純凈水對斑馬魚幼魚生長發(fā)育的影響

◎朱加進(jìn)，蔡 赫

（浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310000）

較其他模式生物，斑馬魚具有完整的器官和系統(tǒng)，且同人類基因組具有高達(dá)87%的同源性[1]，它的體積小、繁殖能力強、生長發(fā)育迅速、養(yǎng)殖成本低，可縮短藥物篩選實驗的周期、提高篩選效率，因此備受藥學(xué)研究者的青睞，如利用斑馬魚建立疾病模型、進(jìn)行藥物活性成分的高通量篩選等。在病理學(xué)方面，由于斑馬魚突變技術(shù)的研究發(fā)展，研究者們建立了斑馬魚遺傳圖譜，分析了有價值的突變體，發(fā)展了轉(zhuǎn)基因斑馬魚技術(shù)，這些都成為毒理學(xué)研究的優(yōu)良資源。目前，斑馬魚已被廣泛應(yīng)用于遺傳和發(fā)育毒理學(xué)、環(huán)境毒理學(xué)、病理毒理學(xué)、藥物毒理學(xué)等毒理學(xué)領(lǐng)域，并展現(xiàn)出其獨特的優(yōu)勢[2,3]。

水環(huán)境對斑馬魚的生長、發(fā)育及行為學(xué)方面有很大的影響，國際標(biāo)準(zhǔn)組織（ISO）已將斑馬魚推薦為河水毒性實驗魚種并制定了相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)（ISO 07346）。我國參照國際標(biāo)準(zhǔn)，于1991年出臺了國家標(biāo)準(zhǔn)《水質(zhì)物質(zhì)對淡水魚（斑馬魚）急性毒性測定方法》（GB/T 13267-1991），使用斑馬魚進(jìn)行水質(zhì)安全性的檢測已獲國內(nèi)外認(rèn)可并得到了廣泛應(yīng)用。

目前市場上的飲用水品牌琳瑯滿目，但從加工工藝來看，主要可分為天然水和純凈水兩類。天然水主要以地表的山、河、湖、泊和地下泉水為主要水源，經(jīng)過簡單的處理工藝，在去除原水中極少的雜質(zhì)和有害物質(zhì)的同時保存原水中對人體有益的礦物質(zhì)元素。純凈水主要以市政自來水為水源，經(jīng)過反滲透工藝在除去有害物質(zhì)的同時也基本完全去除各種礦物元素。飲用水中礦物離子對機體的重要性已有很多報道，但運用斑馬魚模型來研究飲用水中礦物元素對機體健康影響在國內(nèi)外還鮮有報道。因此，本研究采用斑馬魚模型，對水中礦物質(zhì)離子對機體生長發(fā)育的重要性作初步評價并從形態(tài)學(xué)角度探究純凈水對斑馬魚的致畸作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

斑馬魚受精卵由浙江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院提供，為野生AB型。

1.2 試劑及其配制

養(yǎng)魚用水配制：準(zhǔn)確稱取2.264 0 g NaCl，0.074 5 g KCl，0.405 1 g HEPES和0.266 4 g無水CaCl2，用蒸餾水于1 L容量瓶定容后用3 M NaOH調(diào)pH至7.2后備用。

4%甲基纖維素配制：準(zhǔn)備稱取4 g甲基纖維素于100 mL的熱水中攪拌溶解后于4 ℃冰箱中冷藏過夜后備用。

天然水及純凈水，均購于市場。

1.3 儀器

體式顯微鏡（奧林巴斯），心率血流測試系統(tǒng)（viewpoint公司）。

1.4 實驗方法

將野生AB型斑馬魚受精卵置于盛有養(yǎng)魚用水的培養(yǎng)皿中于28.5 ℃培養(yǎng)箱中孵化，2 dpf后用體式顯微鏡剔除發(fā)育異常的斑馬魚幼魚。本次試驗對象為3組水樣，分別為純凈水組，天然水組和正常對照組（養(yǎng)魚用水）。取六孔板，每孔吸入30尾2 dpf幼魚并分別加入10 mL的上述水樣，每組樣品一個復(fù)孔于28.5 ℃培養(yǎng)箱中孵化，24 h換液一次。

在5 dpf時從每組樣品中隨機挑選10尾魚用4 %甲基纖維素溶液固定后用體式顯微鏡和心率血流測試系統(tǒng)對斑馬魚幼魚生長發(fā)育（體長、身體側(cè)面投影、卵黃囊面積、眼大小和側(cè)翻率）及致畸性等指標(biāo)（脊柱彎曲、心率）進(jìn)行觀察分析。

1.5 數(shù)據(jù)處理

本文中數(shù)據(jù)均采用spss16.0進(jìn)行獨立t-檢驗分析，P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 純凈水對斑馬魚幼魚生長發(fā)育的影響

純凈水對斑馬魚幼魚生長發(fā)育的影響（見圖1）。

圖1 純凈水對斑馬魚幼魚生長發(fā)育的影響圖

如圖1所示，純凈水組斑馬魚的體長、身體側(cè)面投影、眼大小分別為：

（3.59±0.12）mm

（1.06±0.07）mm2

（0.24±0.02）mm2

均顯著低于天然水組的：

（3.72±0.14）mm

（1.15±0.05）mm2

（0.27±0.02）mm2

與正常對照組的：

（3.74±0.12）mm

（1.15±0.06）mm2

（0.26±0.02）mm2

卵黃囊面積純凈水組為（0.55±0.09）mm2，顯著高于天然水組的（0.41±0.09）mm2及正常對照組的（0.44±0.10）mm2。在上述指標(biāo)中，天然水組與正常對照組均無統(tǒng)計學(xué)差異。由此可見，與其他兩組相比，純凈水能顯著延緩斑馬魚幼魚的生長發(fā)育。

2.2 純凈水對斑馬魚的致畸性的研究結(jié)果

如圖2所示，純凈水組斑馬魚的心率為（126.6±8.54）bpm，顯著低于天然水組（141.6±5.56）bpm及正常對照組（142.4±5.94）bpm，天然水組與正常對照組無差異。

圖2 純凈水對斑馬魚心率的影響圖

如圖3所示，養(yǎng)殖在純凈水組中的斑馬魚幼魚有脊柱彎曲的現(xiàn)象。由此可知，純凈水對斑馬魚幼魚有明顯的致畸作用。

3 討論

礦物元素與機體健康有著重要的關(guān)系。鈣是人體必需的常量元素之一，它不僅是骨骼組成的主要構(gòu)成部分，在機體生長發(fā)育過程中也起著重要的作用[4]。Zemel[5]等人通過實驗發(fā)現(xiàn)降低細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度會抑制脂肪分解代謝進(jìn)而影響脂肪等物質(zhì)的吸收。除鈣外，鎂也是人體細(xì)胞內(nèi)重要的元素，黃永祥 等[6]研究表明鎂具有多種特殊的生理功能，它能激活體內(nèi)多種酶、抑制神經(jīng)異常興奮性、維持核酸的結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性、參與體內(nèi)蛋白質(zhì)的合成、肌肉收縮及體溫調(diào)節(jié)，同時鎂影響鉀、鈉、鈣離子細(xì)胞內(nèi)外移動的通道，并有維持生物膜電位的作用。

飲用天然水由其處理工藝的原因，在除去少量有害物質(zhì)的同時還保留了大部門對人體有益鈣、鎂元素和其他多種微量元素。水中礦物元素對機體健康的影響已有大量文獻(xiàn)報道，陳榮河 等[7]對3月齡的ICR小鼠進(jìn)行90 d的研究表明，長期飲用純凈水對小鼠的抗氧化酶及脂代謝指標(biāo)均有一定的影響。周宇紅 等[8]對小鼠進(jìn)行近4個月的跟蹤考察實驗，發(fā)現(xiàn)與飲用天然水相比，長期飲用純凈水會顯著延緩仔鼠的生長發(fā)育。胡啟之 等[9]對4月齡的ICR小鼠3個多月的跟蹤考察實驗也發(fā)現(xiàn)也發(fā)現(xiàn)長期飲用純凈水具有延遲仔鼠生長發(fā)育的趨勢。

以前的研究學(xué)者基本上是用大小鼠作為模式動物進(jìn)行礦物離子與機體健康的研究，但周期較長、成本高，本實驗運用考察周期更短的斑馬魚模型（考察周期僅為3 d）對水中礦物元素對機體健康的影響進(jìn)行研究。據(jù)本實驗可知，純凈水能延遲斑馬魚幼魚的生長發(fā)育，這與前人用大小鼠研究的結(jié)論“長期飲用純凈水具有延遲仔鼠生長發(fā)育”基本一致。

在本次實驗過程中發(fā)現(xiàn)，純凈水能顯著降低斑馬魚幼魚的心率并伴有脊柱彎曲等致畸現(xiàn)象出現(xiàn)，這可能與純凈水中缺乏鈣、鎂等礦物元素有關(guān)。有文獻(xiàn)表明，長期缺鈣可引起嬰兒出現(xiàn)佝僂病的危險，缺鎂可引起機體的心率失常[10,11]。由此可見，運用斑馬魚作為模式動物能在較短的時間內(nèi)更全面地評價純凈水對機體健康的影響。

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