亞甲基四氫葉酸還原酶基因及甲硫氨酸合成酶基因多態(tài)性與口服葉酸治療高同型半胱氨酸血癥療效的關(guān)系研究

田丹丹，張程達(dá)，王連珂，葛夢潁，侯全亮，吳 越，李媛媛，張衛(wèi)東

450001 河南省鄭州市，鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計學(xué)教研室(田丹丹，王連珂，葛夢潁，侯全亮，吳越，李媛媛，張衛(wèi)東)；中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院(張程達(dá))

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·論著·

亞甲基四氫葉酸還原酶基因及甲硫氨酸合成酶基因多態(tài)性與口服葉酸治療高同型半胱氨酸血癥療效的關(guān)系研究

田丹丹，張程達(dá)，王連珂，葛夢潁，侯全亮，吳 越，李媛媛，張衛(wèi)東

450001 河南省鄭州市，鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計學(xué)教研室(田丹丹，王連珂，葛夢潁，侯全亮，吳越，李媛媛，張衛(wèi)東)；中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院(張程達(dá))

【摘要】目的分析亞甲基四氫葉酸還原酶基因(MTHFR)和甲硫氨酸合成酶基因(MTR)多態(tài)性與口服葉酸治療高同型半胱氨酸血癥(HHcy)療效的關(guān)系及基因與環(huán)境在治療效果中的交互作用。方法選取2014年6—9月于鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科檢查血漿同型半胱氨酸(Hcy)水平的住院HHcy患者515例為研究對象。常規(guī)治療基礎(chǔ)上給予口服葉酸(5 mg/d)治療90 d。治療中期(葉酸補充45 d)行第1次電話隨訪，治療結(jié)束(葉酸補充90 d)行第2次電話隨訪，督促患者遵循醫(yī)囑服藥，并在治療結(jié)束后到醫(yī)院復(fù)查血漿Hcy水平。按照復(fù)查血漿Hcy水平將患者分為失敗組(Hcy≥15.0 μmol/L)和成功組(Hcy<15.0 μmol/L)。收集患者的基線資料，選取MTHFR上2個單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點和MTR上1個SNP位點，分別為：rs1801133、rs1801131和rs1805087；采用Sequenom公司的時間飛行質(zhì)譜生物芯片系統(tǒng)(Mass Array系統(tǒng))檢測基因分型和等位基因，采用多因素降維法(MDR)分析基因-環(huán)境交互作用。結(jié)果隨訪結(jié)束后，剔除服藥依從性差或者失訪患者131例，剔除兩次服藥依從性均一般的患者125例，剩余259例。其中失敗組115例，成功組144例。失敗組患者糖尿病病史發(fā)生率、高血壓病史發(fā)生率、冠心病病史發(fā)生率、基線血漿Hcy水平均高于成功組(P<0.05)。成功組3個SNP位點的基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡(rs1801133：χ2=0.11，P=0.170；rs1801131：χ2=0.00，P=1.000；rs1805087：χ2=0.01，P=0.860)。單因素非條件Logistic回歸分析結(jié)果顯示，rs1801133位點的TT基因型、T等位基因，rs1801131位點的AC基因型、AC+CC基因型、C等位基因與葉酸治療HHcy療效有回歸關(guān)系(P<0.05)。MDR軟件結(jié)果顯示，最優(yōu)模型為高血壓病史、冠心病病史和rs1801133的三因素交互模型(P<0.05)。結(jié)論MTHFR rs1801133位點的TT基因型和等位基因T可增加葉酸治療HHcy失敗的風(fēng)險；rs1801131位點的AC基因型、AC+CC基因型和等位基因C可降低葉酸治療HHcy失敗的風(fēng)險。MTR rs1805087位點基因型及等位基因與葉酸治療HHcy療效無回歸關(guān)系。高血壓病史、冠心病病史、rs1801133位點對葉酸治療HHcy的療效具有交互作用。

【關(guān)鍵詞】高半胱氨酸；亞甲基四氫葉酸還原酶(NADPH)；5-甲基四氫葉酸-高半胱氨酸S-甲基轉(zhuǎn)移酶；基因多態(tài)性；葉酸；治療結(jié)果

田丹丹，張程達(dá)，王連珂，等.亞甲基四氫葉酸還原酶基因及甲硫氨酸合成酶基因多態(tài)性與口服葉酸治療高同型半胱氨酸血癥療效的關(guān)系研究[J].中國全科醫(yī)學(xué)，2016，19(12)：1396-1400，1407.[www.chinagp.net]

Tian DD,Zhang CD,Wang LK,et al.Relation between MTHFR and MTR gene polymorphisms and the efficacy of oral folic acid therapy for hyperhomocysteinemia[J].Chinese General Practice，2016，19(12)：1396-1400，1407.

高同型半胱氨酸血癥(hyperhomocysteinaemia，HHcy)指機體血漿中總同型半胱氨酸(tHcy)水平升高的狀態(tài)，即空腹血漿tHcy≥15.0 mol/L，中國人群HHcy患病率平均為27.5%，北方人群高達(dá)67.7%，明顯高于發(fā)達(dá)國家[1-2]。HHcy與冠心病、腦卒中以及不良妊娠結(jié)局等密切相關(guān)[3-5]，嚴(yán)重影響人類健康，因此將HHcy患者血漿同型半胱氨酸(Hcy)水平降至參考范圍(5.0～15.0 μmol/L)具有重要意義。

HHcy是基因與環(huán)境因素共同作用的結(jié)果，亞甲基四氫葉酸還原酶和甲硫氨酸合成酶是調(diào)節(jié)Hcy代謝的關(guān)鍵酶。亞甲基四氫葉酸還原酶基因(MTHFR)、甲硫氨酸合成酶基因(MTR)多態(tài)性不僅影響基線血漿Hcy水平[6-7]，而且影響葉酸降低血漿Hcy水平的效果[8-9]。然而尚未見探索MTHFR、MTR多態(tài)性與葉酸治療HHcy療效關(guān)系的研究。本研究組給予患者足夠劑量的葉酸治療后，仍有部分患者血漿Hcy水平高于參考范圍，因此本研究選取了MTHFR的rs1801133、rs1801131位點及MTR的rs1805087位點，從遺傳學(xué)角度與環(huán)境因素結(jié)合起來探討葉酸治療HHcy失敗的原因。

1對象與方法

1.1研究對象選取2014年6—9月于鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科檢查血漿Hcy水平的住院HHcy患者515例為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn)：Hcy≥15.0 μmol/L，自愿參加本研究且自愿接受90 d葉酸補充的患者。排除嚴(yán)重感染、肝腎功能不全、血液疾病、惡性腫瘤等患者且近2周有口服葉酸類藥物或干擾葉酸代謝類藥物(如甲氨蝶呤、苯妥英鈉等)者。本研究由鄭州大學(xué)生命科學(xué)倫理審查委員會批準(zhǔn)，患者本人或其親屬均簽署知情同意書。

本研究背景：

目前，我國高同型半胱氨酸血癥(HHcy)患病率高，且是冠心病、腦卒中等心腦血管疾病的獨立危險因素，同時還與出生缺陷、神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病、慢性腎臟病等疾病密切相關(guān)。口服葉酸可以有效降低血漿同型半胱氨酸(Hcy)水平，但給予充足劑量和較長時間的葉酸治療后，仍有部分患者Hcy水平未降至參考范圍(5.0～15.0 μmol/L)。亞甲基四氫葉酸還原酶和甲硫氨酸合成酶是調(diào)節(jié)Hcy代謝的關(guān)鍵酶。亞甲基四氨葉酸還原酶基因(MTHFR)和甲硫氨酸合成酶基因(MTR)位點突變時，可引起對應(yīng)酶活性降低，這不僅影響基線血漿Hcy水平，而且影響葉酸降低血漿Hcy水平的效果。因此，本文旨在從遺傳因素和環(huán)境因素方面來探討葉酸治療HHcy失敗的原因。

1.2研究方法

1.2.1基線情況調(diào)查調(diào)查問卷結(jié)合課題研究目的和實際開展情況編制。調(diào)查內(nèi)容包括：(1)一般人口學(xué)特征：年齡、性別、婚姻狀況等；(2)聯(lián)系方式：家庭住址、聯(lián)系電話；(3)生活習(xí)慣：吸煙(連續(xù)或累計吸煙6個月及以上每日至少吸1支煙定義為吸煙)、飲酒(過去12個月中飲用任意一種或多種酒包含白酒、啤酒、米酒或黃酒、葡萄酒達(dá)12次以上定義為飲酒)情況；(4)個人疾病史：糖尿病、高血壓、高脂血癥、腦卒中、冠心病病史；(5)實驗室檢查：患者在早晨空腹抽血，分離血漿，在醫(yī)院檢驗科生化檢查室檢測基線血漿Hcy水平。待醫(yī)院檢驗科檢測完生化指標(biāo)后，將剩余血液由冷鏈運送至課題組分子生物學(xué)實驗室，采用苯酚/氯仿法提取基因組DNA。

1.2.2治療方法、隨訪及分組患者除遵醫(yī)囑進行對癥治療外，又增加了口服葉酸(5 mg/d)補充治療90 d。治療中期(葉酸補充45 d)行第1次電話隨訪，治療結(jié)束(葉酸補充90 d)行第2次電話隨訪，督促患者遵循醫(yī)囑服藥，并在治療結(jié)束后到醫(yī)院復(fù)查血漿Hcy水平。在兩次隨訪中，分別調(diào)查患者的服藥依從性(好：遵循醫(yī)囑按時按量服藥；一般：每周漏服3次及以內(nèi)；差：每周漏服3次以上)。在第2次隨訪時詢問患者復(fù)查血漿Hcy水平情況。隨訪結(jié)束后，剔除服藥依從性差和一般(隨訪中任1次服藥依從性差和兩次服藥依從性均一般)或失訪(拒絕復(fù)查血漿Hcy水平及未完成治療)的患者。按照復(fù)查血漿Hcy水平將患者分為失敗組(Hcy≥15.0 μmol/L)和成功組(Hcy<15.0 μmol/L)。

1.2.3單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點的選擇及基因分型檢測SNP位點篩選滿足下列條件之一：(1)已報告對葉酸降低血漿Hcy水平有影響；(2)最小等位基因頻率(MAF)>0.05；(3)所在基因片段能夠引起功能性改變。本研究選取MTHFR上2個SNP位點和MTR上1個SNP位點，分別為：rs1801133、rs1801131和rs1805087。采用Sequenom公司的時間飛行質(zhì)譜生物芯片系統(tǒng)(Mass Array 系統(tǒng))檢測基因分型和等位基因。

2結(jié)果

2.1基線情況隨訪結(jié)束后，剔除服藥依從性差或失訪患者131例，剔除兩次服藥依從性均一般的患者125例，剩余259例。其中失敗組115例，成功組144例。兩組患者年齡、性別、婚姻狀況、吸煙率、飲酒率、高脂血癥病史發(fā)生率、腦卒中病史發(fā)生率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；失敗組患者糖尿病病史發(fā)生率、高血壓病史發(fā)生率、冠心病病史發(fā)生率、基線血漿Hcy水平均高于成功組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表1)。

2.2MTHFR、MTR多態(tài)性與葉酸治療HHcy療效的關(guān)系成功組3個SNP位點的基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡(rs1801133：χ2=0.11，P=0.170；rs1801131：χ2=0.00，P=1.000；rs1805087：χ2=0.01，P=0.860)。由于rs1801131位點的CC基因型和rs1805087位點的GG基因型頻率低，因此將rs1801131位點的AC基因型和CC基因型、rs1805087位點的AG基因型和GG基因型分別合并進行進一步分析。以治療結(jié)果(成功=1，失敗=2)為因變量，各位點的基因型(突變純合型=1，雜合型=2，野生型=3)及等位基因為自變量，進行單因素非條件Logistic回歸分析，結(jié)果顯示，rs1801133位點的TT基因型、T等位基因，rs1801131位點的AC基因型、AC+CC基因型、C等位基因與葉酸治療HHcy療效有回歸關(guān)系(P<0.05，見表2)。

2.3基因-環(huán)境交互作用將糖尿病病史(X1)、高血壓病史(X2)、冠心病病史(X3)(二分類變量)和3個SNP位點(rs1801133=X4,rs1801131=X5,rs1805087=X6)導(dǎo)入MDR軟件，結(jié)果顯示，最優(yōu)模型為高血壓病史、冠心病病史和rs1801133的三因素交互模型(P<0.05，見表3)。

表1　兩組患者基線資料比較

注：Hcy=同型半胱氨酸；a為t值

表2MTHFR、MTR的3個SNP位點與葉酸治療HHcy療效的單因素非條件Logistic回歸分析〔n(%)〕

Table 2Single-factor non-conditional Logistic regression analysis of the relationship between 3 SNPs of MTHFR and MTR and the efficacy of folic acid therapy for HHcy

SNP位點失敗組(n=115)成功組(n=144)χ2值P值OR值95%CIrs1801133 基因型 CC13(11.3)21(14.6)---- CT35(30.4)78(54.2)0.630.4290.73(0.33,1.61) TT67(58.3)45(31.2)4.910.0272.41(1.09,5.29) 等位基因 C61(26.5)120(41.7)---- T169(73.5)168(58.3)12.90<0.0011.98(1.36,2.88)rs1801131 基因型 AA101(87.8)100(69.4)---- AC13(11.3)40(27.8)11.220.0010.32(0.16,0.64) CC1(0.9)4(2.8)1.790.1810.25(0.03,2.25) AC+CC14(12.2)44(30.6)12.43<0.0010.32(0.16,0.61) 等位基因 A215(93.5)240(83.3)---- C15(6.5)48(16.7)12.32<0.0010.35(0.19,0.64)rs1805087 基因型 AA97(84.4)119(82.6)---- AG16(13.9)24(16.7)0.330.5660.82(0.41,1.63) GG2(1.7)1(0.7)0.570.4522.45(0.22,27.47) AG+GG18(15.7)25(17.4)0.140.7130.88(0.46,1.71) 等位基因 A210(91.3)262(91.0)---- G20(8.7)26(9.0)0.020.8950.96(0.52,1.77)

注：SNP=單核苷酸多態(tài)性；-為無此項

表3　基因-環(huán)境交互作用

注：X2=高血壓病史，X3=冠心病病史，X4=rs1801133

3討論

本研究結(jié)果顯示，失敗組患者糖尿病病史發(fā)生率、高血壓病史發(fā)生率、冠心病病史發(fā)生率、基線血漿Hcy水平均高于成功組，說明糖尿病病史、高血壓病史、冠心病病史及基線血漿Hcy水平均可影響葉酸治療HHcy的療效。血漿Hcy水平與糖尿病、高血壓、冠心病的發(fā)病風(fēng)險密切相關(guān)，患有糖尿病、高血壓、冠心病的患者基線血漿Hcy水平均明顯升高[10-11]。有研究發(fā)現(xiàn)，基線血漿Hcy水平越高，補充葉酸后其降低水平也越高[12-13]。但本研究結(jié)果顯示，基線血漿Hcy水平高的患者Hcy水平仍不易降低至參考范圍，這可能是由于基線血漿Hcy水平越高，就需要降低相對更大的幅度才能達(dá)到參考范圍。

本研究在給予HHcy患者足量的葉酸治療后發(fā)現(xiàn)，rs1801133位點的TT基因型、T等位基因與葉酸治療HHcy療效有回歸關(guān)系，TT基因型和等位基因T可增加葉酸治療HHcy失敗的風(fēng)險。既往研究表明，在給予葉酸以降低血漿Hcy水平時，尤其是在葉酸攝入量低的人群中，rs1801133位點的TT基因型者降低水平最高，即TT基因型攜帶者受益最大[14-15]。然而，本研究結(jié)果顯示，攜帶TT基因型和等位基因T的患者血漿Hcy水平降低至參考范圍的有效率低，這可能與攜帶該基因型患者的基線血漿Hcy水平高有關(guān)。Crider等[16]的研究表明，TT基因型患者的基線血漿Hcy水平明顯高于CC基因型患者，此結(jié)果不受葉酸劑量的影響?；€血漿Hcy水平會進一步影響葉酸降低Hcy水平的效果，當(dāng)調(diào)整基線血漿Hcy水平后，與CC基因型患者相比，TT基因型患者的Hcy水平降低效果有所減弱[9]。TT基因型患者基線血漿Hcy水平高且需要降低更大的程度才可以降低至參考范圍，因此攜帶TT基因型和等位基因T患者的有效率低。

研究顯示，MTHFR rs1801131位點的AC+CC基因型與基線血漿Hcy水平呈負(fù)相關(guān)，即患者攜帶AC+CC基因型時基線血漿Hcy水平明顯低于攜帶AA基因型時[6]。也有研究顯示，rs1801131位點與血漿Hcy水平無關(guān)，且對葉酸降低Hcy水平的效果無明顯影響[15,17]，這可能與MTHFR在不同種族、不同人群中的分布不同有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，rs1801131位點的AC基因型、AC+CC基因型、C等位基因與葉酸治療HHcy療效有回歸關(guān)系，提示rs1801131位點攜帶AC基因型、AC+CC基因型和等位基因C有利于患者血漿Hcy水平降低至參考范圍，表明rs1801131位點突變可降低葉酸治療HHcy失敗的風(fēng)險。

研究顯示，MTR rs1805087位點的AA基因型患者的基線血漿Hcy水平高于AG基因型[7]；在高葉酸飲食期間攜帶等位基因G的患者血漿Hcy水平降低程度高于AA基因型患者[8]。但在中國人群的研究顯示，rs1805087位點與基線血漿Hcy水平及葉酸治療后血漿Hcy水平無關(guān)，但尚不能排除該基因?qū)θ~酸治療HHcy療效的影響[9]。本研究結(jié)果顯示，rs1805087位點的各基因型及等位基因與葉酸治療HHcy療效無回歸關(guān)系。有研究表明，不同地區(qū)、不同種族人群的MTR rs1805087位點的基因型分布存在差異[18]，這可能是導(dǎo)致研究結(jié)果不一致的原因。另外，本研究樣本量較小，也可能對研究結(jié)果造成一定的影響。

Hcy代謝是多途徑、多因素參與的過程，Hcy水平不僅受機體內(nèi)葉酸水平的影響，還與生活方式、營養(yǎng)因素以及遺傳因素等有關(guān)[2]。由于上述影響因素的存在，可能會對葉酸治療HHcy的療效產(chǎn)生影響。因此，本研究利用MDR軟件將遺傳因素與環(huán)境因素聯(lián)合起來探討其對葉酸治療HHcy療效的影響，結(jié)果顯示，最優(yōu)模型是高血壓病史、冠心病病史和rs1801133的三因素交互模型，當(dāng)3個因素同時存在時，葉酸治療HHcy失敗的風(fēng)險是非上述組合人群的8.84倍。因此，采取措施將血壓控制在正常水平、積極治療冠心病均有助于提高葉酸治療HHcy的療效。

本研究對患者進行了3個月的葉酸治療及隨訪，失訪率較高，使失敗組和成功組的樣本量較低，因此需要進一步擴大樣本量，使研究結(jié)果更有說服力。

綜上所述，MTHFR rs1801133位點的TT基因型和T等位基因可增加葉酸治療HHcy失敗的風(fēng)險；rs1801131位點的AC基因型、AC+CC基因型和C等位基因可降低葉酸治療HHcy失敗的風(fēng)險；而MTR rs1805087位點的各基因型及等位基因與葉酸治療HHcy療效無回歸關(guān)系。當(dāng)患者同時患有高血壓、冠心病和攜帶rs1801133位點的TT基因型時葉酸治療HHcy失敗的風(fēng)險進一步增大。

作者貢獻(xiàn)：田丹丹進行試驗設(shè)計與實施、資料收集整理、撰寫論文、成文并對文章負(fù)責(zé)；王連珂、葛夢穎、侯全亮、吳越、李媛媛進行試驗實施、評估、資料收集；張程達(dá)、張衛(wèi)東進行試驗設(shè)計、質(zhì)量控制及審校。

本文無利益沖突。

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(本文編輯：崔麗紅)

Relation Between MTHFR and MTR Gene Polymorphisms and the Efficacy of Oral Folic Acid Therapy for Hyperhomocysteinemia

TIANDan-dan,ZHANGCheng-da,WANGLian-ke,etal.DepartmentofBiostatisticsandEpidemiology,CollegeofPublicHealth,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001,China

【Abstract】ObjectiveTo analyze the relationship between MTHFR and MTR gene polymorphisms and the efficacy of folic acid therapy for hyperhomocysteinemia (HHcy),and the effect of gene-environment interaction on its efficacy.Methods515 HHcy patients who had plasma Hcy level measured in the Department of Neurology in the Fifth Affiliated Hospital of Zhengzhou University from June to September 2014 were enrolled as subjects.The subjects were treated with oral folic acid (5 mg/d) for 90 days.The first and second phone interview was respectively conducted in the medium-term of folic acid treatment at 45 days and at the end of treatment at 90 days.During the period of therapy,patients were urged to follow doctor′s advice and determine plasma Hcy levels after folic acid treatment.According to post-treatment plasma Hcy levels,subjects were divided into the failure group with Hcy≥15.0 μmol/L and the success group with Hcy<15.0 μmol/L.We collected the baseline information of patients and selected two SNPs in MTHFR(rs1801133 and rs1801131) and one SNP in MTR(rs1805087).The three SNPs were genotyped by the time-of-flight mass spectrometry (Mass Array system) of Sequenom company.Multifactor dimensionality reduction (MDR) software was used to evaluate gene-environment interaction.ResultsAfter the follow-up,131 patients were excluded because of poor compliance or loss to follow-up and 125 patients were eliminated as compliance was general for two times,after which 259 patients remained.The success group and the failure group included 144 patients and 115 patients,respectively.The incidence of history of diabetes,hypertension and coronary heart disease and baseline plasma Hcy levels in the failure group were both higher than the success group (P<0.05).The genotype distribution of three SNPs in the success group accorded with Hardy-Weinberg equilibrium (rs1801133:χ2=0.11,P=0.170;rs1801131:χ2=0.00,P=1.000;rs1805087:χ2=0.01,P=0.860).Single-factor non-conditional Logistic regression analysis showed that MTHFR rs1801133 TT genotype and T allele and rs1801131 AC genotype,AC+CC genotype and C allele were associated with the efficacy of folic acid therapy for HHcy (P<0.05).Results from MDR software revealed that the optimal model was three-factor interaction model included history of hypertension,history of coronary heart disease and rs1801133 (P<0.05).ConclusionMTHFR rs1801133 TT genotype and T allele can increase the risk of the failure of folic acid therapy for HHcy.MTHFR rs1801131 AC genotype,AC+CC genotype and C allele can reduce the risk of the failure of folic acid therapy for HHcy.No association was found between MTR gene rs1805087 and the efficacy of folic acid therapy for HHcy.There is significant interaction among rs1801133,coronary heart disease and hypertension in the efficacy of folic acid therapy for HHcy.

【Key words】Homocysteine;Methylenetetrahydrofolate reductase (NADPH2);5-methyltetrahydrofolate-homocysteine s-methyltransferase;Gene polymorphisms;Folic acid；Treatment outcome

(收稿日期：2015-07-16；修回日期：2016-02-29)

【中圖分類號】R 333.6

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

doi：10.3969/j.issn.1007-9572.2016.12.009

通信作者：張衛(wèi)東，450001 河南省鄭州市，鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計學(xué)教研室；E-mail:imooni@163.com

基金項目：河南省科技發(fā)展計劃項目(132102310431)