池塘養(yǎng)殖海蜇疾病的病因分析

文/鄭斌 鄒紹林 姚洪 解明旭 楊曉宇 李強(qiáng)* 李華

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池塘養(yǎng)殖海蜇疾病的病因分析

文/鄭斌 鄒紹林 姚洪 解明旭 楊曉宇 李強(qiáng)* 李華

本文通過對丹東東港某養(yǎng)殖場患病海蜇以及患病池塘水環(huán)境樣品進(jìn)行剖檢、細(xì)菌分離與鑒定、水質(zhì)理化指標(biāo)、浮游植物定性定量等檢測，通過病因分析，此次海蜇出現(xiàn)大批塌蓋和個(gè)體生長緩慢癥狀的原因可能是養(yǎng)殖水環(huán)境惡劣造成。因此在海蜇養(yǎng)殖過程中，要盡量調(diào)節(jié)和保持養(yǎng)殖的水質(zhì)條件。

海蜇（Rhopilema esculentum Kishinouye）屬腔腸動(dòng)物門（Coelentera）、缽水母綱（Scyphozoa）、根口水母目（Rhizostomeae）、根口水母科（Rhizostomatidae）、海蜇屬（Rhopilema），分布于日本、朝鮮半島沿岸、俄羅斯遠(yuǎn)東海域，中國北起遼寧，南到福建的廣闊海域。海蜇營養(yǎng)豐富，是一種低熱量、低脂肪、高蛋白的營養(yǎng)食品；海蜇還有很高的藥用功效，可消腫解毒、消熱化痰，治療高血壓、哮喘、氣管炎、陰虛便秘等癥。此外，海蜇毒素及其藥理作用也受到較多的關(guān)注，可能具有廣闊的開發(fā)前景。20世紀(jì)末，由于海蜇自然資源減少，國內(nèi)外對海蜇的需求量不斷增加，海蜇養(yǎng)殖業(yè)逐漸興起，成為一支新興產(chǎn)業(yè)。2003年僅遼寧省海蜇養(yǎng)殖規(guī)模達(dá)到9600公頃，生產(chǎn)鮮蜇7100t；2010年東港市海蜇養(yǎng)殖面積6235公頃，產(chǎn)量15136t，產(chǎn)值15508萬元。

近年來，隨著海蜇養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，海蜇病害日益顯現(xiàn)，給海蜇養(yǎng)殖業(yè)帶來威脅。海蜇主要的病害有氣泡病、平頭、長脖、腐爛、塌蓋、小蝦附著等。楊輝等認(rèn)為海蜇形成塌蓋的原因一是突變的天氣使海蜇產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，不斷撞網(wǎng)造成的；二是圍網(wǎng)深度不夠，海蜇?fù)尀┰斐傻摹Ｌ平B林等報(bào)道了池塘養(yǎng)殖海蜇的氣泡病，認(rèn)為春季放苗階段發(fā)病率高于夏季養(yǎng)殖階段；陰雨天氣之后晴天和連續(xù)晴天水色突然變紅是發(fā)病高峰時(shí)。張錫佳等報(bào)道，養(yǎng)殖池塘中氨氮的濃度大于374.45?g/L時(shí)，海蜇則沉底死亡。季東升等指出，海蜇養(yǎng)殖過程中容易發(fā)生潰爛病，主要與初級(jí)生產(chǎn)力不足有關(guān)，可通過注入淡水提高水體的透明度，保證有充足的初級(jí)生產(chǎn)力，以促進(jìn)海蜇的快速生長。關(guān)于海蜇池塘病害防治方法的報(bào)道只涉及一些生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn)，具體有關(guān)海蜇疾病病因系統(tǒng)試驗(yàn)研究尚未見報(bào)道。

本文通過對丹東東港某養(yǎng)殖場患病海蜇以及患病池塘水環(huán)境樣品進(jìn)行剖檢、細(xì)菌分離與鑒定、水質(zhì)理化指標(biāo)、浮游植物定性定量等檢測，分析影響海蜇生長和發(fā)生病害的原因，以期為海蜇的健康養(yǎng)殖提供有力參考。

一、材料與方法

（一）試驗(yàn)材料

2015年7月，對丹東東港某一養(yǎng)殖場7個(gè)養(yǎng)殖池塘的海蜇樣品和池塘水樣進(jìn)行了采集?；疾『ｒ嘏c縊蟶、東方對蝦、毛蚶、文蛤、牙鲆和河豚混養(yǎng)，海蜇養(yǎng)殖密度為30個(gè)/畝～50個(gè)/畝。

（二）試驗(yàn)方法

1.肉眼檢查及剖檢

將樣品編號(hào)，肉眼觀察體表癥狀，解剖傘體部和口腕部，對胃腔、中膠層和口柱進(jìn)行鏡檢，并記錄。

2.細(xì)菌分離

在無菌條件下，用接種環(huán)穿刺挑取海蜇的胃腔、中膠層和口柱，同時(shí)在胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）培養(yǎng)基和硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖瓊脂（TCBS）培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線分離，于28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時(shí)，挑取優(yōu)勢菌的單菌落，在平板上純化培養(yǎng)3次，將純化后的分離株分別在常溫和低溫（-80℃）保種。

3.細(xì)菌鑒定

（1）分子生物學(xué)鑒定

對分離菌株進(jìn)行常規(guī)16SrDNA基因序列鑒定，將得到的產(chǎn)物送至北京華大基因有限公司進(jìn)行測序。將測序的結(jié)果在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行BLAST比對。

（2）生化鑒定

采用法國生物梅里埃公司生產(chǎn)的微量多項(xiàng)試驗(yàn)鑒定系統(tǒng)(API 20E生化檢測試劑盒），結(jié)合美國Biolog公司BIOLOG微生物自動(dòng)分析系統(tǒng)部分指標(biāo)，參照使用說明書進(jìn)行生化特征分析。

4.藥敏試驗(yàn)

采用藥敏紙片法。

5.水體浮游植物的測定

在每個(gè)海蜇養(yǎng)殖池塘取1L水樣，用福爾馬林固定，在顯微鏡下采用浮游植物計(jì)數(shù)框（0.1mL）進(jìn)行種類鑒定并計(jì)數(shù)。

數(shù)量計(jì)算：一升水中的浮游植物的數(shù)量（N）可用下列公式計(jì)算。

N=Cs×V×Pn/（Fs×Fn×U）

式中：

Cs—計(jì)數(shù)框面積（mm2），實(shí)驗(yàn)使用的計(jì)數(shù)框面積為400mm2；

Fs—每個(gè)視野的面積（mm2）；

Fn—計(jì)數(shù)過的視野數(shù)；

V—一升水樣經(jīng)沉淀濃縮后的體積（mL）；

U—計(jì)數(shù)框的體積（mL）為0.1mL；

Pn—計(jì)數(shù)出的浮游植物個(gè)數(shù)。

6.水體理化指標(biāo)的測定

在每個(gè)海蜇養(yǎng)殖池塘取1L水樣，測定水質(zhì)的鹽度、pH、化學(xué)需氧量、亞硝酸鹽、氨氮和活性磷6個(gè)指標(biāo)。

用鹽度計(jì)（ATC型）測定水體鹽度，用pH計(jì)（PH-281型）測定水體pH，其他指標(biāo)依據(jù)國家《海洋調(diào)查規(guī)范》GB/T12763.4-2007測定。化學(xué)需氧量用堿性高錳酸鉀法，亞硝酸鹽用重氮—偶氮光度法（萘乙二胺分光光度法），氨氮用納氏試劑法，活性磷用抗壞血酸還原磷鉬藍(lán)法。

二、結(jié)果與分析

1.臨床癥狀及剖檢結(jié)果

2015年6月26日，池塘養(yǎng)殖海蜇開始發(fā)病，持續(xù)10多天，患病海蜇游泳遲緩、不愛攝食、長勢慢、頂網(wǎng)、畸形、縮水、腐爛，個(gè)別個(gè)體出現(xiàn)死亡。檢查和剖檢發(fā)現(xiàn)患病海蜇個(gè)體小、傘體扁平，嚴(yán)重的傘部會(huì)有凹陷即塌蓋，傘體部和口腕部無機(jī)械損傷。對胃腔、中膠層和口柱進(jìn)行鏡檢未發(fā)現(xiàn)大量寄生蟲感染。患病海蜇癥狀見圖1。

圖1 患病海蜇肉眼癥狀【1.患病海蜇（塌蓋），2.正常海蜇】

2.細(xì)菌分離鑒定和藥敏試驗(yàn)結(jié)果

在海蜇胃腔壁及中膠層內(nèi)沒有分離到細(xì)菌，在其胃腔和口柱內(nèi)分離獲得三株優(yōu)勢菌，分別編號(hào)為2015070501、2015070502和2015070503。菌落乳黃色、圓形、濕潤、表面光滑、不透明、菌落直徑1.5mm～2mm，其中2015070503菌落形狀較其它兩株彌散。

三菌株革蘭氏染色陰性，TCBS選擇培養(yǎng)基上細(xì)菌菌落呈黃色，經(jīng)16srDNA檢測為弧菌屬細(xì)菌。在進(jìn)行的41項(xiàng)生化試驗(yàn)鑒定中（表1），除分離株2015070502 D-纖維二糖的結(jié)果不同之外，其余菌株與溶藻弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的結(jié)果完全相同（參照伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊）。根據(jù)以上結(jié)果，鑒定菌株2015070501、2015070502、2015070503是溶藻弧菌。其中2015070501和2015070502菌株是從患病海蜇胃腔和口柱內(nèi)分離，2015070503菌株是從正常海蜇胃腔內(nèi)分離獲得。據(jù)此結(jié)果分析認(rèn)為：一是海蜇容易感染溶藻弧菌；二是溶藻弧菌可能不是引起該病的直接原因；三是溶藻弧菌對海蜇的致病性有必要進(jìn)一步跟蹤研究。

藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果見表2。表中可見，三株菌均對頭孢哌酮、吡哌酸、氟苯尼考和左氟沙星敏感，其中分離株2015070502還對氨芐西林和慶大霉素敏感，分離株2015070503對利福平敏感。

3.浮游植物檢測結(jié)果

本次檢測的7個(gè)水樣優(yōu)勢種大都分是甲藻門(Dinophyta)和裸藻門(Euglenophyta)，藻類組成單一，多樣性小，海蜇養(yǎng)殖池塘浮游植物優(yōu)勢種類見圖2，定量結(jié)果見表3。將此次浮游生物定量結(jié)果與水體赤潮標(biāo)準(zhǔn)（表4、表5）進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)a、e、f三個(gè)養(yǎng)殖池塘已達(dá)到赤潮標(biāo)準(zhǔn)，其它池塘的藻類組成單一，生物量高，有發(fā)生赤潮的潛在風(fēng)險(xiǎn)。

表1 分離菌株與溶藻弧菌生化特征比較

赤潮生物包括浮游生物、原生動(dòng)物和細(xì)菌等，其中有毒、有害赤潮生物以甲藻類居多；其次為硅藻、藍(lán)藻、著色鞭毛藻和原生動(dòng)物等。本試驗(yàn)中7個(gè)養(yǎng)殖池塘甲藻類的大量繁殖降低了水中溶解氧，產(chǎn)生了毒素，對海蜇造成了嚴(yán)重影響，甚至引起死亡。筆者認(rèn)為應(yīng)采取大量換水和潑灑漂白粉來改變池塘的藻類組成。

表2 三株分離菌株的藥敏試驗(yàn)結(jié)果

表3 水體浮游植物定性定量結(jié)果

表4 有害赤潮生物體長及生物量

表5 主要赤潮生物形成赤潮時(shí)的細(xì)胞基準(zhǔn)密度

圖2 養(yǎng)殖水體優(yōu)勢浮游植物【1.裸甲藻，2.卡拉直克擬鈴蟲，3.環(huán)溝藻，4.裸藻，5.海洋原甲藻，6.微小原甲藻，7.菱形藻】

4.水質(zhì)理化因子測定結(jié)果

海蜇在池塘中營浮游生活，水質(zhì)條件影響著海蜇的生長發(fā)育。海蜇生長的最適鹽度為18～25，本次檢測的結(jié)果b和f池塘鹽度偏高達(dá)33和34，不利于海蜇生長，其它池塘鹽度均低于30。作者認(rèn)為，應(yīng)通過注入淡水降低池水鹽度，使海蜇快速生長。其它水質(zhì)理化指標(biāo)（表6）與已頒布的水質(zhì)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（表7）進(jìn)行比較，a池塘化學(xué)需氧量含量超過海水水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)三類；a和g池塘氨氮含量雖符合地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)三類，但對于海蜇養(yǎng)殖水體來說氨氮含量偏高；a、b和c池塘活性磷含量超過海水水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)三類。

三、結(jié)論

1.病因分析

根據(jù)患病海蜇池塘水樣的水質(zhì)理化指標(biāo)和浮游植物檢測，患病海蜇樣品的臨床癥狀、解剖檢查、細(xì)菌檢測結(jié)果分析，此次海蜇出現(xiàn)大批塌蓋和個(gè)體生長緩慢癥狀的原因可能是：

表6 養(yǎng)殖池塘水質(zhì)理化指標(biāo)測定結(jié)果

表7 水質(zhì)理化指標(biāo)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

（1）養(yǎng)殖水環(huán)境中浮游植物單一，甲藻和裸藻大量繁殖，造成水體赤潮，導(dǎo)致海蜇在水體中缺氧、藻類毒素中毒，海蜇產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，其傘體部不斷撞擊圍網(wǎng)，造成塌蓋癥狀，嚴(yán)重影響海蜇生長。

（2）養(yǎng)殖海蜇水環(huán)境中鹽度偏高，個(gè)別池塘COD、氨氮和活性磷含量偏高，這種水質(zhì)狀況不利于海蜇的正常生長。

（3）從患病海蜇和正常海蜇胃腔、口柱內(nèi)分離出溶藻弧菌，而在海蜇組織中未分離到細(xì)菌，因此該菌不是疾病的直接原因。

2.解決措施

通過以上檢測可以看出，養(yǎng)殖水環(huán)境惡劣與海蜇生長緩慢或撞網(wǎng)塌蓋相關(guān)。因此，在外海水質(zhì)較好情況下應(yīng)迅速大量換水、使用消毒劑和微生態(tài)制劑改善水環(huán)境。當(dāng)池塘水體發(fā)生赤潮前夕或已發(fā)生時(shí)，應(yīng)立即潑灑漂白粉等殺死有害生物。在海蜇養(yǎng)殖過程中，要盡量滿足或調(diào)節(jié)養(yǎng)殖池塘鹽度在18～25，透明度在50cm～70cm，pH調(diào)控在8.0～8.5，溶解氧保持在4mg/L以上，氨氮小于0.4mg/L，水色為黃綠色或褐綠色為好。

作者單位：大連海洋大學(xué) 農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室