UPLC-MS/MS法測(cè)定動(dòng)物源性食品中硝基呋喃代謝物殘留量

◎廖妍儼，龍四紅，孫 棣，陳 洪

（1.貴州省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院，貴州 貴陽(yáng) 550016；2.貴陽(yáng)市疾病預(yù)防控制中心，貴州 貴陽(yáng) 550002）

硝基呋喃類藥物是一種廣譜抗生素，對(duì)大多數(shù)真菌和原蟲等病原體具有殺滅作用。此類藥物主要作用于微生物酶系統(tǒng)，抑制微生物體內(nèi)乙酰輔酶A的生成、干擾其糖類的合成代謝，從而起到抑制病原菌生長(zhǎng)的作用[1]。研究表明，硝基呋喃類藥物在動(dòng)物體內(nèi)迅速分解產(chǎn)生代謝物，在弱酸性條件下，這些結(jié)合態(tài)代謝物可從蛋白質(zhì)中釋放出來，對(duì)人體造成危害[2,3]。因此，通過檢測(cè)動(dòng)物源性食品中硝基呋喃類藥物代謝物，能起到對(duì)此類藥物使用情況的監(jiān)控作用。

目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于硝基呋喃代謝物類藥物及其代謝物的檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法[4]、酶聯(lián)免疫法[5]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等，使用最多的是液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法。本研究旨在建立動(dòng)物源性食品中4種硝基呋喃代謝物的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法，并對(duì)樣品前處理方法、色譜條件、質(zhì)譜條件等進(jìn)行優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲醇、乙腈（色譜純、MERCK）；甲酸、冰醋酸（色譜純、Fisher Chemicals）；2-硝基苯甲醛（2-NBA、梯希愛）；二甲亞砜（DMSO、慧穎生物科技有限公司）；鹽酸（重慶川東化工集團(tuán)有限公司）；乙酸銨（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；乙酸乙酯（上海申博化工有限公司）；磷酸氫二鉀（成都金山化學(xué)試劑有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

ACCELA液 相 色 譜 儀（ 美 國(guó) Thermo）；TSQ QUANTUM ULTRA質(zhì)譜儀（美國(guó)Thermo)；自動(dòng)恒溫震蕩器（昆山市儀器有限公司）；固相萃取裝置W-SPE 24（萊伯泰科儀股份有限公司）；Allegra X-22系列多功能臺(tái)式高速離心機(jī)（美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司）。

1.3 方法

1.3.1 色譜和質(zhì)譜條件

Thermo Aquasil C18色譜柱（150 mm×2.1 mm×1.7μm）；流動(dòng)相A為含0.1%甲酸的乙腈，B為含0.1%甲酸水溶液；梯度洗脫程序：0～2 min，7%A；2.1～7 min，7%～85%A；7.1～10 min，7%A；流速：300μL/min；進(jìn)樣量：10μL；柱溫：常溫。

采用電噴霧離子源（ESI）；正離子掃描；掃描模式：選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（SRM）；噴霧電壓（IS）：3 000 V；離子源溫度：350 ℃；離子傳輸毛細(xì)管溫度：250 ℃；鞘氣壓力40 Arb，輔助氣流量10 Arb。

1.3.2 樣品前處理方法

精確稱取待測(cè)樣品2.00 g于50 mL離心管中，加入10 mL甲醇∶水混合溶液（2∶1，V/V），均質(zhì)器12 000 r/min均質(zhì)1 min，棄去上清液。再向離心管中加入5 ng混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液，使4種硝基呋喃代謝物內(nèi)標(biāo)物最終測(cè)定濃度為2.0 ng/mL。樣品溶液中加入10 mL 0.2 mol/L HCl，再加入200 μL衍生化試劑2-硝基苯甲醛（2-NBA）溶液，置于37 ℃恒溫水浴中振蕩16 h。樣品溶液取出后靜置至室溫，加入5 mL 0.1 mol/L磷酸氫二鉀溶液，經(jīng)離心機(jī)8 000 r/min離心5 min后，濾紙過濾，取濾液過固相萃取柱（HLB），樣品溶液全部通過固相萃取柱后用10 mL水洗滌，用5 mL乙酸乙酯洗脫，收集洗脫液于50 ℃下用氮?dú)獯蹈桑?0%的乙腈溶液溶解并定容至1.0 mL，混勻后過0.2 μm有機(jī)相濾膜，待測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理方法的優(yōu)化

國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中的方法直接用離心后的上清液過HLB小柱，因樣品勻漿均質(zhì)后成為漿狀，易在過柱時(shí)堵塞固相萃取小柱，且目標(biāo)物不宜洗脫，操作繁瑣，導(dǎo)致樣品回收率降低。因此本實(shí)驗(yàn)增加了濾紙過濾步驟，將全部衍生液過濾后再上柱，減少了過柱時(shí)間，提高了回收率。

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

針對(duì)畜禽肉樣品基質(zhì)復(fù)雜的特性，本實(shí)驗(yàn)采用選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（SRM）進(jìn)行掃描，其原理是針對(duì)二級(jí)質(zhì)譜或多級(jí)質(zhì)譜的某兩級(jí)之間，即母離子選一個(gè)離子碰撞后，從形成的子離子中也只選一個(gè)離子。因?yàn)閮纱味贾贿x單個(gè)離子，所以樣品中的噪音和干擾被排除得更多，有效提高方法的靈敏度和重現(xiàn)性。

2.3 線性范圍和檢出限

對(duì)4種硝基呋喃代謝物標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行檢測(cè)，線性范圍和檢出限見表1。

表1 線性范圍和檢出限表

2.4 樣品的測(cè)定

采用上述方法對(duì)購(gòu)自超市和農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)的16份樣品（豬肉和雞肉各8份）進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示有一個(gè)批次的豬肉檢測(cè)到有呋喃西林代謝物（SEM）存在，含量為4.7 μg/kg，其余樣品均未檢出硝基呋喃類代謝物。該方法穩(wěn)定性強(qiáng)、靈敏度高、重現(xiàn)性好，適用于對(duì)動(dòng)物源性食品中4種硝基呋喃類藥物代謝物殘留的同時(shí)檢測(cè)。

參考文獻(xiàn)：

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[2]孫言春，張 潔，牟振波，等.固相萃取液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物殘留研究[J].中國(guó)漁業(yè)質(zhì)量與標(biāo)準(zhǔn)，2011（2）：54-59.

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[4]宋 凱，肖桂英，姜 橋，等.高效液相色譜法同步測(cè)定飼料及獸藥中4種硝基呋喃類藥物[J].糧食與飼料工業(yè)，2010（3）：49-51.

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