Western blot法測定N-cadherin在創(chuàng)傷修復過程中的作用

耿勝男，鄭亞秋， 孟明靜， 杜鋼

河南大學藥學院 藥物研究所，河南 開封 475004

?

Western blot法測定N-cadherin在創(chuàng)傷修復過程中的作用

河南大學藥學院 藥物研究所，河南 開封 475004

摘要：〔目的〕 測定小鼠創(chuàng)傷后N-cadherin蛋白的表達，探討N-cadherin在創(chuàng)傷修復中的作用。 〔方法〕 用皮膚切除法在小鼠背部建立1 cm2小鼠皮膚創(chuàng)傷模型,分為復方組,腺嘌呤組,模型組和正常對照組。復方組小鼠給予中藥復方制劑[附子(制)∶三七∶紫草=1∶2∶3]；腺嘌呤組給予腺嘌呤；模型組不給藥。實驗結束后，觀察創(chuàng)傷面積及修復的快慢程度變化。創(chuàng)傷組織皮膚提取蛋白，Western blot法測定皮膚組織EMT過程中N-cad在創(chuàng)傷修復中表達的程度高低?！步Y果〕 復方組小鼠背部創(chuàng)傷恢復最快，其次為模型組，腺嘌呤組小鼠創(chuàng)傷愈合最慢；Western blot法測定顯示，創(chuàng)傷后N-鈣調素的表達從高到低依次為:腺嘌呤組、模型組、復方組，與正常對照組比較其差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)?！步Y論〕 復方組給予的中藥復方制劑對小鼠創(chuàng)傷的愈合有促進作用，腺嘌呤組給予腺嘌呤造成小鼠陽虛模型，不利于小鼠創(chuàng)傷愈合；小鼠創(chuàng)傷后N-cad的表達越低，創(chuàng)傷修復越快。

關鍵詞：Western blot；N-cadherin；創(chuàng)傷修復；小鼠

創(chuàng)傷一直對人類的生命健康存在著巨大的威脅，雖然科學家們對創(chuàng)傷的研究從未停止，但人們對創(chuàng)傷修復過程的發(fā)生機制卻鮮有了解，因此我們針對上皮細胞間質轉化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)過程中N-cadherin在創(chuàng)傷修復過程中的作用機制進行了探討。EMT是指上皮細胞在特定的生理和病理情況下向間質細胞轉分化的現象，目前被看成參與腫瘤進展、與侵襲和轉移有一定關系[1]。Cadherin家族的黏附分子對于生長發(fā)育過程中細胞的選擇性聚集具有至關重要的作用。N-cadherin是能與鈣離子結合的一種蛋白質。鈣離子又被稱為細胞內的第二信使，它的濃度變化可調節(jié)細胞的功能，這種調節(jié)功能主要是通過鈣黏蛋白而實現的[2]。目前的許多研究[3]表明，N-cadherin的高表達對惡性腫瘤的分化程度、侵襲力、轉移有促進作用，對創(chuàng)傷愈合也有一定影響，但對于N-cadherin在創(chuàng)傷修復中的作用機制目前尚不明確。我們通過Western blot法測定創(chuàng)傷皮膚組織中N-cadherin的表達情況，以探究N-cadherin在創(chuàng)傷修復中的作用機制。

1儀器與試劑

1.1試劑

生理鹽水：稱取0.9 g氯化鈉，溶解在少量蒸餾水中，稀釋到100 mL；PBS：NaCl 8 g，KCl 0.2 g，Na2HPO4·12H2O 3.63 g，KH2PO40.24 g，溶于900 mL雙蒸水中，用鹽酸調pH值至7.4，加水定容至1 L；分離膠(12%)；雙蒸水；質量分數為30%的丙烯酰胺：丙烯酰胺30 g，雙丙烯酰胺0.82 g，去離子蒸餾水102.7 mL，溶解后過濾；分離緩沖液；質量分數為10%的SDS(十二烷基硫酸鈉)：取100 g電泳級十二烷基硫酸鈉，溶于900 mL蒸餾水中，加熱至68 ℃助溶，加鹽酸調pH值至7.2，加水定容至1 L，分裝備用；質量分數為10%的AP(過硫酸銨)：取10 g過硫酸銨溶于100 mL蒸餾水中，最好現場配置，溶解后放入4 ℃冰箱中保存，保存時間為1周；TEMED N,N,N′,N′-四甲基乙二胺；電泳緩沖液(50×TAE Buffer)：稱取Tris 242 g、EDTA二鈉37.2 g，放入1 L燒杯中，向燒杯中加入約800 mL去離子水，充分攪拌均勻，加入57.1 mL的冰乙酸，充分溶解，用氫氧化鈉調pH至8.3，加去離子水定容至1 L后室溫保存，使用時稀釋50倍；Marker；轉移緩沖液：甘氨酸2.9 g，Tris 5.8 g，十二烷基硫酸鈉0.37 g，甲醇200 mL，加水至1 L；奶粉；TBST：體積分數為20%的Tween-20 1.65 mL，TBS 700 mL混勻后使用，最好現場配置；ECL發(fā)光液；裂解液；Loading Buffe 1 M Tris-HCl 1.25 mL，十二烷基硫酸鈉0.5 g，BPB 25 mg，甘油2.5 mL， 然后加入去離子水溶解后定容至5 mL，分裝后室溫保存[4]。

1.2動物

昆明小鼠，雄性，體質量(20±2)g，河南大學藥理實驗室提供。

1.3儀器

HDL潔凈臺(北京東聯哈爾儀器制造有限公司)，-4 ℃/-20 ℃冰箱(博西華電器 有限公司，安徽),ElX800酶標儀(美國BIO-IEK),-4 ℃冰箱(上海杜氏實業(yè)有限公司),TDL-508臺式離心機(上海安亭科學儀器廠),YN-ZD-2電熱蒸餾水器(上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠),CHA-S恒溫振蕩器(常州國華電器有限公司),FA1004N 電子天平(上海精密儀器有限公司),電子體溫計(泰克曼電子儀器有限公司，香港),ZH-YLS-1A多功能小鼠自主活動記錄儀(淮北正華生物儀器設備有限公司),XFA6130全自動動物血細胞分析儀(南京普朗醫(yī)療設備有限公司),HT-100血流變黏度測試儀、DYY-7C型電泳儀(北京市六一儀器廠)。

2實驗方法

2.1建立小鼠皮膚創(chuàng)傷模型

取64只雄性昆明小鼠，分為4組：空白對照組，模型組，復方組，腺嘌呤組。除空白組外均對小鼠的背部右后方造成創(chuàng)傷，創(chuàng)傷面積約為1 cm2?？瞻讓φ战M為正常小鼠；創(chuàng)傷模型組小鼠背部創(chuàng)傷，不給藥；復方組小鼠創(chuàng)傷后，每天給予中藥復方制劑(附子(制)、三七、紫草配比為1∶2∶3，1 g/kg)按0.2 mL/10g的劑量灌胃；腺嘌呤組小鼠創(chuàng)傷后，每隔兩天給予腺嘌呤(40 mg/kg)按0.2 mL/10g的劑量灌胃。從實驗當天開始，每隔一天測小鼠體質量，每周測量自主活動、體溫、創(chuàng)傷面積并記錄。數據計算方法：創(chuàng)傷面積(mm2)=創(chuàng)傷長度×創(chuàng)傷寬度；小鼠存活率=(實驗結束后小鼠數目/實驗開始時小鼠數目)×100%。

2.2組織蛋白的提取

稱取不同組別小鼠的創(chuàng)傷皮膚組織0.1 g，剪碎，置勻漿器中，加生理鹽水或預冷的PBS 900 μL研磨成勻漿；取出勻漿，置于離心管，放入離心機中以2 500 r/min離心10 min；棄去上清液，留底層的細胞；加入200 μL裂解液，置于冰上裂解30 min，間隔10 min混勻1次，混4次，最終成微乳狀，有絮狀物。然后，置于離心機中，調至4 ℃，以12 000 r/min離心10 min，取上清液于EP管中，-20 ℃保存。

2.3BCA蛋白濃度測定

現代社會，人們在文化習俗、道德理念、價值觀念以及行為方式等方面普遍而深刻地存在著差異、分歧和沖突。這些差異、分歧、沖突并沒有明確有效的方式使其趨于融合。文化習俗、道德理念、價值觀念以及行為方式的多元性意味著存在多種合理的價值以及關于共同的善的合理觀念。社會各階層可以自由地采納其中一種價值觀念，或是從某種利益出發(fā)把不同的價值結合在一起，還可以自由地形成本階層關于良善生活的觀念。“不同的生活方式崇尚不同的善和德性這一事實并非不完美的特征，而是人類可以以不同的生活方式很好地生活的標志”。[12]

BCA與二價銅離子的CuSO4等其他試劑組合成的試劑混合在一起顯示為蘋果綠色。在堿性條件下BCA與蛋白質結合時，蛋白質將Cu2+還原成Cu+，一個Cu+螯合2個BCA分子，工作試劑由原來的蘋果綠色形成紫色復合物，最大吸光度與蛋白質濃度成正比[5]。實驗采用96孔板法：根據標準品和樣品數量，將試劑A與試劑B按50∶1的比例配制適量的BCA工作液，充分混勻；將蛋白標準品按0 μL、1 μL、2 μL、4 μL、6 μL、8 μL、10 μL加入96孔板的蛋白標準品孔中，加滅菌雙蒸水補足到10 μL；取10 μL待測樣品，加入到96孔板；向待測樣品孔和蛋白標準孔中加入200 μL BCA工作液；37 ℃溫水浴30 min后冷卻至室溫；用酶標儀526 nm波長測定吸光度。制作標準曲線，從中求出樣品濃度[6]。

2.4Western bloting

Western blot，即蛋白質印跡法(免疫印跡試驗)。它是通過特異性抗體對凝膠電泳處理過的細胞或生物組織樣品進行著色，并通過分析著色的位置和著色深度獲得特定蛋白質在所分析的細胞或組織中表達情況的信息[7]。

電泳過程如下：①模具準備及安裝，安裝后加雙蒸水，檢漏5 min。②放入分離膠(12%)兩塊，先加雙蒸水6.6 mL，并依次加入質量分數為30%的丙烯酰胺8 mL、分離緩沖液5 mL、質量分數為10%的SDS 0.2 mL、質量分數為10%的AP(過硫酸銨)0.2 mL、TEMED(N,N,N′,N′-四甲基乙二胺)8 μL、雙蒸水1 mL，30 min后倒掉。③制備濃縮膠2塊：加雙蒸水3.4 mL，并依次加入濃縮膠緩沖液0.630 mL(pH=6.8)、質量分數為10%的SDS 50 mL、質量分數為10%的AP(過硫酸銨)50 mL、TEMED(N,N,N′,N′-四甲基乙二胺)5 μL。④加濃縮膠，插上梳子后30 min聚凝，將凝膠放入電泳槽，加電泳緩沖液，輕輕拔出梳子，加5 μL marker，上樣樣品總蛋白120μg，80 V、0.5 h，120V、50 min。⑤切膠：將所有東西用轉移緩沖液潤，黑膠白膜，海綿在外。⑥轉膜：橫流200 mA，1.5 h。⑦封閉：將1 g奶粉溶于20 mLTBS，封閉2 h。⑧加一抗，置于4 ℃過夜，TBST洗7 min，共7遍。⑨加二抗，放置2 h，TBST洗7 min，共7遍。⑩加ECL發(fā)光液A、B各200 μL，后把膜放在保鮮膜上。

3結果

3.1對小鼠體質量的影響

與對照組小鼠相比較，復方組小鼠體質量下降，模型組體質量無明顯變化，其他組小鼠體質量均未有明顯變化。給藥期間各組小鼠狀態(tài)良好。結果見表1、圖1。

表1　創(chuàng)傷后小鼠體重的變化(g)

圖1　創(chuàng)傷后小鼠體質量生長曲線

3.2對自主活動的影響

表2　創(chuàng)傷后各組小鼠自主活動的變化

圖2　實驗期間小鼠自主活動變化

3.3對體溫的影響

實驗期間測小鼠的背溫、腹溫和尾溫。發(fā)現背溫和腹溫有小幅度波動，但整體較平穩(wěn)，P>0.05，沒有顯著性差異，但尾溫在實驗第5周有較大幅度的變化。結果見表3、圖3、表4、圖4、表5、圖5。

表3　創(chuàng)傷后小鼠背溫的變化(℃)

圖3　實驗期間各組小鼠背溫的變化

組別1d6d12d18d復方組31.0±0.4331.2±0.6427.2±0.6330.2±0.63腺嘌呤組31.0±0.4331.0±0.4326.9±0.5631.6±0.9模型組30.1±0.7431.0±0.5327.4±0.6932.7±0.79

圖4　實驗期間各組小鼠腹溫的變化

組別1d6d12d18d復方組26.8±1.3125.8±0.8319.3±0.3321.9±0.51腺嘌呤組25.8±0.5424.4±0.8319.0±0.2124.1±0.21模型組26.1±1.4225.6±1.0319.0±0.6125.1±3.04

圖5　實驗期間各組小鼠尾溫的變化

3.4對創(chuàng)傷面積的影響

由表6可看出，造成創(chuàng)傷后：復方組的愈合率較高，分別為99.02%和98.9%，創(chuàng)傷恢復較快；腺嘌呤組創(chuàng)傷愈合最慢，愈合率為85.20%。從第1天、第6天、第12天、第18天各組的背部創(chuàng)傷照片也可看出：在第1天造成相同創(chuàng)傷面積后，第6天創(chuàng)傷面積已有縮小，但腺嘌呤組創(chuàng)傷愈合最緩慢，其次為模型組，復方組愈合最快；第12天各組創(chuàng)傷均恢復很多，復方組基本愈合，腺嘌呤組仍有明顯創(chuàng)傷；第18天，復方組的創(chuàng)傷已愈合，腺嘌呤組有小面積創(chuàng)傷，但模型組比腺嘌呤組的創(chuàng)傷小。小鼠創(chuàng)傷面積比較見圖6，存活率見表7。

表6　各組小鼠創(chuàng)傷面積及愈合率

圖6　小鼠創(chuàng)傷面積比較

組別實驗初始小鼠數實驗結束后小鼠數小鼠存活率/%復方組161381.25腺嘌呤組161275.00模型組161593.75

3.5Western blot

圖7為提取皮膚組織蛋白后Western blot法測得的各組N-cadherin的條帶。從左至右依次為復方組、腺嘌呤組、正常對照組、模型組。從圖中可看出腺嘌呤組N-cadherin的條帶最亮，表明N-cadherin的含量最高，其次為模型組、正常對照組，復方組的表達最低。

圖7　N-cadherin條帶

4討論

本實驗主要探究EMT過程中N-cadherin對小鼠創(chuàng)傷修復的影響。EMT這一過程能夠使在某些部位產生的上皮細胞從上皮組織分離，然后遷移到其他位置，這是正常發(fā)育、傷口愈合和惡性上皮腫瘤等發(fā)生的基礎。有研究[6]證明，N-cadherin的表達水平與EMT的發(fā)生呈正相關。初步推測為N-cadherin的表達與創(chuàng)傷修復過程有關。對小鼠造成創(chuàng)傷后，復方組給藥：附子、三七、紫草。從創(chuàng)傷修復的照片來看，復方組的小鼠背部創(chuàng)傷愈合最快，在第18天已經完全愈合，這表明復方組給藥對小鼠創(chuàng)傷修復是有促進作用的。而且從Western blot法測定皮膚組織中N-cadherin的表達情況發(fā)現，4組小鼠的N-cadherin表達復方組是最低的，其次為模型組，同時模型組的創(chuàng)傷修復也較快。腺嘌呤組的創(chuàng)傷修復最慢，因為腺嘌呤可導致小鼠陽虛，使小鼠的體質量下降，生長發(fā)育和創(chuàng)傷修復也變得緩慢，Western blot測定后表現出腺嘌呤組N-cadherin的表達最高。模型組小鼠創(chuàng)傷恢復速度比腺嘌呤快而慢于復方組，Western blot條帶顯示模型組N-cadherin的表達高于復方組，低于腺嘌呤組和正常對照組。即4組小鼠皮膚組織中N-cadherin的表達從高到低為腺嘌呤組、正常對照組、模型組、復方組。根據這一結果可推斷，在創(chuàng)傷修復的過程中N-cadherin的表達高低與創(chuàng)傷修復的快慢是成反比的，即N-鈣調素的表達下調有利于創(chuàng)傷的修復。

參考文獻：

[1] 周亞東，陳幸生. 原發(fā)性慢性靜脈功能不全與基質金屬蛋白酶、上皮間質轉化之間的關系[J]. 醫(yī)學綜述，2013,19(5):795-797.

[2] 周蕾，張亞楠，劉婕，等. E-鈣黏蛋白和N-鈣黏蛋白啟動子的構建及活性測定[J]. 軍事醫(yī)學，2014,38(11):860-862.

[3] 黎濤，馬春山，李川，等. 非小細胞肺癌組織MAGE-1蛋白的Western印跡分析[J]. 實用醫(yī)藥雜志，2008,25(2):219-221.

[4] Xu Y, Zhu F, Xu S, et al. Anti-tumor effect of the extract from qingyihuaji formula on pancreatic cancer by down-regulating Notch-4 and Jagged-1[J]. J Tradit Chin Med, 2015,35(1):77-83.

[5] Kant V, Gopal A, Kumar D, et al. Curcu min-induced angiogenesis hastens wound healing in diabetic rats[J]. J Surg Res, 2015,193(2):978-88.

[6] 郭艷靚，朱鶴，高維強，等. 前列腺癌細胞中CD44、TRA-1-60、E-鈣黏蛋白和N-鈣黏蛋白的表達及意義[J]. 腫瘤，2014,34(7):579-583.

[責任編輯時 紅]

The action of N-cadherin in the process of wound healing by western blot

Intitute of Pharmacy, Pharmaceutical College of Henan University, Henan Kaifeng 475004, China

Abstract:〔Objective〕Investigating the expression of N-cadherin in wounded mice and deter minating the action of N-cadherin in the process of wound healing. 〔Methods〕1-cm-diameter skin wounds were inflicted on the back of mice, and divide into four groups: the group of Compound; the group of Adenine; the group of model; the group of blank.The group of compound was treated with compound preparation(monkshood:pseudo-ginseng:radix lithospermum=1∶2∶3); the group of Adenine was treated with Adenine; the group of model was treated nothing. After the experiment,observing the changes of wound area and speed of wound repair. Extracting the protein of the wound skin and investigating the level of N-cadherin of the wound skin in the process of EMT by western blot. 〔Results〕The speed of wound healing in compound group is the fastest,followed by the group of model,and the group of Adenine is the slowest. It shows that the expresstion of N-cadherin statue is :the group of Adenine is the highest, the group of model is higher and the group of compound is the lowest comparing with the control group (P<0.05).〔Conclusion〕The compound preparation is useful to wound healing.Adenine can resist wound healing.After injured,the lower N-cadherin’s expresstion the faster wound repaired.

Key words:Western blot; N-cadherin; wound repair; mice

中圖分類號：R285.5

文獻標志碼：A

作者簡介：耿勝男(1994-)，女，河南開封人，碩士研究生，從事中藥抗腫瘤藥理學研究工作。 通信作者：杜鋼軍(1971-)，男，河南開封人，博士，教授，從事中藥抗腫瘤藥理學研究工作。

基金項目：國家自然科學基金項目(81173094)；河南省高校青年骨干教師項目(2010GGJS-025)

收稿日期：2015-10-12

文章編號：1672-7606(2016)01-0009-05