驗(yàn)結(jié)果最佳，繪制的擴(kuò)增曲線和熔解曲線如圖8～9。熔解曲線呈現(xiàn)單一峰，Tm值較高，說明引物對目的基因特異性很高。擴(kuò)增曲線顯示信號上升拐點(diǎn)出現(xiàn)在22～24個(gè)循環(huán)范圍內(nèi)，30個(gè)循環(huán)之后信號基本持平，引物擴(kuò)增效果較好。在優(yōu)化后的實(shí)驗(yàn)條件下，擴(kuò)增信號起峰在22～24個(gè)循環(huán)范圍內(nèi)，且擴(kuò)增曲線也未出現(xiàn)明顯的引物二聚體雜峰，說明優(yōu)化條件下可獲得較好實(shí)驗(yàn)效果，為開展后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供技術(shù)參考。

圖9　熒光定量熔解曲線

3結(jié)論與討論

3.1結(jié)論

本研究利用Genbank數(shù)據(jù)庫信息，通過同源檢索序列并比對分析設(shè)計(jì)引物，僅利用RT-PCR技術(shù)直接從馬尾松針葉組織中克隆得到PmaGGPPS基因，并對其序列進(jìn)行生物信息分析。結(jié)果顯示該基因cDNA長1 143bp，開放閱讀區(qū)編碼380個(gè)氨基酸。PmaGGPPS編碼的蛋白質(zhì)序列分析顯示具有Trans IPPS結(jié)構(gòu)域及FARM、SARM兩個(gè)富含天冬氨酸區(qū)域，序列特點(diǎn)與GGPPS蛋白的酶學(xué)功能相符。同源性分析結(jié)果顯示PmaGGPPS核酸序列與其他兩種松屬植物GGPPS基因同源性達(dá)到99%以上，PmaGGPPS編碼蛋白與挪威云杉等植物中GGPPS蛋白同源性也在69%以上。對PmaGGPPS編碼蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)的生物信息學(xué)分析，結(jié)果顯示該蛋白為一種無信號肽、無跨膜區(qū)的堿性蛋白質(zhì)，二級結(jié)構(gòu)由16段α-螺旋組成，三級結(jié)構(gòu)同源建模顯示與歐薄荷的異聚牻牛兒基焦磷酸合酶大亞基同源性最高。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示該蛋白與紅豆杉、銀杏親緣關(guān)系較近。在此基礎(chǔ)上，根據(jù)目標(biāo)基因序列設(shè)計(jì)熒光定量引物并優(yōu)化反應(yīng)條件，得到了理想的實(shí)驗(yàn)效果。

3.2討論

目前基因克隆中大多是采用RACE技術(shù)獲取基因的全長，優(yōu)勢是可以在通過其他實(shí)驗(yàn)手段僅獲得目的基因部分序列信息的條件下獲取全長基因，但操作步驟較為繁瑣，實(shí)驗(yàn)周期相對較長，而在針對目的基因的功能性研究中，有時(shí)需要的僅僅是目的基因的編碼區(qū)，并不需要3’和5’端非編碼區(qū)序列時(shí)，此時(shí)在同源序列信息采集充分、比對分析精細(xì)甄別、引物設(shè)計(jì)質(zhì)量較高的前提下，通過同源分析設(shè)計(jì)引物直接獲取編碼區(qū)序列則更為便捷，效率更高。

在GenBank蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中登錄的GGPPS蛋白質(zhì)序列與其他代謝途徑中的關(guān)鍵酶相比，序列數(shù)量較少，除了用作模式植物開展研究的小麥、苜蓿外，更多的是在藥材、花卉、香料植物中報(bào)道較多，比如杜仲(Eucommiaulmoides)、丹參(Salviamiltiorrhiza)、桑(MorusNotabilis)、茉莉(Jasminumsambac)、歐薄荷等。在松科植物中針對GGPPS基因的研究主要在DNA層面，涉及到蛋白活性、功能鑒定的研究工作還在起步階段，還有一定的研究空間。

GGPPS在代謝通路中，不僅為二萜合成提供骨架，也參與類胡蘿卜素、赤霉素及葉綠素側(cè)鏈等的合成過程，有研究發(fā)現(xiàn)松樹針葉中葉綠素的含量與松樹產(chǎn)脂力存在著密切的關(guān)系，與普通馬尾松類型相比較，馬尾松高產(chǎn)脂無性系的葉綠素含量極顯著提高[11]。綜合GGPPS對葉綠素合成以及二萜合成中的重要作用，提示GGPPS很可能是產(chǎn)脂力相關(guān)基因之一，其表達(dá)水平很可能與產(chǎn)脂力具有相關(guān)性。

本文克隆得到的馬尾松GGPPS基因，為深入研究其編碼酶的酶學(xué)功能及活性提供基礎(chǔ)，在本研究基礎(chǔ)上，將GGPPS基因轉(zhuǎn)化植物，研究其對二萜合成的影響，深入研究該基因在松脂合成中的作用，具有很大的研究空間和意義，也是本研究組下一步的研究目標(biāo)。此外，本研究根據(jù)目標(biāo)基因設(shè)計(jì)熒光定量引物并優(yōu)化反應(yīng)條件，也為下一步研究基因表達(dá)水平與產(chǎn)脂力關(guān)系提供了理論依據(jù)和技術(shù)參考。

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Cloning and Bioinformatics Analysis of GGPPS of Pinus massoniana CHEN Bo-wen,QIN Zi-hai,WANG Peng-liang,JIA Jie,CHEN Hu,LIU Hai-long

(Guangxi Key Laboratory of Superior Timber Trees Resource Cultivation,Guangxi Academy of Forestry,Nanning Guangxi 530002,P.R.China)

Abstract:Geranylgeranyl diphosphate synthase(GGPPS)is the key synthase in terpenes synthesis.Its gene was cloned from the needles of Pinus massoniana seedlings by using specific primers based on the highly conserved sequences,and it was named as PmaGGPPS.Sequence analysis indicated that its cDNA sequence were 1 143 bp with its open reading frame encoding 380 amino acid residues.PmaGGPPS encoding sequence was analyzed,the result showed it has a Trans IPPS domain and two aspartate-rich motif which were FARM and SARM respectively,and the protein sequence characteristics consistent with GGPPS protein enzyme function.The results of homology analysis showed that PmaGGPPS nucleotide sequence had more than 99% sequence homology with the other two pine plants,and PmaGGPPS encoding protein had more than 69% homology with Picea abies and other plants.The physicochemical property and structure of PmaGGPPS encoding protein were analyzed by using bioinformatics tools.The result showed it was an basic protein with no signal peptide or transmembrane domain,and its secondary structure was composed of 16 alpha helix segments.Tertiary structure modeling showed it was most similar to heterotetrameric geranyl pyrophosphate synthase from mint.Phylogenetic analysis showed that it had close relation with Taxus and Ginkgo.The cloning of PmaGGPPS gene provided effective resources to further research on pine resin synthesis.This design of qRT-PCR primers according to the GGPPS gene in this study could optimize the reaction conditions,and provide theoretical basis and technical reference for next-step study on the relations of gene expression level and l pine resin production.

Key words:Pinus massoniana;geranylgeranyl diphosphate synthase(GGPPS);gene clone；qRT-PCR

中圖分類號：S 791.248

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1672-8246(2016)02-0001-06

通訊作者簡介：劉海龍(1980-)，男，高級工程師，主要從事植物生物技術(shù)研究。E-mail：lhl-hb@sohu.com

第一作者簡介：陳博雯(1983-)，女，工程師，主要從事植物生物技術(shù)研究。E-mail：grfi_bwchen@163.com

基金項(xiàng)目：廣西自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2014GXNSFBA118106)，廣西林科院基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)項(xiàng)目(201419)。

*收稿日期：2015-07-23