丹參酚酸B和山楂黃酮合用對(duì)游離脂肪酸誘導(dǎo)的大鼠肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積和凋亡的作用

薛冬英　襲渤人　張潔　葉軍

200062　上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院感染科

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·論著·

丹參酚酸B和山楂黃酮合用對(duì)游離脂肪酸誘導(dǎo)的大鼠肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積和凋亡的作用

薛冬英襲渤人張潔葉軍

200062上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院感染科

【摘要】目的研究丹參酚酸B和山楂黃酮對(duì)游離脂肪酸誘導(dǎo)大鼠肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積和凋亡的作用及其機(jī)制。方法采用肝臟原位膠原酶灌注法分離大鼠原代肝細(xì)胞，油酸：棕櫚酸=2:1造模。原代肝細(xì)胞和HepG2均分為正常對(duì)照組、模型組、模型+丹參酚酸B組、模型+山楂黃酮組、模型+丹參酚酸B+山楂黃酮組、模型+SP600125組、丹參酚酸B組、山楂黃酮組、丹參酚酸B+山楂黃酮組、SP600125組、DMSO對(duì)照組。游離脂肪酸刺激原代肝細(xì)胞的濃度為250 μmol/L、刺激HepG2的濃度為500 μmol/L；丹參酚酸B的濃度為1 μmol/L；山楂黃酮的濃度為5 μg/mL；SP600125的濃度為10 μmol/L。觀察①油紅O染色：丹參酚酸B和山楂黃酮對(duì)游離脂肪酸刺激的肝細(xì)胞內(nèi)脂滴變化的影響；②ELISA法：丹參酚酸B和山楂黃酮對(duì)游離脂肪酸誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡的影響；③高內(nèi)涵篩選Hoechst33258染色：丹參酚酸B和山楂黃酮對(duì)游離脂肪酸誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡的影響；④Western blot：丹參酚酸B和山楂黃酮對(duì)游離脂肪酸刺激的肝細(xì)胞內(nèi)p-JNK表達(dá)的影響。結(jié)果①油紅O染色顯示：與正常對(duì)照組比較，游離脂肪酸作用于原代肝細(xì)胞、HepG2細(xì)胞24 h后，細(xì)胞內(nèi)脂滴含量顯著增加(P均<0.01)。丹參酚酸和山楂黃酮可顯著減少游離脂肪酸誘導(dǎo)的原代肝細(xì)胞、HepG2細(xì)胞內(nèi)脂滴的含量(P<0.01,P<0.05)。②ELISA檢測(cè)結(jié)果：與正常對(duì)照組相比游離脂肪酸組原代肝細(xì)胞及HepG2細(xì)胞吸光值[Absorbance(A405 nm-A490nm)]顯著增高，細(xì)胞凋亡明顯(P均<0.01)；丹參酚酸B和山楂黃酮顯著抑制游離脂肪酸誘導(dǎo)的原代肝細(xì)胞、HepG2細(xì)胞凋亡(P均<0.01)。③ 高內(nèi)涵篩選Hoechst33258染色：與正常對(duì)照組比較，游離脂肪酸組細(xì)胞核平均熒光強(qiáng)度值及凋亡率明顯增高(P均<0.01)。丹參酚酸B和山楂黃酮顯著降低游離脂肪酸刺激的原代肝細(xì)胞細(xì)胞核平均熒光強(qiáng)度值及凋亡率(P均<0.01)。HepG2細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果與原代肝細(xì)胞趨勢(shì)一致。④Western blot結(jié)果：與正常對(duì)照組比較，游離脂肪酸刺激原代肝細(xì)胞24 h時(shí)可顯著促進(jìn)p-JNK的表達(dá)(P均<0.01)。丹參酚酸B和山楂黃酮對(duì)游離脂肪酸刺激原代肝細(xì)胞24 h時(shí)p-JNK的表達(dá)有顯著抑制作用(P均<0.01)。HepG2細(xì)胞p-JNK結(jié)果與原代肝細(xì)胞趨勢(shì)一致。結(jié)論①丹參酚酸B和山楂黃酮合用能夠抑制游離脂肪酸誘導(dǎo)的肝細(xì)胞內(nèi)脂滴增加及肝細(xì)胞凋亡。②丹參酚酸B和山楂黃酮合用能夠抑制游離脂肪酸誘導(dǎo)的肝細(xì)胞內(nèi)JNK的活化。二者是丹參酚酸B和山楂黃酮合用防治非酒精性脂肪性肝炎的重要機(jī)制。

【關(guān)鍵詞】肝細(xì)胞；丹參酚酸B；山楂黃酮；游離脂肪酸；肝細(xì)胞凋亡；c-jun氨基末端激酶

非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)以肝細(xì)胞的損傷、脂肪貯積、凋亡和肝臟炎癥、纖維化為特征，可進(jìn)展至肝硬化、肝功能衰竭甚至肝細(xì)胞肝癌等[1]，目前沒有特效藥治療，本研究探討丹參酚酸B與山楂黃酮合用對(duì)游離脂肪酸誘導(dǎo)的大鼠肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積、肝細(xì)胞凋亡及其相關(guān)JNK信號(hào)蛋白的作用。

資料和方法

一、材料

(一) 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物Sprague Dawley雄性大鼠，體質(zhì)量120～180 g，清潔級(jí)，購(gòu)自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

(二) 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞采用人肝癌細(xì)胞株(human hepatoblastoma cell line，HepG2)，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫(kù)。

(三) 試劑丹參酚酸B(Salvianolic acid B,Sal B)：Salvianolic acid B-Mg2+(Sal B-Mg2+)購(gòu)自上海同田生物技術(shù)股份有限公司，純度≥95%(by HPLC),分子式(C36H30O16Mg)，分子量為742；山楂黃酮(Hawthorn flavone)購(gòu)自南京澤郎醫(yī)藥科技有限公司，純度≥95%(by HPLC)。油酸、棕櫚酸、DMSO、膠原酶Ⅳ型、油紅O購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；JNK Inhibitor II(SP600125)；MEM培養(yǎng)基干粉、DMEM培養(yǎng)基干粉、RPMI1640培養(yǎng)基干粉；胎牛血清、胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。Phospho-SAPK/JNK(Thr183/Tyr185)(98F2) Rabbit mAb購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司產(chǎn)品。PageRulerTMPrestained Protein Ladder Plus(蛋白預(yù)染marker)購(gòu)自美國(guó)MBI Fermentas公司。GAPDH抗體、KC-5G4購(gòu)自上?？党缮锕こ逃邢薰?。IRDye 680 goat anti-rabbit IgG、IRDye 800CW donkey anti-mouse IgG、Odyssey Blocking Buffer購(gòu)自美國(guó)LI-COR公司。PVDF膜(0.45 μm)購(gòu)自美國(guó)Millipore公司。Western及IP細(xì)胞裂解液、Hoechst 33258染色液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、臺(tái)盼藍(lán)染色細(xì)胞存活率檢測(cè)試劑盒、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5×)購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所。蛋白酶抑制劑混合物(complete mini)、磷酸酶抑制劑混合片(PhosSTOP)、Cell Death Detection ELISAPLUS均為德國(guó)Roche公司產(chǎn)品。HEPES、Tris、EDTA、TEMED、Glycine、SDS購(gòu)自美國(guó)Amresco公司。

(四)設(shè)備高溫滅菌CO2培養(yǎng)箱，371型，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司。生物安全柜，HR60-IIA2，青島海爾特種電器有限公司。微孔板掃描分光光度計(jì)，MQX200R，美國(guó)Bio-Tek公司。多功能電子蠕動(dòng)泵，DDB-320，寧波石浦海天電子儀器廠，留置針，18G，上海衛(wèi)生技術(shù)設(shè)備公司。雙色紅外激光成像系統(tǒng)，Odyssey；電泳儀，PowerPac Basic；半干轉(zhuǎn)膜儀，1703940型，均為美國(guó)BIO-RAD公司生產(chǎn)。冷凍離心機(jī)，Jouan MR23i型；高內(nèi)涵篩選分析儀，ArrayScan○RVTI；酶標(biāo)儀，Multiskan MK3，為美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司生產(chǎn)。

二、方法

(一)肝細(xì)胞分離使用3%戊巴比妥鈉(0.2 mL/100 g)腹腔注射麻醉大鼠，將大鼠固定在解剖板上。75%酒精消毒胸腹部皮毛，而后U型剖腹，18G留置針穿刺門靜脈，結(jié)扎線固定穿刺針；待血液流出后，接通靜脈輸液管，開啟恒流泵(流量為10 mL/min)，37 ℃溫育的前灌流液沖洗肝臟，立即剪斷下腔靜脈。接著以37 ℃預(yù)溫育的Ⅳ型膠原酶液(5 mL/min)灌流，最后摘下肝臟，置于盛有4 ℃預(yù)冷的MEM培養(yǎng)液的滅菌100 mm培養(yǎng)皿中。分散后的細(xì)胞懸液經(jīng)雙層紗布過濾并分裝入滅菌的50 mL聚丙烯離心管內(nèi)，經(jīng)4 ℃離心3次。

(二)肝細(xì)胞培養(yǎng)根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度至5×105cells/mL接種。置于37 ℃、5% CO2～95%空氣的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，約4～6 h細(xì)胞貼壁后換液。實(shí)驗(yàn)前改為0.5%FBS-RPMI1640培養(yǎng)。

(三)HepG2細(xì)胞株培養(yǎng)以0.25%胰酶/0.02%EDTA消化傳代，以含10%FBS-DMEM培養(yǎng)液，置于37 ℃、含5% CO2～95%空氣的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞融合度至70%～80%，換液，實(shí)驗(yàn)前改為0.5%FBS-DMEM培養(yǎng)。

(四)分組原代肝細(xì)胞和HepG2細(xì)胞株均分為：正常對(duì)照組、模型組、模型+丹參酚酸B組、模型+山楂黃酮組、模型+丹參酚酸B+山楂黃酮、模型+SP600125組、丹參酚酸B組、山楂黃酮組、丹參酚酸B+山楂黃酮組、SP600125組、DMSO對(duì)照組。根據(jù)參考文獻(xiàn)[2,3]，以250 μmol/L(油酸∶棕櫚酸=2∶1)為原代肝細(xì)胞非酒精性脂肪性肝炎體外模型的刺激濃度，500 μmol/L(油酸∶棕櫚酸=2∶1)為HepG2非酒精性脂肪性肝炎體外模型的刺激濃度。根據(jù)參考文獻(xiàn)常用劑量[4-7]SP600125濃度為10 μmol/L，丹參酚酸B濃度為1 μmol/L，山楂黃酮5 μg/mL。

(五)脂滴油紅O染色將原代肝細(xì)胞及HepG2以適當(dāng)密度接種于96孔培養(yǎng)板，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，100 μL培養(yǎng)液/孔，加藥培養(yǎng)24 h。用PBS洗3次，100 μL 50%異丙醇/孔固定1 min。油紅O新鮮染液100 μL/孔染色15 min，60%異丙醇100 μL/孔洗去多余染液，三蒸水100 μL/孔沖洗3次。每孔加100 μL DMSO溶解油紅O，振蕩混勻，酶標(biāo)儀510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定光密度(OD)值。

(六)ELISA法檢測(cè)細(xì)胞凋亡各組細(xì)胞加藥培養(yǎng)24 h后，以PBS洗滌3次，每皿(60 mm)加入200 μL裂解液(Lysis B?ffer)，將培養(yǎng)皿中的細(xì)胞刮下，收入1.5 mL離心管中，混勻，15～25 ℃作用30 min，然后200 g離心10 min，收集細(xì)胞裂解物按照分組將96孔微孔板中每孔加入20 μL樣本，同時(shí)加入80 μL免疫反應(yīng)試劑(抗組蛋白-生物素∶抗-DNA-POD∶溫育緩沖液=1∶1∶18)，封口，置搖床上，300 rpm，15～25 ℃，孵育2 h。棄上清，用250 μL溫育緩沖液/孔(Incubation Buffer)洗滌3次，加入100 μL ABTS底物緩沖液/孔，置搖床上，250 rpm，15～25 ℃，孵育至顏色變化至適合程度。以DNA-組蛋白復(fù)合物作陽性對(duì)照，底物緩沖液作空白對(duì)照，15 min后作比色分析，檢測(cè)波長(zhǎng)405 nm，內(nèi)參波長(zhǎng)490 nm。以吸光值[Absorbance(A405nm-A490nm)]進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

(七)高內(nèi)涵篩選Hoechst33258染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡按分組將細(xì)胞以每孔100 μL接種于96孔培養(yǎng)板，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，加藥培養(yǎng)24 h后，以溫育的PBS洗滌三遍，每孔加入Hoechst33258染色液100 μL，置含5% CO2-95%空氣的37 ℃ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min。棄染色液，用PBS 100 μL/孔洗滌2次，使用高內(nèi)涵篩選分析儀進(jìn)行檢測(cè)。

(八)Western-blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)p-JNK蛋白表達(dá)用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞兩次，加入含蛋白酶磷酸酶抑制劑的細(xì)胞裂解液。收集細(xì)胞至EP管中，混勻，冰上靜置30 min。4 ℃，12 000 rpm離心15 min，取上清。按照BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒進(jìn)行蛋白定量，行SDS-PAGE凝膠電泳。電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，Western 印跡檢測(cè)p-JNK(p-JNK工作液濃度為1∶1000)，二抗為相應(yīng)來源的以O(shè)dyssey封阻液稀釋的紅外染料標(biāo)記二抗(1∶5 000稀釋)。GAPDH的檢測(cè)：一抗為GAPDH多克隆抗體，二抗為相應(yīng)來源的以O(shè)dyssey封阻液稀釋的紅外染料標(biāo)記二抗(1∶5 000稀釋)。選擇合適的掃描區(qū)域、分辨率、熒光強(qiáng)度，設(shè)置700通道(680 nm激發(fā)，720 nm檢測(cè))或800通道(780 nm激發(fā)，820 nm檢測(cè))，進(jìn)行掃描。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。多組間比較采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-Way ANOVA)。兩兩之間多重比較，方差齊者用LSD檢驗(yàn)，方差不齊者用Dunnett's T3檢驗(yàn)。

結(jié)果

一、油紅O染色檢測(cè)丹參酚酸B和山楂黃酮對(duì)游離脂肪酸刺激的細(xì)胞內(nèi)脂滴變化的影響(見表1)

與正常對(duì)照組比較，游離脂肪酸作用于原代肝細(xì)胞、HepG2細(xì)胞24 h后，細(xì)胞內(nèi)脂滴含量顯著增加(P均<0.01)。丹參酚酸B、山楂黃酮、丹參酚酸B +山楂黃酮、SP600125對(duì)正常培養(yǎng)的原代肝細(xì)胞、HepG2細(xì)胞內(nèi)脂滴含量無明顯影響，但顯著減少游離脂肪酸誘導(dǎo)的原代肝細(xì)胞、HepG2細(xì)胞內(nèi)脂滴含量(P<0.01,P<0.05)。

二、 ELISA法檢測(cè)丹參酚酸B和山楂黃酮對(duì)游離脂肪酸誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的影響(見表2)

與正常對(duì)照組相比，游離脂肪酸組原代肝細(xì)胞、HepG2細(xì)胞吸光值[Absorbance(A405nm-A490nm)]顯著增高，細(xì)胞凋亡明顯(P均<0.01)；丹參酚酸B、山楂黃酮、丹參酚酸B +山楂黃酮、SP600125對(duì)正常培養(yǎng)的原代肝細(xì)胞、HepG2吸光值無明顯影響，但顯著減少游離脂肪酸誘導(dǎo)的原代肝細(xì)胞、HepG2細(xì)胞吸光值(P<0.01,P<0.05)。

表1　各組原代肝細(xì)胞、HepG2細(xì)胞油紅O染色光密度(OD)值比較

注：與正常對(duì)照組相比，**P<0.01；與模型組相比，##P<0.01，#P<0.05；與模型+丹參酚酸相比，&&P<0.01，&P<0.05；與模型+山楂黃酮相比，●●P<0.01；與模型+丹參酚酸+山楂黃酮組相比，■■P<0.01

表2　各組原代肝細(xì)胞、HepG2細(xì)胞吸光值比較

注：與正常對(duì)照組相比，**P<0.01；與模型組相比，##P<0.01，#P<0.05；與模型+丹參酚酸相比，&&P<0.01，&P<0.05；與模型+山楂黃酮相比，●●P<0.01；與模型+丹參酚酸+山楂黃酮組相比，■■P<0.01

三、高內(nèi)涵篩選Hoechst33258染色分析丹參酚酸B和山楂黃酮對(duì)游離脂肪酸誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的影響

與正常對(duì)照組比較，游離脂肪酸組原代肝細(xì)胞核平均熒光強(qiáng)度值及凋亡率明顯增高(P均<0.01)。丹參酚酸B、山楂黃酮、丹參酚酸B和山楂黃酮、SP600125顯著降低游離脂肪酸刺激的原代肝細(xì)胞細(xì)胞核平均熒光強(qiáng)度值及凋亡率(P<0.05,P<0.01)。見表3。

高內(nèi)涵篩選Hoechst33258染色觀察HepG2細(xì)胞凋亡(見表4)：各組細(xì)胞核平均熒光強(qiáng)度值及凋亡率比較，趨勢(shì)與原代肝細(xì)胞一致。

四、Western blot法觀察丹參酚酸B和山楂黃酮對(duì)游離脂肪酸刺激的細(xì)胞內(nèi)p-JNK表達(dá)的影響藥物作用24 h，與正常對(duì)照組比較，游離脂肪酸可顯著促進(jìn)p-JNK的表達(dá)(P均<0.01)。丹參酚酸B、山楂黃酮、丹參酚酸B和山楂黃酮、SP600125對(duì)正常培養(yǎng)的24 h原代肝細(xì)胞p-JNK表達(dá)無明顯影響，但對(duì)經(jīng)游離脂肪酸刺激的p-JNK的表達(dá)均有顯著抑制作用(P均<0.01)。見圖1、圖3。

表3　各組原代肝細(xì)胞核平均熒光強(qiáng)度及凋亡率的比較

注：與正常對(duì)照組相比，**P<0.01；與模型組相比，##P<0.01，#P<0.05；與模型+丹參酚酸相比，&&P<0.01，&P<0.05；與模型+山楂黃酮相比，●●P<0.01；與模型+丹參酚酸+山楂黃酮組相比，■■P<0.01

表4　各組HepG2細(xì)胞核平均熒光強(qiáng)度及凋亡率的比較

注：與正常對(duì)照組相比，**P<0.01；與模型組相比，##P<0.01，#P<0.05；與模型+丹參酚酸相比，&&P<0.01，&P<0.05；與模型+山楂黃酮相比，●●P<0.01；與模型+丹參酚酸+山楂黃酮組相比，■■P<0.01

24 h HepG2細(xì)胞p-JNK表達(dá)結(jié)果見圖2，圖4，各組比較，趨勢(shì)與原代肝細(xì)胞一致。

C：正常對(duì)照組；M：模型組；MB：模型+丹參酚酸B組；MBH：模型+丹參酚酸B+山楂黃酮組；MS：模型+SP600125組；B：丹參酚酸B組；H：山楂黃酮組；BH：丹參酚酸B+山楂黃酮組；S：SP600125組；D：DMSD對(duì)照組

圖1Western blot法檢測(cè)各組原代肝細(xì)胞p-JNK表達(dá)情況

C：正常對(duì)照組；M：模型組；MB：模型+丹參酚酸B組；MBH：模型+丹參酚酸B+山楂黃酮組；MS：模型+SP600125組；B：丹參酚酸B組；H：山楂黃酮組；BH：丹參酚酸B+山楂黃酮組；S：SP600125組；D：DMSD對(duì)照組

圖2Western blot法檢測(cè)各組HepG2細(xì)胞p-JNK表達(dá)情況

C：正常對(duì)照組；M：模型組；MB：模型+丹參酚酸B組；MBH：模型+丹參酚酸B+山楂黃酮組；MS：模型+SP600125組；B：丹參酚酸B組；H：山楂黃酮組；BH：丹參酚酸B+山楂黃酮組；S：SP600125組；D：DMSD對(duì)照組

注：與正常對(duì)照組相比，**P<0.01；與模型組相比，##P<0.01，#P<0.05；與模型+丹參酚酸相比，&&P<0.01，&P<0.05；與模型+山楂黃酮相比，●●P<0.01；與模型+丹參酚酸+山楂黃酮組相比，■■P<0.01

圖3原代肝細(xì)胞p-JNK的半定量分析圖

C：正常對(duì)照組；M：模型組；MB：模型+丹參酚酸B組；MBH：模型+丹參酚酸B+山楂黃酮組；MS：模型+SP600125組；B：丹參酚酸B組；H：山楂黃酮組；BH：丹參酚酸B+山楂黃酮組；S：SP600125組；D：DMSD對(duì)照組

注：與正常對(duì)照組相比，**P<0.01；與模型組相比，##P<0.01，#P<0.05；與模型+丹參酚酸相比，&&P<0.01，&P<0.05；與模型+山楂黃酮相比，●●P<0.01；與模型+丹參酚酸+山楂黃酮組相比，■■P<0.01

圖4HepG2細(xì)胞p-JNK的半定量分析圖

討論

多項(xiàng)研究提示肝細(xì)胞凋亡與NASH發(fā)病相關(guān)。Feldstein等[2]應(yīng)用TUNEL法檢測(cè)NASH患者肝組織標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞凋亡明顯增加，且與NASH的嚴(yán)重性相關(guān)。南月敏等[8]采用高脂、膽堿-甲硫氨酸缺乏飲食方法建立小鼠NASH模型，TUNEL分析結(jié)果顯示肝細(xì)胞凋亡為本模型的突出病理組織學(xué)特征。

而游離脂肪酸的增加對(duì)肝細(xì)胞的損傷作用在NASH的發(fā)病中起著重要作用。此外，游離脂肪酸還具有內(nèi)毒素、促炎因子、肝星狀細(xì)胞增殖因子、細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑的作用[9，10]。游離脂肪酸對(duì)細(xì)胞的毒性作用與其種類相關(guān)，如油酸、亞油酸等多不飽和脂肪酸可通過激活肝內(nèi)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)促進(jìn)酒精、四氯化碳引起的大鼠肝損傷[11，12]；棕櫚酸通過激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，活化JNK信號(hào)通路，上調(diào)促凋亡蛋白的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞脂性凋亡[13]。

本研究油紅O染色結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，游離脂肪酸(油酸+棕櫚酸)分別作用于原代肝細(xì)胞、HepG2細(xì)胞24 h后，細(xì)胞內(nèi)脂滴含量顯著增加(P均<0.01)。以ELISA法檢測(cè)原代肝細(xì)胞、HepG2細(xì)胞凋亡，結(jié)果顯示與正常對(duì)照組相比，游離脂肪酸組原代肝細(xì)胞、HepG2細(xì)胞吸光值顯著增高，細(xì)胞凋亡明顯(P均<0.01)，且高內(nèi)涵篩選Hoechst33258染色觀察原代肝細(xì)胞、HepG2細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，游離脂肪酸組細(xì)胞核平均熒光強(qiáng)度值及凋亡率明顯增高(P均<0.01)。上述結(jié)果表明，游離脂肪酸能誘導(dǎo)原代肝細(xì)胞、HepG2細(xì)胞脂質(zhì)代謝紊亂且促進(jìn)其凋亡。

丹參酚酸B(Sal B)是丹參的主要水溶性有效成分之一，能減輕D-半乳糖胺大鼠肝細(xì)胞壞死，顯著降低血清ALT和AST含量[6]，能抑制體外傳代培養(yǎng)的肝星狀細(xì)胞的增殖，抑制肝星狀細(xì)胞生成細(xì)胞外基質(zhì)，減少膠原纖維的沉積[7]。

山植黃酮?jiǎng)t可顯著降低血清TC、TG、HDL -C水平[14]；山楂葉總黃酮還能顯著改善NASH大鼠的炎癥程度，能提高大鼠的血清SOD水平，降低MDA和TNF-α的含量，降低肝組織NF-κB p65、IκBα基因的 mRNA和蛋白表達(dá)[15]。

本研究油紅O染色結(jié)果顯示，與游離脂肪酸組相比，游離脂肪酸+丹參酚酸B組+山楂黃酮組原代肝細(xì)胞、HepG2細(xì)胞內(nèi)脂滴顯著減少(P均<0.01)。以ELISA法檢測(cè)原代肝細(xì)胞、HepG2細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示，與游離脂肪酸組比較，游離脂肪酸酸+丹參酚酸B+山楂黃酮組原代肝細(xì)胞、HepG2細(xì)胞吸光值顯著降低，細(xì)胞凋亡程度明顯減輕(P<0.05,P<0.01)。且高內(nèi)涵篩選Hoechst33258染色觀察原代肝細(xì)胞、HepG2細(xì)胞凋亡顯示，與游離脂肪酸組比較，游離脂肪酸酸+丹參酚酸B+山楂黃酮組原代肝細(xì)胞、HepG2細(xì)胞細(xì)胞核平均熒光強(qiáng)度明顯降低，細(xì)胞凋亡程度減輕(P<0.01)。上述結(jié)果表明丹參酚酸B+山楂黃酮可以減少肝細(xì)胞脂滴形成，改善肝細(xì)胞脂質(zhì)代謝紊亂，同時(shí)抑制游離脂肪酸誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

目前研究認(rèn)為多種刺激因素可引起從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到胞質(zhì)和胞核的信號(hào)傳導(dǎo), 最終引起細(xì)胞凋亡或適應(yīng)性存活，而JNK的激活通路是ERS(由各種原因引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中出現(xiàn)錯(cuò)誤折疊與未折疊蛋白在腔內(nèi)聚集以及Ca2+平衡紊亂的狀態(tài))誘發(fā)凋亡的途徑之一[16]。

本研究油紅O染色結(jié)果，與游離脂肪酸組相比，游離脂肪酸酸+SP600125組(JNK通路抑制劑) 原代肝細(xì)胞、HepG2細(xì)胞內(nèi)脂滴顯著減少(P均<0.01)；SP600125組原代肝細(xì)胞、HepG2細(xì)胞與正常對(duì)照組相比，細(xì)胞內(nèi)脂滴含量無差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

以ELISA法檢測(cè)原代肝細(xì)胞、HepG2細(xì)胞凋亡顯示，與游離脂肪酸組相比，游離脂肪酸+SP600125組原代肝細(xì)胞、HepG2細(xì)胞吸光值明顯降低，凋亡明顯減輕(P均<0.01)；SP600125組原代肝細(xì)胞、HepG2細(xì)胞與正常對(duì)照組比較，細(xì)胞凋亡程度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。且高內(nèi)涵篩選Hoechst33258染色觀察原代肝細(xì)胞、HepG2細(xì)胞凋亡顯示，與游離脂肪酸組相比，游離脂肪酸+SP600125組細(xì)胞核平均熒光強(qiáng)度顯著降低，凋亡明顯減輕(P<0.01)。SP600125組與正常對(duì)照組相比，核平均熒光強(qiáng)度值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。上述結(jié)果表明，SP600125亦可以改善游離脂肪酸誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。提示JNK通路激活在游離脂肪酸誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中起促凋亡作用。

Western blot檢測(cè)JNK結(jié)果顯示，藥物作用24 h后，游離脂肪酸均可顯著促進(jìn)原代肝細(xì)胞及HepG2細(xì)胞p-JNK的表達(dá)(P均<0.01)，即游離脂肪酸活化JNK的表達(dá)。結(jié)合油紅O染色、ELISA及高內(nèi)涵篩選Hoechst33258染色結(jié)果，說明游離脂肪酸誘導(dǎo)的JNK持續(xù)活化介導(dǎo)了細(xì)胞凋亡。JNK通路抑制劑SP600125對(duì)經(jīng)游離脂肪酸刺激、24 h原代肝細(xì)胞及HepG2細(xì)胞內(nèi)p-JNK的表達(dá)有顯著抑制作用(P均<0.01)，進(jìn)一步證明JNK通路的激活參與了游離脂肪酸誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。但油紅O染色、ELISA及高內(nèi)涵篩選Hoechst33258染色結(jié)果顯示，SP600125并不能完全抑制游離脂肪酸誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，推測(cè)可能還存在非JNK途徑介導(dǎo)游離脂肪酸誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑。游離脂肪酸+丹參酚酸B+山楂黃酮組與游離脂肪酸組比較，丹參酚酸B+山楂黃酮可以抑制經(jīng)游離脂肪酸刺激的24 h原代肝細(xì)胞及HepG2細(xì)胞內(nèi)p-JNK蛋白表達(dá)(P均<0.01)。即丹參酚酸B和山楂黃酮抑制JNK的活化。提示丹參酚酸B和山楂黃酮對(duì)游離脂肪酸誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的拮抗作用是通過抑制JNK信號(hào)途徑實(shí)現(xiàn)的。丹參酚酸B和山楂黃酮抑制JNK活化是其抑制游離脂肪酸誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的機(jī)制之一。

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16Pagliassotti MJ,Wei Y,Wang D.Insulin protects liver cells from saturated fatty acid-induced apoptosis via inhibition of c-Jun NH2 terminal kinase activity. Endocrinology,2007,148:3338-3345.

(本文編輯：錢燕)

更正啟事

《肝臟》2016年第21卷第2期第123～125頁發(fā)表了湖北省鄂州市中心醫(yī)院兒科高明、任章平撰寫的論文《熊去氧膽酸聯(lián)合護(hù)肝藥物對(duì)嬰兒肝炎綜合征生化指標(biāo)的影響》。按作者要求，添加通信作者：任章平，Email：chinaren1001@qq.com。特此更正。

《肝臟》編輯部2016年3月28日

Effects of salvianolic acid B and hawthorn flavone on lipid deposition and apoptosis of hepatocytes in rats induced by free fatty acids

XUEDong-ying,XIBo-ren,ZHANGJie,YEJun.

DepartmentofInfectiousDisease,PuTuoHospital,ShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shanghai200062,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effects of salvianolic acid B and hawthorn flavone on free fatty acids (FFA)-induced lipid deposition and apoptosis of hepatocytes in rats, and its potential mechanism. MethodsHepG2 cells and primary cultured hepatocytes isolated from male SD rats by collagenase perfusion were subjected for this study. Oleic acid and palmitic acid (O∶P=2∶1) were used to induce nonalcoholic steatohepatitis (NASH) in primary cultured hepatocytes and HepG2 cells, respectively. The cell models were divided into 11 groups, including normal control group, FFA group, FFA + salvianolic acid B group, FFA+ hawthorn flavone group, FFA + salvianolic acid B + hawthorn flavone group, FFA+ SP600125 group, salvianolic acid B group, hawthorn flavone group, hawthorn flavone + salvianolic acid B group, SP600125 group and DMSO control group, respectively. Correspondingly, the cell models of NASH in primary cultured hepatocytes and HepG2 cells were stimulated with different doses of FFA (250 μmol/L and 500 μmol/L ), salvianolic acid B (10-6mol/L), hawthorn flavone (5 μg/mL) and SP600125 (10 μmol/L), respectively. In order to evaluate the therapy effects of salvianolic acid B and hawthorn flavone against NASH, the following tests were performed: Oil Red O staining for lipid deposition, and enzyme-linked immune-sorbent assay (ELISA), chromatin dye and Hoechst 33258 staining for apoptosis. In addition, it was speculated that the therapy effect was associated with c-Jun N-terminal kinase (c-JNK), which was verified by western blot to assess the expression of phosphorylated-JNK (p-JNK). ResultsAfter 24h of incubation with FFA alone, lipids in primary cultured hepatocytes and HepG2 cells were significantly increased (P<0.01). Moreover, salvianolic acid B, hawthorn flavoneor and SP600125 sharply reduced lipids deposition, respectively (P<0.01,P<0.05). The intracellular lipids in DMSO control group had no significant difference than that in normal control group. ELISA showed that FFA induced apoptosis in primary hepatocytes and HepG2 cells (P<0.01). Meanwhile, salvianolic acid B, hawthorn flavone or SP600125 could significantly protect liver from FFA-induced apoptosis (P<0.05, P<0.01). Through chromatin dye and Hoechst 33258 staining, FFA-induced apoptosis in primary cultured hepatocytes and HepG2 cells was also observed under high content screening (HSC) (P<0.01). Salvianolic acid B and hawthorn flavone could significantly reduce the apoptosis (P<0.05, P<0.01), respectively. Western blot analysis showed that FFA treatment led to a significant increase in c-JNK activity (P<0.01) in primary cultured hepatocytes and HepG2 cells, while total JNK levels remained unchanged. Meanwhile, salvianolic acid B and hawthorn flavone could significantly reduce the JNK activity. ConclusionSalvianolic acid B and hawthorn flavone could alleviate FFA-induced apoptosis and lipid metabolism disorders, respectively. Furthermore, they could also inhibit JNK activity, which reveals an important molecular mechanism for treatment of NASH.

【Key words】Nonalcoholic steatohepatitis;Salvia;Salvianolic acid B;Free fatty acid; Hepatocyte apoptosis;c-Jun N-terminal kinase

(收稿日期：2015-01-05)

Corresponding author:YE Jun, ZHANG Jie, Email: pzxgrk@163.com

通信作者：葉軍，張潔，Email：pzxgrk@163.com

基金項(xiàng)目：上海市普陀區(qū)科委課題(2010PTKW004)