一株植物乳桿菌體外抗氧化和耐藥性的研究

,,,,, , ,,*

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江哈爾濱 150030; 2.中墾華山牧乳業(yè)有限公司,陜西渭南 714019)

在氧化呼吸過程中會(huì)產(chǎn)生活性氧化代謝物(ROM),會(huì)損傷蛋白質(zhì)和核酸、氧化磷脂壁并改變低密度脂蛋白,過多的代謝物還會(huì)損傷細(xì)胞造成疾病,如動(dòng)脈粥樣硬化、關(guān)節(jié)炎、糖尿病、神經(jīng)退化性疾病、心血管疾病和癌癥[1-2]。為抵抗ROM,人體合成的抗氧化物酶和抗氧化物及食物中存在的抗氧化物一起形成了生物氧化劑的屏障。然而,在某些情況下,防御系統(tǒng)并不能保護(hù)機(jī)體不受到氧化應(yīng)激。因此,增加抗氧化防御力是維護(hù)人類健康和預(yù)防疾病的重要部分[3]。在這方面,人類開拓了一個(gè)新的領(lǐng)域,通過益生菌的活性去抵抗過氧化物造成的應(yīng)激。

聯(lián)合國糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織將益生菌定義為“當(dāng)達(dá)到一定數(shù)量時(shí),對(duì)宿主有益的活性微生物”[4]，其中乳桿菌和雙歧桿菌應(yīng)用最為廣泛,經(jīng)常有研究報(bào)道其具備的各種功能性[5]。盡管益生菌作用的分子機(jī)制還沒有完全闡明,但其調(diào)節(jié)腸道菌群,改善腸道上皮屏障功能的益生作用已經(jīng)眾所周知。起初,益生菌經(jīng)常用于調(diào)節(jié)和改善腸道菌群平衡[6],現(xiàn)在,選擇適當(dāng)?shù)囊嫔鷳?yīng)對(duì)特定的生理指標(biāo),開發(fā)益生菌新的益生特性已經(jīng)發(fā)展起來[7],比如預(yù)防和治療腹瀉、加強(qiáng)自身免疫和調(diào)節(jié)高膽固醇血癥等[8]。而鑒定益生菌的安全性是開發(fā)功能性菌株的前提,菌株安全性鑒定可以從多方面進(jìn)行,如生物胺的檢測(cè)、溶血檢測(cè)、靛基質(zhì)檢測(cè)等,本研究進(jìn)行的抗生素敏感性實(shí)驗(yàn)也是菌株安全性鑒定的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。

植物乳桿菌KLDS 1.0386分離自中國內(nèi)蒙古地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品,已有研究證明其具有良好的降膽固醇能力和腸胃耐受能力[9-12]。本實(shí)驗(yàn)通過7個(gè)體外抗氧化指標(biāo)研究KLDS 1.0386的抗氧化能力,并通過10種常用抗生素檢測(cè)其抗生素敏感性,為開發(fā)安全多功能益生菌和微生物制劑提供了數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

植物乳桿菌KLDS 1.0386(Lactobacillusplantarum) 由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。供試菌株在實(shí)驗(yàn)前需進(jìn)行復(fù)蘇與純化,經(jīng)MRS液體培養(yǎng)基,37 ℃培養(yǎng),連續(xù)傳代3次以恢復(fù)菌種活力用于后續(xù)實(shí)驗(yàn);酵母粉 OXOID公司;蛋白胨、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、酪蛋白胨、牛肉膏、氯化鈉、硫酸亞鐵、雙氧水、無水乙醇、三氯化鐵、鐵氰化鉀 奧博星生物技術(shù)公司;M17 海博生物技術(shù)有限公司;DPPH(1，1-苯基-2-三硝基苯肼)、鄰二氮菲、半胱氨酸、抗壞血酸、TBA(叔丁醇)、BHT(2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚)、氨芐西林、青霉素、亞胺培南、慶大霉素、紅霉素、四環(huán)素、萬古霉素、卡那霉素、林霉素、氯霉素 北京博奧拓達(dá)科技有限公司。

BCN1360型生物潔凈工作臺(tái) 北京東聯(lián)哈爾儀器公司;DHP-9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司;HVE-50全自動(dòng)高壓滅菌鍋 HIRAYAMA;PL 2002電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;GL-21M離心機(jī) 上海市離心機(jī)械研究所;生物顯微鏡 LEICA;DU 800紫外可見分光光度計(jì) 美國BECKMAN公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 MRS培養(yǎng)基 稱取蛋白胨5 g,牛肉膏5 g,胰蛋白胨10 g,乙酸鈉5 g,磷酸氫二鉀2 g,葡萄糖20 g,酵母粉5 g,硫酸錳0.25 g,硫酸鎂0.58 g,檸檬酸氫二胺2 g,吐溫-80 1 g,牛肉膏5 g,加蒸餾水定容至1000 mL,高壓滅菌(121 ℃,20 min)。

1.2.2 3種供試樣品的制備 將活化好的菌株37 ℃培養(yǎng)18 h,8000 r/min離心20 min,收集上清,即發(fā)酵上清液。

將活化好的菌株37 ℃培養(yǎng)18 h,8000 r/min離心20 min,用PBS沖洗兩遍,再次離心,收集菌體,重懸于PBS,使菌體濃度達(dá)到109CFU/mL,即細(xì)胞懸液。

菌體細(xì)胞破碎液的制備:參考Lin的方法[13],將菌懸液置于冰浴中,超聲破碎菌體細(xì)胞(超聲條件:800 W,超聲3 s,停8 s,持續(xù)15 min),顯微鏡下觀察無完整菌體,12000 r/min離心20 min,收集上清,即為菌體細(xì)胞破碎液。

1.2.3 過氧化氫耐受性的測(cè)定 將供試菌株在MRS培養(yǎng)基中按2%接菌量接入,再在培養(yǎng)基中加入過氧化氫溶液,使其濃度達(dá)到0、0.4、0.8、1.0 mmol/L,渦旋混勻,于37 ℃培養(yǎng)24 h,再次渦旋混勻,MRS液體培養(yǎng)基調(diào)零,600 nm波長(zhǎng)條件下測(cè)樣品吸光值[13]。

1.2.4 乳酸菌清除DPPH自由基能力的測(cè)定 在每種1 mL供試樣品中加入0.2 mmol/L DPPH·的無水乙醇1 mL,充分振蕩混勻,再在室溫下避光反應(yīng)30 min,6000 r/min離心10 min取上清,517 nm波長(zhǎng)條件下測(cè)定樣品吸光值(OD值)[13]。按照以下公式計(jì)算DPPH自由基的清除率:

DPPH·清除率(%)=[1-(樣品-空白)/對(duì)照]×100

式中,空白為用1 mL無水乙醇取代1 mL DPPH·反應(yīng)的吸光值;對(duì)照為PBS取代樣品反應(yīng)的吸光值,每組重復(fù)三次,取平均值。

1.2.5 乳酸菌清除羥自由基能力的測(cè)定 在反應(yīng)體系中加入1 mL 2.5 mmol/L的鄰菲羅啉,1 mL PBS(0.1 mol/L,pH7.2～7.4)和1 mL各供試樣品充分混勻,再加入1 mL 2.5 mmol/L的硫酸亞鐵,渦旋混勻,再加入1 mL 20 mmol/L的過氧化氫,37 ℃水浴1.5 h,在536 nm波長(zhǎng)下測(cè)定樣品吸光值[14]。按照下列公式計(jì)算乳酸菌清除羥自由基的能力:

羥自由基清除能力(%)=(樣品-空白)/(對(duì)照-空白)×100

式中,空白為1 mL去離子水替代1 mL樣品反應(yīng)的吸光值;對(duì)照為1 mL去離子水替代1 mL過氧化氫反應(yīng)的吸光值,每組重復(fù)三次,取平均值。

1.2.6 乳酸菌抗脂質(zhì)過氧化能力的測(cè)定 在反應(yīng)體系中加入1 mL亞油酸乳化液、0.5 mL PBS、0.2 mL 0.01%硫酸亞鐵和0.2 mL 0.01%維生素C,再加入0.5 mL各供試樣品,漩渦振蕩1 min,置于37 ℃下避光反應(yīng)12 h,再次漩渦混勻,取2 mL反應(yīng)液加入0.2 mL 0.4%三氯乙酸,2 mL 0.8%硫代巴比妥酸和0.2 mL 0.4% BHT,漩渦振蕩1 min,于沸水浴反應(yīng)30 min,待樣品冷卻后加入2 mL氯仿,4000 r/min離心10 min,收集上清,532 nm波長(zhǎng)條件下測(cè)定吸光值[14],按照下列公式計(jì)算乳酸菌抗脂質(zhì)過氧化能力:

抗脂質(zhì)過氧化能力(%)=(空白-樣品)/空白×100

式中,空白為PBS代替樣品反應(yīng)的吸光值。

1.2.7 乳酸菌還原能力的測(cè)定 在反應(yīng)體系中加入1 mL各供試樣品,1 mL 1%的鐵氰化鉀,1 mL PBS(0.1 mol/L,pH7.2～7.4),漩渦混勻,在50 ℃水浴反應(yīng)20 min后,冰浴或流水將樣品迅速冷卻,再加入1 mL 10%三氯乙酸,3000 r/min離心10 min,取2 mL上清液加入2 mL 0.1%的氯化鐵,反應(yīng)10 min,于700 nm波長(zhǎng)條件下測(cè)樣品吸光值,結(jié)果采用半胱氨酸作為陽性參照,將樣品吸光值換算成半胱氨酸還原力[13]。

1.2.8 超氧陰離子清除能力的測(cè)定 在2.8 mL pH為8.2的0.05 mol/L Tris-HCl中加入0.1 mL 0.05 mol/L的鄰苯三酚,0.1 mL各供試樣品,漩渦混勻,室溫避光反應(yīng)4 min,再加入1 mL 8 mol/L 鹽酸終止反應(yīng),于320 nm波長(zhǎng)條件下測(cè)定樣品吸光值[15],按照下列公式計(jì)算乳酸菌清除超氧陰離子能力:

超氧陰離子清除能力(%)=(1 - 樣品/空白)×100

式中,空白為去離子水代替樣品反應(yīng)的吸光值。

1.2.9 螯合金屬離子能力的測(cè)定 在1 mL各供試樣品中加入0.05 mL 2 mmol/L的氯化亞鐵,0.2 mL 2 mmol/L的菲咯嗪和2.75 mL去離子水,渦旋混勻,室溫下反應(yīng)10 min,562 nm波長(zhǎng)條件下測(cè)樣品吸光值[15],按照下列公式計(jì)算金屬離子螯合能力:

螯合力(%)=[1-(樣品 - 對(duì)照)/干擾]×100

式中,對(duì)照是去離子水代替樣品反應(yīng)的吸光值;干擾是去離子水代替氯化亞鐵反應(yīng)的吸光值。

1.2.10 抗生素敏感性檢測(cè) 在無菌環(huán)境中,將不同濃度的抗菌藥物溶液分別加到無菌的96孔板中,第1至第11孔加藥液,每孔10 μL,第12孔作為生長(zhǎng)對(duì)照不加藥液,此時(shí)各管藥物濃度依次為256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25 μg/mL,凍干后密封,-20 ℃保存?zhèn)溆?抗生素選擇見表1。將活化好的KLDS 1.0386按1%接種量接種于MRS培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)18 h,再將濃度相當(dāng)于0.5麥?zhǔn)媳葷岫?5×107CFU/mL)的菌懸液,經(jīng)MRS稀釋1000倍后,向每孔中加入100 μL,置于37 ℃培養(yǎng)24 h后,觀察菌株的生長(zhǎng)情況。以在小孔內(nèi)完全抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度為MIC(Minimum Inhibitory Concentration)。供試菌株對(duì)抗生素的敏感性以歐洲食品安全局(EFSA)關(guān)于細(xì)菌抗生素抗性的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定[16]。

表1 10種抗生素及分類Table 1 10 kinds of antibiotics and classification

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差來表示,采用SPSS 20.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,應(yīng)用單因素方差分析進(jìn)行多組數(shù)據(jù)之間的比較,數(shù)據(jù)上角字母不同為差異顯著(p<0.05),字母相同為差異不顯著(p>0.05)。

2 結(jié)果與討論

2.1 過氧化氫耐受性

過氧化氫作為羥自由基的前體參與氧化過程,是衡量菌體抗氧化能力的一個(gè)重要指標(biāo)。如圖1所示,植物乳桿菌接種之后在培養(yǎng)基中添加過氧化氫,使其達(dá)到不同梯度,過氧化氫的添加會(huì)抑制乳酸菌的生長(zhǎng)。隨著過氧化氫濃度的增加,乳酸菌生長(zhǎng)的適應(yīng)期明顯延長(zhǎng),這表明過氧化氫的出現(xiàn)對(duì)菌體細(xì)胞造成了氧化損傷。

圖1 植物乳桿菌KLDS 1.0386 過氧化氫耐受性Fig.1 Growth density of L. plantarum KLDS 1.0386 under oxidative stress

2.2 乳酸菌清除DPPH自由基能力

DPPH自由基的清除是應(yīng)用最廣泛的鑒定抗氧化能力的方法。這種方法基于抗氧化化合物(通常是酚類物質(zhì))對(duì)DPPH·的消耗。最常用評(píng)估DPPH·消耗的方法是采用分光光度計(jì)檢測(cè)反應(yīng)前后DPPH·的吸光值[17]。如表2所示,菌懸液的DPPH自由基清除率為46.10%,發(fā)酵上清液的清除率為45.07%,兩者之間不具有顯著差異(p>0.05),菌體細(xì)胞破碎液的DPPH自由基清除率為25.78%,低于菌懸液和發(fā)酵上清液,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。

2.3 乳酸菌清除羥自由基能力

羥自由基是一種活性氧化物質(zhì),其會(huì)導(dǎo)致脂質(zhì)和其他大量生物活性物質(zhì)過氧化,從而導(dǎo)致人體細(xì)胞的損傷[18]。如表2所示,在羥自由基清除率水平上,菌懸液(52.73%)>菌體細(xì)胞破碎液(31.50%)>發(fā)酵上清液(17.93%),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。

2.4 抗脂質(zhì)過氧化能力

亞油酸可以被水中所含的活性氧化物質(zhì)(ROS)所氧化,其發(fā)生的氧化反應(yīng)會(huì)產(chǎn)生變色,而抗氧化劑會(huì)減輕變色的程度[14]。如表2所示,在抗脂質(zhì)過氧化能力水平上,菌懸液(30.67%)>發(fā)酵上清液(20.03%)>菌體細(xì)胞破碎液(5.08%),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。

2.5 還原能力

在此方法中,抗氧化物與鐵氰化鉀,三氯乙酸和氯化鐵形成了一種彩色的復(fù)合物,反應(yīng)復(fù)合物吸光值增加表明抗氧化活性的增加,反映了樣品還原能力的程度[19]。如表2所示,在還原能力水平上,菌懸液(158.84 μmol/L)>菌體細(xì)胞破碎液(151.29 μmol/L)>發(fā)酵上清液(56.79 μmol/L),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。

2.6 超氧陰離子清除率

表2 植物乳桿菌KLDS 1.0386不同樣品抗氧化能力Table 2 Antioxidant activity of different samples of L. plantarum KLDS 1.0386

2.7 螯合金屬離子能力

過量的鐵會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞損傷,這是因?yàn)槠湓谧杂苫磻?yīng)的啟動(dòng)過程中起催化作用,所產(chǎn)生的氧自由基可能會(huì)破壞細(xì)胞脂質(zhì),核酸蛋白質(zhì)和碳水化合物等物質(zhì),其結(jié)果會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞功能和完整性的嚴(yán)重?fù)p傷[21]。如表2所示,在螯合金屬離子能力水平上,菌懸液(34.17%)>菌體細(xì)胞破碎液(15.60%)>發(fā)酵上清液(3.87%),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。

2.8 抗生素敏感性

按EFSA標(biāo)準(zhǔn),選取7大類10種抗生素對(duì)KLDS 1.0386進(jìn)行抗生素耐受性測(cè)試,如表3所示。評(píng)估作為食品或添加劑使用的細(xì)菌,菌株可以歸類為對(duì)抗生素敏感或耐藥。當(dāng)菌株被一定濃度的某種抗生素抑制,該濃度等于或低于已建立的截止值(S≤x mg/L)時(shí),該菌株被定義對(duì)該抗生素敏感(S);當(dāng)菌株不被一定濃度的某種抗生素抑制,該濃度高于已建立的截止值(S>x mg/L)時(shí),該菌株被定義為對(duì)該抗生素耐藥(R)[22]。

表3 抗生素對(duì)菌株KLDS 1.0386的MIC值結(jié)果(mg/L)Table 3 MIC value of the strain KLDS 1.0386 to antibiotics(mg/L)

KLDS 1.0386對(duì)氨芐西林和青霉素均表現(xiàn)出敏感(S),β-內(nèi)酰胺類抗生素的作用靶點(diǎn)是青霉素結(jié)合蛋白(PBPs),PBPs可以催化細(xì)胞壁合成的最后步驟。內(nèi)酰胺類抗生素抑制PBPs減少細(xì)胞壁交聯(lián),阻隔新細(xì)胞壁的生成,最后會(huì)導(dǎo)致青霉素誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。最常見抵抗青霉素的機(jī)制是讓青霉素酶失活,而在革蘭氏陽性菌中容易發(fā)現(xiàn)青霉素抑制劑的存在[23];KLDS 1.0386對(duì)碳青霉烯類抗生素亞胺培南表現(xiàn)出高度的敏感性(S),碳青霉烯類抗生素通常被認(rèn)為是治療嚴(yán)重感染的最后防線,其可以用于抑制對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素有抗性的細(xì)菌[24];KLDS 1.0386對(duì)萬古霉素表現(xiàn)出抗性(R),萬古霉素是一種用于治療革蘭氏陽性菌急性感染的抗生素,其可以抑制革蘭氏陽性菌肽聚糖的生物合成,阻止細(xì)菌萜醇的生物合成[25];KLDS 1.0386對(duì)慶大霉素體現(xiàn)出敏感(S),對(duì)卡那霉素體現(xiàn)出了抗性(R),氨基糖苷類抗生素采取主動(dòng)運(yùn)輸進(jìn)入細(xì)胞,抑制菌體細(xì)胞30s亞基核糖體蛋白質(zhì)合成,用于治療革蘭氏陰性菌造成的嚴(yán)重感染[26];KLDS 1.0386對(duì)于紅霉素和四環(huán)素的耐受性表現(xiàn)為敏感(S),對(duì)克林霉素和氯霉素具有耐藥性(R),蛋白質(zhì)生物合成抑制劑是最大的一類抗生素,占臨床使用率的一半以上,大環(huán)內(nèi)酯類、林可酰胺類和酰胺醇類抗生素的作用機(jī)制都是通過與核糖體50s亞基結(jié)合從而抑制菌體細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成,這三類抗生素具有良好的安全性[27-29]。

3 結(jié)論

對(duì)植物乳桿菌KLDS 1.0386的體外抗氧化性和抗生素敏感性進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果表明,隨著過氧化氫濃度的增加會(huì)抑制菌株的生產(chǎn),適應(yīng)期明顯延長(zhǎng);在羥自由基清除率、螯合金屬離子能力和還原能力水平上,菌懸液>菌體破碎液>發(fā)酵上清液;在抗脂質(zhì)過氧化能力和超氧陰離子清除率水平上,菌懸液>發(fā)酵上清液>菌體細(xì)胞破碎液;在DPPH自由基清除率水平上,菌懸液=發(fā)酵上清液>菌體細(xì)胞破碎液,總體來說,活體菌懸液的抗氧化性最佳,這可能是由于活性菌體表面具有一些活性物質(zhì),如蛋白質(zhì)、多糖和脂磷壁酸等,這與Li等[30]對(duì)植物乳桿菌和雙歧桿菌進(jìn)行抗氧化研究的結(jié)果類似。

在抗生素敏感性上,植物乳桿菌KLDS 1.0386對(duì)氨芐西林、青霉素、亞胺培南、慶大霉素、紅霉素和四環(huán)素表現(xiàn)出敏感(S);對(duì)萬古霉素、卡那霉素、克林霉素和氯霉素表現(xiàn)為耐受(R)。

抗生素敏感性實(shí)驗(yàn)為菌株安全性鑒定的一個(gè)重要環(huán)節(jié),所以在未來的研究中,我們可以對(duì)該菌株進(jìn)行體內(nèi)由氧化衰老造成的細(xì)胞損傷評(píng)價(jià)，并且從基因水平了解菌株的耐藥機(jī)制以及從體內(nèi)和體外多方面對(duì)此菌株安全性進(jìn)行鑒定,為開發(fā)一株安全可靠具有益生功能的菌株和微生物制劑提供有價(jià)值的參考。

[1]Firuzi O,Miri R,Tavakkoli M,et al. Antioxidant therapy:Current status and future prospects[J]. Current medicinal chemistry,2011,18(25):3871-3888.

[2]Babbs C F. Free radicals and the etiology of colon cancer[J]. Free Radical Biology and Medicine,1990,8(2):191-200.

[3]Serafini M,Del Rio D. Understanding the association between dietary antioxidants,redox status and disease:Is the Total Antioxidant Capacity the right tool?[J]. Redox Report,2013,9(3):145-152.

[4]Joint F. WHO Expert consultation on evaluation of health and nutritional properties of probiotics in food including powder milk with live lactic acid bacteria[J]. Crdoba,Argentina. October,2001,8(5):1-4.

[5]Amaretti A,di Nunzio M,Pompei A,et al. Antioxidant properties of potentially probiotic bacteria:invitroandinvivoactivities[J]. Applied Microbiology and Biotechnology,2013,97(2):809-817.

[6]Pompei A,Cordisco L,Amaretti A,et al. Folate Production by Bifidobacteria as a Potential Probiotic Property[J]. Applied and Environmental Microbiology,2006,73(1):179-185.

[7]Guandalini S. Probiotics for prevention and treatment of diarrhea[J]. Journal of Clinical Gastroenterology,2011,45:S149-S153.

[8]Finch J,Munhutu M N,Whitaker-Worth D L. Atopic dermatitis and nutrition[J]. Clinics in Dermatology,2010,28(6):605-614.

[9]唐雅茹,國立東,王娜娜,等. 產(chǎn)膽酸鹽水解酶乳酸菌的鑒定及其生物信息分析[J]. 食品工業(yè),2016(4):184-187.

[10]唐雅茹,李柏良,李婉,等. 膽鹽水解酶基因在植物乳桿菌KLDS1.0386中的表達(dá)研究[J]. 現(xiàn)代食品科技,2016(7):79-84.

[11]唐雅茹,于上富,國立東,等. 一株產(chǎn)膽鹽水解酶植物乳桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化[J]. 食品工業(yè)科技,2016(4):232-235.

[12]唐雅茹,于上富,國立東,等. 一株降膽固醇乳桿菌的篩選及其益生作用的研究[J]. 食品工業(yè)科技,2016(1):142-144.

[13]Lin M,Yen C. Antioxidative Ability of Lactic Acid Bacteria[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,1999,47(4):1460-1466.

[14]Alam M N,Bristi N J,Rafiquzzaman M. Review oninvivoandinvitromethods evaluation of antioxidant activity[J]. Saudi Pharmaceutical Journal,2013,21(2):143-152.

[15]Tang W,Xing Z,Li C,et al. Molecular mechanisms andinvitroantioxidant effects of Lactobacillus plantarum MA2[J]. Food Chemistry,2017,221(7):1642-1649.

[16]Scientific Opinion on the maintenance of the list of QPS biological agents intentionally added to food and feed(2011 update)[J]. EFSA Journal,2011,9(12):2497.

[17]Oliveira G K F,Tormin T F,Sousa R M F,et al. Batch-injection analysis with amperometric detection of the DPPH radical for evaluation of antioxidant capacity[J]. Food Chemistry,2016,192(2):691-697.

[18]Hazra B,Biswas S,Mandal N. Antioxidant and free radical scavenging activity of Spondias pinnata[J]. BMC complementary and Alternative Medicine,2008,8(1):63.

[19]Jayaprakasha G K,Singh R P,Sakariah K K. Antioxidant activity of grape seed(Vitisvinifera)extracts on peroxidation modelsinvitro[J]. Food Chemistry,2001,73(3):285-290.

[20]Campos Chiste R,Freitas M,Zerlotti Mercadante A,et al. Superoxide Anion Radical:Generation and Detection in Cellular and Non-Cellular Systems[J]. Current medicinal chemistry,2015,22(37):4234-4256.

[21]Oboh G,Puntel R L,Rocha J B T. Hot pepper(Capsicum annuum,Tepin and Capsicum chinese,Habanero)prevents Fe2+-induced lipid peroxidation in brain -invitro[J]. Food Chemistry,2007,102(1):178-185.

[22]趙婷,姚粟,徐友強(qiáng),等. 歐洲食品安全局(EFSA)細(xì)菌耐藥性評(píng)估概述[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè),2014(10):162-167.

[23]Berger-B Chi B. Resistance mechanisms of Gram-positive bacteria[J]. International Journal of Medical Microbiology,2002,292(1):27-35.

[24]Dalmolin T V,Bianchini B V,Rossi G G,et al. Detection and analysis of different interactions between resistance mechanisms and carbapenems in clinical isolates of Klebsiella pneumoniae[J].Brazilian Journal of Microbiology,2017,48(3):493-498.

[25]Singh M,Chang J,Coffman L,et al. Hidden Mode of Action of Glycopeptide Antibiotics:Inhibition of Wall Teichoic Acid Biosynthesis[J]. The Journal of Physical Chemistry B,2017,121(16):3925-3932.

[26]Ngo H X,Garneau-Tsodikova S. Flipping the Switch "On" for Aminoglycoside-Resistance Enzymes:The Mechanism Is Finally Revealed![J]. Structure,2016,24(7):1011-1013.

[27]Gaillard T,Dormoi J,Madamet M,et al. Macrolides and associated antibiotics based on similar mechanism of action like lincosamides in malaria[J]. Malaria Journal,2016,15(1):85.

[28]Schwarz S,Shen J,Kadlec K,et al. Lincosamides,Streptogramins,Phenicols,and Pleuromutilins:Mode of Action and Mechanisms of Resistance[J]. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine,2016,6(11):a27037.

[29]Bougas A,Vlachogiannis I A,Gatos D,et al. Dual effect of chloramphenicol peptides on ribosome inhibition[J]. Amino Acids,2017,49(5):995-1004.

[30]Li X. Improved pyrogallol autoxidation method:a reliable and cheap superoxide-scavenging assay suitable for all antioxidants[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2012,60(25):6418-6424.