熒光PCR法檢測(cè)妊娠孕晚期婦女B族鏈球菌感染的應(yīng)用價(jià)值

馬勇?李莉

【摘要】 目的 通過(guò)幾種方法對(duì)比檢測(cè)B族鏈球菌（GBS）， 探討熒光PCR法在產(chǎn)前篩查B族鏈球菌感染檢測(cè)中的臨床應(yīng)用價(jià)值和意義。方法 采集臨床孕35～37周孕婦的陰道和直腸分泌物標(biāo)本480例， 用熒光PCR法、細(xì)菌培養(yǎng)法及基因測(cè)序法同時(shí)檢測(cè)GBS， 并對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。結(jié)果 熒光PCR法檢測(cè)GBS陽(yáng)性75例， 陽(yáng)性率為15.6%；細(xì)菌培養(yǎng)法檢測(cè)GBS陽(yáng)性40例， 陽(yáng)性率為8.3%， 兩種方法檢測(cè)陽(yáng)性率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。熒光PCR法與基因測(cè)序法檢測(cè)結(jié)果對(duì)比， 熒光PCR法檢測(cè)GBS正確率為93.3%（70/75）， 靈敏度為100.0%（70/70）， 特異性為98.8%（405/410）。結(jié)論 熒光PCR法檢測(cè)GBS明顯優(yōu)于細(xì)菌培養(yǎng)法， 與金標(biāo)準(zhǔn)基因測(cè)序法比對(duì)， 其檢測(cè)準(zhǔn)確率、靈敏度、特異性都較高， 是產(chǎn)前篩查GBS的最佳方法， 值得臨床推廣應(yīng)用。

【關(guān)鍵詞】 B族鏈球菌；熒光PCR法；細(xì)菌培養(yǎng)；基因測(cè)序

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2016.10.062

B族鏈球菌（GBS）學(xué)名無(wú)乳鏈球菌（S.agalactiac）， 正常寄居于生殖道和直腸， 是一種條件致病菌。在美國(guó)25%～40%的孕婦產(chǎn)道攜帶GBS， 其中有一半會(huì)傳染給新生兒， 已被證實(shí)為圍生期婦女及新生兒感染的主要致病菌之一[1]。在我國(guó)GBS的產(chǎn)前篩查也越來(lái)越受到重視。本文主要探討熒光PCR法檢測(cè)GBS的臨床應(yīng)用， 并與細(xì)菌培養(yǎng)法， 基因測(cè)序法進(jìn)行比對(duì)。對(duì)比觀察熒光PCR法檢測(cè)的陽(yáng)性率、準(zhǔn)確率、靈敏度和特異性?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1. 1 一般資料 收集本院2014年1～12月收治的孕周35～37周孕晚期的門診和住院孕婦陰道和直腸分泌物標(biāo)本480例， 孕婦年齡18～41歲。

1. 2 標(biāo)本采集 標(biāo)本采集部位和方法陰道口上1/3處， 沿生殖道壁用無(wú)菌拭子輕輕旋轉(zhuǎn)取得分泌物；無(wú)菌拭子插入肛門括約肌上2～5 cm處， 沿直腸壁輕輕旋轉(zhuǎn)取得分泌物。將采集好的拭子放回?zé)o菌試管內(nèi)， 密閉送檢。48 h內(nèi)進(jìn)行GBS的檢測(cè)。

1. 3 儀器和試劑

1. 3. 1 美國(guó)ABI7500 RESL-TIME PCR分析儀。

1. 3. 2 福建泰普生物科學(xué)有限公司， B族鏈球菌核酸檢測(cè)試劑盒[國(guó)食藥管械（準(zhǔn)）字2001第3400250號(hào)]。

1. 3. 3 鄭州安圖生物有限公司生產(chǎn)的微生物培養(yǎng)基和生化微量反應(yīng)管。

1. 3. 4 長(zhǎng)沙長(zhǎng)錦科技有限公司， ST-2000A型CO2培養(yǎng)箱。

1. 4 方法

1. 4. 1 熒光PCR檢測(cè) 標(biāo)本處理：無(wú)菌拭子管中加入清洗緩沖液1 ml， 高速震蕩2 min， 擠干拭子， 標(biāo)本懸液移至試管中， 13000 r/min離心5 min， 棄掉上清液， 沉淀物中在加1 ml清洗緩沖液， 13000 r/min離心5 min， 棄掉上清液。沉淀物用100 μl 三羥甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸（TE）緩沖液重懸， 加入10 μl內(nèi)參照。提取固型物：高速震蕩5 min破碎細(xì)胞， 95℃干浴2 min， 冰浴5 min， 13000 r/min離心1 min， 上清液5 μl加入PCR反應(yīng)管中， 進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)（37℃， 2 min；95℃， 2 min；95℃， 15 s；55℃， 45 s；40個(gè)循環(huán)）。

1. 4. 2 細(xì)菌培養(yǎng)檢測(cè) 將陰道和直腸分泌物標(biāo)本接種在5%羊血培養(yǎng)基上， 分區(qū)劃線， 置于35℃， 5%～10% CO2培養(yǎng)箱中。進(jìn)行24 h培養(yǎng)后， 根據(jù)菌落形態(tài)， 溶血情況， 可疑菌落涂片染色， 顯微鏡下觀察。在進(jìn)行菌種鑒定試驗(yàn)：觸酶試驗(yàn)、桿菌肽試驗(yàn)、溶血試驗(yàn)、CAMP試驗(yàn)、馬尿酸鈉水解試驗(yàn)、膽汁溶解試驗(yàn)、七葉苷試驗(yàn)等。

1. 4. 3 基因測(cè)序檢測(cè) 標(biāo)本中基因序列與編碼CAMP蛋白序列比對(duì)， 均存在B族鏈球菌特有的基因序列為陽(yáng)性。送第三方鄭州金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心檢測(cè)。

1. 5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料以率（%）表示， 采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2. 1 480例妊娠孕晚期婦女分泌物標(biāo)本中熒光PCR法檢測(cè)GBS陽(yáng)性75例， 陽(yáng)性率為15.6%；細(xì)菌培養(yǎng)法檢測(cè)GBS陽(yáng)性40例， 陽(yáng)性率為8.3%， 兩種方法檢測(cè)GBS陽(yáng)性率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。見(jiàn)表1。

2. 2 以基因測(cè)序法作為GBS檢測(cè)結(jié)果的金標(biāo)準(zhǔn)， 對(duì)熒光PCR法檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行復(fù)查比對(duì)， 熒光PCR法檢測(cè)GBS正確率為93.3%（70/75）， 靈敏度為100.0%（70/70）， 特異性為98.8% （405/410）。見(jiàn)表2。

3 討論

最早 GBS的檢測(cè)方法主要是傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)法及細(xì)菌培養(yǎng)后菌落的膠乳凝集試驗(yàn)（LA）和協(xié)同凝集試驗(yàn)（COA）。根據(jù)菌落特點(diǎn)、溶血性、顯微鏡下形態(tài)觀察及生化試驗(yàn)來(lái)判定GBS。但該方法耗時(shí)長(zhǎng)， 細(xì)菌培養(yǎng)需24～48 h， 操作繁瑣， 而且陰道和直腸的其他細(xì)菌生長(zhǎng)抑制了GBS的繁殖， 培養(yǎng)難度高， 也不適合臨床大量樣本的篩查， 并且檢測(cè)的陽(yáng)性率也較低。本研究陽(yáng)性率只有8.3%。國(guó)內(nèi)同行有報(bào)道細(xì)菌培養(yǎng)法陽(yáng)性率只有5.2%、7.5%[2， 3]。近些年來(lái)熒光PCR檢測(cè)方法的普及， 利用不同種屬GBS的特異性核酸序列設(shè)計(jì)引物， 用熒光探針標(biāo)記， 使用先進(jìn)的PCR檢測(cè)儀， 可以實(shí)現(xiàn)快速（4 h內(nèi)）、靈敏、高通量的GBS檢測(cè)， 適合臨床大規(guī)模樣本的篩查。本文中熒光PCR檢測(cè)陽(yáng)性率達(dá)到15.6%。與國(guó)內(nèi)一些學(xué)者報(bào)道熒光PCR法檢出陽(yáng)性率11.8%、9.4%都高于細(xì)菌培養(yǎng)法[4， 5]。與金標(biāo)準(zhǔn)基因測(cè)序法比對(duì)， 熒光PCR法檢測(cè)GBS正確率為93.3%， 靈敏度為100%， 特異性為98.8%。與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的正確率89.5%、靈敏度100.0%、特異性99.6%接近。另外， GBS標(biāo)本取材后受保存條件、環(huán)境溫度等因素的影響， GBS有部分死亡的可能， 而熒光PCR法可以檢測(cè)到死亡的GBS。而GBS死亡， 則細(xì)菌培養(yǎng)法就會(huì)培養(yǎng)陰性。美國(guó)疾病預(yù)防控制中心（CDC）最新版的《妊娠合并B族鏈球菌（GBS）感染防治指南》指出有25%～40%的孕婦產(chǎn)道中攜帶GBS， 其中40%～70%在分娩過(guò)程中會(huì)傳遞給新生兒， 大約有1%～3%的新生兒會(huì)感染， 其中5%會(huì)導(dǎo)致死亡。孕婦感染GBS臨床可表現(xiàn)出菌血癥、泌尿系統(tǒng)感染、胎膜感染、子宮內(nèi)膜感染及產(chǎn)褥期感染。GBS感染引起胎膜早破和羊膜腔感染， 誘發(fā)早產(chǎn)率可高達(dá)60%[6]。

綜上所述， GBS對(duì)妊娠婦女危害嚴(yán)重， 因此及時(shí)進(jìn)行產(chǎn)前篩查GBS顯得尤為重要。熒光PCR法在GBS的檢測(cè)上具有速度快、靈敏度高、特異性好、結(jié)果準(zhǔn)確的特點(diǎn)， 顯著優(yōu)于傳統(tǒng)的培養(yǎng)法， 且適用于大量人群的普篩及妊娠孕晚期婦女的產(chǎn)前篩查， 值得臨床推廣應(yīng)用。

參考文獻(xiàn)

[1] 時(shí)春艷， 曲首輝， 楊磊， 等.妊娠晚期孕婦B族鏈球菌帶菌狀況的檢測(cè)及帶菌對(duì)妊娠結(jié)局的影響.中華婦產(chǎn)科雜志， 2010， 45（1）：12-16.

[2] 劉睿， 崔坤友， 劉文彬， 等.應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)和細(xì)菌培養(yǎng)法檢測(cè)孕婦產(chǎn)前B族鏈球菌感染的對(duì)比分析.醫(yī)學(xué)前沿， 2014（3）：198-199.

[3] 何國(guó)才， 白清， 李高， 等.桂林地區(qū)孕晚期孕婦B族鏈球菌檢測(cè)及藥敏分析. 國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志， 2013， 8（15）：2006-2007.

[4] 邊佳明， 丁媛媛， 楊凡， 等.拭樣增菌對(duì)實(shí)時(shí)熒光PCR法檢測(cè)孕婦B族鏈球菌感染的影響.現(xiàn)代檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志， 2012， 1（6）： 102-103.

[5] 王麗， 葉巍， 馬杰.實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)和細(xì)菌培養(yǎng)法檢測(cè)妊娠晚期孕婦定植B族鏈球菌感染臨床分析.國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志， 2014， 8（16）：2220-2221.

[6] 李小梅， 李瑾， 袁敏智.用聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)探討B(tài)群鏈球菌與胎膜早破的關(guān)系.河北醫(yī)學(xué)， 2011， 17（3）：300-302.

[收稿日期：2015-11-24]